离子与药物对离体蛙心活动的影响
Effects of Several Drugs and Extracellular Ions on Isolated Toad Heart
[摘要]目的 学习Straub氏法灌流蟾蜍离体心脏方法，研究离子和药物对离体蛙心活动的影响以及作用机制。方法 制备离体蛙心标本，采用Straub氏法完成蛙心插管，分别灌流低钙、高钙、高钾溶液，肾上腺素以及普萘洛尔、乙酰胆碱以及阿托品，用张力换能器和RM6240生物信号采集处理系统描记心搏曲线并测量记录 数据。 结果：无钙任氏液灌流，心脏舒张末期张力增大，而收缩末期张力明显减小，心率无显著改变；高钙任氏夜灌流，心脏舒张末期张力减小，而收缩期张力明显增大，心率无明显改变；高钾任氏夜灌流，心脏舒张末期张力增大，而收缩期张力明显减小，心率无明显改变；灌流液中加Ach，心脏舒张末期张力增大，收缩末期张力减小，心率减慢；加入Ach后滴加atp，心脏舒张末期张力变小，收缩期张力变大，心率无显著改变；灌流液中加入Adr，心脏舒张期张力减小，收缩期张力增大，心率无明显改变；Pro处理后加入Adr，心脏收缩末期张力减小，舒张末期张力和心率无显著改变。结论 细胞外Ca2+浓度增大，心肌的收缩性明显增强；细胞外K+浓度升高，心肌收缩力明显减弱；乙酰胆碱使心脏收缩性减弱，阿托品可拮抗乙酰胆碱减弱心肌收缩性的作用；肾上腺素使心脏收缩增强，普萘洛尔可拮抗肾上腺素加强心脏收缩性的作用。
[关键词] 蟾蜍离体心脏灌流 K+ Ca2+ 肾上腺素 乙酰胆碱
作为蛙心起搏点的静脉窦能按一定节律自动产生兴奋，因此，只要将离体的蛙心保持在适宜的环境中，在一定时间内仍能产生节律性兴奋和收缩活动。心脏正常的节律性活动需要一个适宜的理化环境，离体心脏也是如此，离体心脏脱离了机体的神经支配和全身体液因素的直接影响，可以通过改变灌流液的某些成分，观察其对心脏活动的作用。心肌细胞的自律性、兴奋性、传导性和收缩性，都与钠、钾及钙等离子有关。血钾浓度过高时(高于7.9mmol/L)，心肌兴奋性、自律性、传导性、收缩性都下降，表现为收缩力减弱、心动过缓和传导阻滞，严重时心脏可停搏于舒张期。血钙浓度升高时，心肌收缩力增强，过高可使心室停搏于收缩期。血钙浓度降低，心肌收缩力减弱。血中钠离子浓度的轻微变化，对心肌影响不明显，只有发生明显变化时，才会影响心肌的生理特性。肾上腺素可使心率加快、传导加快和心肌收缩力增强，乙酰胆碱则与肾上腺素的作用相反。【1】心脏的正常节律性活动需要一个适宜的内环境，内环境的变化直接影响着心脏的正常活动。本实验在蛙心的灌流液内人为地加入一些离子和药物从而改变心脏活动的内环境，观察心脏活动有何变化。
1．材料和方法
1.1实验动物（laboratory animal) 蟾蜍（中华蟾蜍指名亚种，Zhuoshan Toad）
1.2药品与试剂 肾上腺素（ adrenaline hydrochloride）,乙酰胆碱（ acetylcholine chloride ），普萘洛尔（propranolol hydrochloride ）,阿托品（atropine sulfate ），氯化钾，氯化钙，任氏液（Ringer’s solution）。
1.3 仪器和装置 RM6240多道生理信号采集处理系统(成都仪器厂），JZJ01张力换能器(成都仪器厂）。
1.4 仪器连接和参数 张力换能器接RM6240多道生理信号采集处理系统第1通道, RM6240多道生理信号采集处理系统采样频率：800Hz，时间常数：直流，滤波：30Hz，灵敏度：7.5g。
1.5 离体蟾蜍心脏标本制备 蟾蜍毁脑脊髓，蟾蜍仰卧于蛙板，打开蟾蜍胸腔，暴露心脏，结扎下腔静脉，靠头端结扎左主动脉，在左、右主动脉下穿线，在左主动脉根部剪一斜口，将插管插入动脉圆锥， 在心室收缩时将插管插入心室，结扎固定，游离心脏。
1.6 心脏与换能器连接 将蛙心插管固定在夹具上，蛙心夹连线通过滑轮连至张力换能器。
蛙心夹在心室舒张期夹住心尖，调节微调使心脏舒张期至1g。
1.7数据统计分析 测量各项处理前后的心率（heart rate，HR)、心脏舒张末张力（end diastolic tension，EDT) 、心脏收缩末期张力(end systolic tension，EST)。结果以`x ± s 表示，统计采用Student t test方法。
2观察项目
2.1正常的心搏曲线： 向插管中加入1ml任氏液，心搏曲线稳定后记录正常的心搏曲线45s。
2.2无钙任氏液灌流：无钙任氏液1ml替换插管内的任氏液，心搏曲线稳定后记录45s。
2.3高钙任氏夜灌流： 用任氏液洗脱3次，加入1ml任氏液，待曲线稳定45s后，向灌流液中加 0.045M CaCl2溶液25ml，心搏曲线稳定后记录45s 。
2.4高钾任氏夜灌流：用任氏液洗脱数次，曲线基本恢复后，加入1ml任氏液，待曲线稳定45s后，在任氏液中加 0.2M KCl溶液25ml，心搏曲线稳定后记录45s 。
2.5 Ach以及atr灌流：用新鲜任氏液换洗数次，加入1ml任氏液，待曲线稳定后记录45s ，在任氏液中加6×10-6 M 的 acetylcholine （ACh）溶液10ml，心搏曲线稳定后记录45s 。再加2×10 –4 M atropine（Atr）10 ml，心搏曲线稳定后记录45s 。
2.6 adrenalin灌流：用任氏液洗脱数次，曲线基本恢复后，加入1ml任氏液，待曲线稳定45s后，在任氏液中加6×10-5 M 的 adrenaline（Adr）溶液10ml，心搏曲线稳定后记录45s 。
2.7 propranolo以及Adr灌流：用任氏液洗脱数次，收缩曲线基本恢复后，加入1ml任氏液，待曲线稳定45s后，在任氏液中加5×10-4 M propranolol（Pro）溶液10ml，心搏曲线稳定后记录45s ，再加入6×10-5 M 的 Adr 溶液10ml，心搏曲线稳定后记录45s 。
3.结果
3.1低钙对心脏活动的影响 无钙任氏液灌流的心脏舒张末期张力为1.09±0.26g 大于正常任氏液灌流的心脏舒张末期张力0.89±0.11 g （ p < 0.05）；低钙任氏液灌流心脏收缩末期张力为2.08±0.81 g 显著小于正常任氏液灌流心脏收缩末期张力6.20±3.29 g（ p <0.01)；低钙任氏液灌流心脏的心率为30.00±4.00bpm，正常对照组心率为29.00±4.00bmp（p>0.05）无统计学差异。见表1
表1无钙任氏夜对离体蛙心活动的影响（n=8）
Table 1 Effect of Ca2+ -free Ringer’s solution on isolated toad heart（n=8）
#p<0.05 VS control EDT, *p<0.01 VS control EST
3.2高钙对心脏活动的影响 高钙任氏液灌流的心脏舒张末期张力0.81±0.40g 小于正常任氏液灌流的心脏舒张末期张力0.94±0.40 g （ p < 0.01）；高钙任氏液灌流心脏收缩末期张力的8.25±3.16 g 显著大于正常任氏液灌流心脏收缩末期张力5.39±2.70 g（ p <0.01)；高钙任氏液灌流心脏的心率为29.00±3.00bpm，正常对照组心率为29.00±4.00bmp（p>0.05）无统计学差异。见表2
表2高钙任氏夜对离体蛙心活动的影响（n=9）
Table 2 Effect of Ca2+ 22×10-4M Ringer’s solution on isolated toad heart（n=9）
#p<0.01 VS control EDT, *p<0.01 VS control EST
3.3高钾对心脏活动的影响 高钾溶液灌流的心脏舒张末期张力1.11±0.36g 大于正常任氏液灌流的心脏舒张末期张力0.88±0.35 g （ p < 0.01）；高钾任氏液灌流心脏收缩末期张力的2.28±1.74 g 显著小于正常任氏液灌流心脏收缩末期张力5.41±3.01 g（ p <0.01)；高钾任氏液灌流心脏的心率为28.00±4.00bpm，正常对照组心率为30.00±4.00bmp（p>0.05）无统计学差异。见表3
表3 高钾溶液对离体蛙心活动的影响（n=9）
Table 3 Effect of K+ 69×10-4M Ringer’s solution on isolated toad heart（n=9）
#p<0.01 VS control EDT, *p<0.01 VS control EST
3.4 乙酰胆碱以及阿托品对心脏活动的影响
3.4.1Ach任氏夜灌流的心脏舒张末期张力1.11±0.44g 大于正常任氏液灌流的心脏舒张末期张力0.93±0.32 g （ p < 0.05）；Ach任氏夜灌流心脏收缩末期张力的1.94±0.81g 小于正常任氏液灌流心脏收缩末期张力4.14±2.42g（ p <0.01)；Ach任氏液灌流心脏的心率为24.00±5.00bpm小于正常对照组心率为26.00±6.00bmp（p<0.05） 见表4;
3.4.2加入阿托品后，心脏舒张末期张力为0.88±0.40g小于加atr之前的心脏舒张末期张力1.10±0.45g（p<0.01），加入阿托品后心脏收缩末期张力4.82±3.09g大于加atr之前心脏收缩末期张力2.02±0.80g（p<0.05）, 加入阿托品后心率为25.00±3.00bmp，加atr之前心率为24.00±5.00bmp，（p>0.05）无统计学差异。见表5
表4 乙酰胆碱对离体蛙心活动的影响（n=9）
Table 4 Effect of Ach on isolated toad heart（n=9）
#p<0.05 VS control EDT, *p<0.01 VS control EST，##p<0.05 VS control HR
表5 乙酰胆碱+阿托品对离体蛙心活动的影响（n=9）
Table 5 Effect of Ach+atr on isolated toad heart（n=9）
#p<0.01 VS control EDT, *p<0.05 VS control EST
3.5 肾上腺素以及普萘洛尔灌流对心脏活动的影响
3.5.1 肾上腺素加药后的心脏舒张末期张力0.69±0.27g 小于加药前的心脏舒张末期张力0.87±0.36 g （ p < 0.05）；肾上腺素加药后心脏收缩末期张力的10.88±3.99g 显著大于加药前心脏收缩末期张力4.43±2.46g（ p <0.01)；肾上腺素加药后心脏的心率为27.00±4.00bpm，加药前心率为26.00±5.00bmp（p>0.05）无显著性差异。见表6
表6 肾上腺素对离体蟾蜍心脏活动的影响（n=9）
Table 6 Effect of Adrenalineon isolated toad heart（n=9）
#p<0.01 VS control EDT, **p<0.05 VS control EST
3.5.2普萘洛尔加药后心脏收缩末期张力为2.53±1.48g，小于pro加药前的心脏收缩末期张力2.85±1.56g（p<0.05），普萘洛尔加药后心率为25.00±5.00bmp，小于pro加药前的心率28.00±5.00g（p<0.05），普萘洛尔加药后心脏舒张末期张力为0.82±0.26g，加药前的心脏舒张末期张力为0.79±0.28，（p>0.05）故无统计学差异。见表7
表7 普萘洛尔对心脏活动的影响（n=9）
Table7 Effect of pro on isolated toad heart（n=9）
#p<0.05 VS control EST, *p<0.05 VS control HR
3.5.3普萘洛尔处理后，加Adr心脏收缩末期张力为2.18±1.18g，小于加Adr前2.56±1.56g（p<0.05）；加Adr后心脏舒张末期张力0.82±0.22g，加Adr前为0.81±0.26；加Adr后心率为24.00±5.00bmp，加Adr前心率为26.00±5.00bmp.见表8
表8 普萘洛尔+肾上腺素对心脏活动的影响（n=9）
Table 8 Effect of pro+Adr on isolated toad heart（n=9）
#p<0.05 VS control EST
3.6各项处理对蟾蜍离体心脏活动的影响，见图1，2，3
高钙任氏夜灌流，细胞外Ca2+浓度增大，心肌的收缩性明显增强；而高钾任氏夜灌流，细胞外K+浓度升高，心肌收缩力明显减弱；乙酰胆碱使心脏收缩性减弱，阿托品可拮抗乙酰胆碱对心脏的作用；肾上腺素使心脏收缩增强，普萘洛尔可拮抗肾上腺素对心脏的作用。
4.讨论
4.1细胞外液Ca2+浓度升高可引起心肌收缩力增强。与骨骼肌细胞不同，心肌细胞的肌质网不发达，贮Ca2+量少。因此，在收缩过程中对细胞外液Ca2+有较强的依赖性。在心肌动作电位平台期，细胞外Ca2+的内流，使胞质内的Ca2+浓度升高，从而触发心肌收缩。这种由少量Ca2+的内流引起细胞内Ca2+库释放大量Ca2+的过程，称钙触发钙释放.[2] 所以当细胞外液高Ca2+时，有利于平台期Ca2+内流，与肌钙蛋白的结合数量增加，心肌收缩力增加。另外若胞浆钙浓度持续升高时，则钙与肌钙蛋白结合后不易解离，心肌处于持续收缩状态而形成钙僵直。
4.2细胞外液K+浓度升高可引起心肌收缩力减弱。高钾对心肌收缩功能有抑制作用。因为细胞外的K＋和Ca2＋在细胞膜上有竞争性抑制；因此当膜外K＋的浓度升高时，平台期内流的Ca2＋减少，细胞内钙与肌钙蛋白结合的量也减少，进而减小了心肌的兴奋－收缩偶联作用，从而减弱了心肌收缩能力。
4.3乙酰胆碱可引起心脏收缩力减弱，心率减慢。乙酰胆碱能与心肌细胞膜上的M型的胆碱能受体结合，从而使腺苷酸环化酶抑制，细胞内的cAMP浓度降低，肌浆网释放Ca2＋减少，心肌的收缩力减弱。另一方面，乙酰胆碱还可使心肌细胞膜K+通道开放增加，故在心肌细胞复极期K+外流增加，复极化2，3期时程缩短，Ca2＋内流减少，导致心肌收缩力减弱。对于窦房结细胞，由于复极时K外流增加，进而最大复极电位水平升高，窦房结细胞自律性降低，导致心率减慢。[3]
阿托品是乙酰胆碱的拮抗剂，可竞争性的抑制乙酰胆碱对M胆碱受体的激动作用，从而减弱或者逆转乙酰胆碱对心脏的负性作用。
4.4肾上腺素可引起心肌收缩力增强。肾上腺素与心肌细胞膜上的β1肾上腺素能受体结合，从而激活腺苷酸环化酶，使细胞内cAMP的浓度升高，进而激活蛋白激酶和细胞内蛋白质的磷酸化过程，使心肌细胞膜上的钙通道激活，动作电位平台期Ca2＋的内流增加，肌浆网释放Ca2＋也增加，从而使心肌收缩能力增强。[3]
普萘洛尔为β肾上腺素受体阻断药，抑制肾上腺素对心肌的β受体结合,从而减慢心率,抑制心脏收缩力。
4.5肾上腺素与高钙任氏夜均可使心肌收缩力增强，但是两者之间仍有区别。细胞外液高Ca2+，引起心肌收缩增强，但是若胞浆Ca2+浓度持续升高时，Ca2+与肌钙蛋白结合后不解离，心肌处于持续收缩状态而易形成钙僵直；肾上腺素不仅可以增强心肌收缩，也可促进钙泵活动，降低肌浆中Ca2+浓度，促进Ca2+与肌钙蛋白的解离，使心肌舒张完全。
4.6在各项实验中，蛙心插管内灌流液的液面高度应始终保持一致，保证心脏固定的后负荷，以排出实验干扰因素。
4.7在进行蟾蜍离体心脏插管时，不可过于用力，找准位置再进行插管，尽量避免损伤瓣膜造成实验误差；插管过程应尽量快速，准确的完成，以保证离体心脏的活性。
5.参考文献
[1]陆源 夏强 《生理科学实验教程》 20##年8月第一版 浙大出版社 p267
[2]姚泰 《生理学》 20##年11月第六版 人民卫生出版社 p89
[3]陈季强 《各论》上册 20##年6月第二版 科学出版社 p262-263