生物化学实验报告
蛋白质浓度的测定（Folin-酚试剂法）
刘欣怡 201100140057
20##级生物基地班
周一下午 同组者：刘艺
20##年3月11号
一、实验目的
1、学习分光光度计的原理和使用方法。
2、熟悉并掌握福林（Folin）—酚法测定蛋白质浓度的原理和方法。
3、进一步掌握比色法或分光光度法，准确测定未知样品。
4、学习并掌握移液枪的使用方法。
5、学会绘制标准曲线图。
二、实验器材
（一）材料
血清（使用前稀释200倍）
（二）试剂
1、 标准酪蛋白溶液：200μg/ml。
2、 Folin-酚试剂甲液：（碱性铜溶液）
A液：4%Na2CO3：0.2M NaOH=1:1
B液：1%CuSO4：2%酒石酸钠=1:1
临用时，按甲：乙=50：1混合使用。混合后的溶液一日内有效，即现用现配。
3、 Folin-酚试剂乙液：
将100g钨酸钠、25g钼酸钠、700ml蒸馏水、50ml85%磷酸以及100ml浓盐酸置于1500ml的磨口圆底烧瓶中，充分混匀后，接上磨口冷凝管，回流10小时。再加入硫酸锂150g，蒸馏水50ml及液溴数滴，开口煮沸15分钟，在通风橱内驱除过量的溴。冷却，稀释至1000ml，过滤，滤液成微绿色，贮于棕色瓶中。临用时，用标准氢氧化钠溶液滴定，用酚酞作指示剂（由于试剂微绿，影响滴定终点的观察，可以将试剂稀释100倍再滴定）。根据滴定结果，将试剂稀释至相当于1mol/L的酸（稀释一倍左右）。贮于冰箱中可以长期保存。
本实验中使用的Folin-酚试剂乙液是原液：水为1:1，而且，老师已经配制好了。
4、 去离子水。
（三）器具
试管及试管架、移液枪以及塑料枪头、722型分光光度计、烧杯、标签纸等。
三、实验原理
蛋白质或多肽分子中有带酚基酪氨酸或色氨酸，在碱性条件下，可使酚试剂中的磷钼酸化合物还原成蓝色（生成钼蓝和钨蓝化合物）。蓝色的深浅与蛋白质的含量成正比，可用比色法测定
蛋白质浓度从它们的物理化学性质，如折射率，比重，紫外吸收测定而得知，或化学方法，如定氮，双缩脲反应。Folin—酚法是一般实验室中经常使用的方法。Folin—酚法是双缩脲法的发展，反应的第一步涉及碱性溶液中铜一蛋白质复合物的形成，然后这个复合物去还磷钼酸—磷钨酸试剂（Folin试剂），产生深蓝色（钼蓝和钨蓝混合物）。Folin—酚法灵敏度高，较双缩脲法灵敏100倍。
Folin—酚试剂法最早由Lowry确定了蛋白质浓度测定的基本步骤。以后在生物化学领域得到广泛的应用。这个测定法的优点是灵敏度高，比双缩脲法灵敏得多。缺点是费时间较长，要精确控制操作时间，标准曲线也不是严格的直线形式，且专一性较差，干扰物质较多。所测蛋白质样品中若含酚类及柠檬酸均有干扰作用，浓度较低的尿素（约0.5%左右），胍（0.5%左右），硫酸钠（1%），硝酸钠（1%），三氯乙酸（0.5%），乙醇（5%）乙醚（5%），丙酮（0.5%）等溶液对显色反应影响，这些物质浓度高时必须做校正曲线。含硫酸铵的溶液只须加浓碳酸钠—氢氧化钠溶液即可显色测定。若样品酸度较高，显色后色浅。则必须提高碳酸钠—氢氧化钠溶液的浓度1—2倍。
进行测定时，加Folin—酚试剂时要特别小心，因为该试剂仅在酸性pH条件下稳定，但上述还原反应只在pH=10的情况下发生，故当Folin一酚试剂加到碱性的铜—蛋白质溶液中时，必须立即混匀，以便在磷钼酸—磷钨酸试剂 被破坏之前，还原反应即能发生。
此法也适用于酪氨酸和色氨酸的定量测定。此法可检测的最低蛋白质量达5μg。通常测定范围是5～100μg。
四、实验内容
使用Folin-酚试剂法测定老师所提供的血清中的蛋白质浓度。
五、实验步骤
（一）标准曲线的制作
取6支洗净并试管，分别加入0, 0.2 , 0.4, 0.6, 0.8, 1.0毫升标准酪蛋白溶液（500微克/毫升）,然后用水补足到1.0毫升，并用标签纸做好标记，编号依次为1、2、3、4、5、6，不要混淆试管。接着按顺序向各管分别加入5毫升Folin—酚试剂甲液，混匀（使用专门混匀液体的仪器），30℃水浴保温10分钟。保温结束后取出，再依次向各管加入0.5毫升Folin—酚试剂乙液，立即混匀（使用专门混匀液体的仪器），30℃水浴保温30分钟。保温结束后取出，于640nm处比色。每次测定前，要先润洗比色管。记录每个试管中溶液的比色值，然后以光密度（0.D）为纵坐标，以酪蛋白溶液浓度为横坐标，绘制酪蛋白的标准曲线。
（二）血清样品的测定
取4支试管，分别加入0.2ml的血清稀释液（稀释的目的是使其蛋白质含量在酪蛋白标准曲线范围之内），再分别加0.8ml的去离子水使使试管中样品液体积达到10ml。然后分别贴上标签纸，编号为1’、2’、3’、4’。 接着按顺序向各管分别加入5毫升Folin—酚试剂甲液，混匀（使用专门混匀液体的仪器），30℃水浴保温10分钟。保温结束后取出，再依次向各管加入0.5毫升Folin—酚试剂乙液，立即混匀（使用专门混匀液体的仪器），30℃水浴保温30分钟。保温结束后取出，于640nm处比色。每次测定前，要先润洗比色管。记录每个试管中溶液的比色值。或者，先将四支样品试管的比色值取平均数，然后再去标准曲线查找相对的蛋白质浓度值。
（三）计算
依据记录的4支试管中的血清样品的比色值读数在标准曲线上分别查出相应对应的酪蛋白溶液浓度，再折算成每毫升血清稀释液含蛋白质的微克数。然后乘以稀释倍数，得出每毫升未稀释血清蛋白质的微克数，最后计算出每100毫升血清样品中所含的蛋白质的克数。这样会有四个结果，然后取平均值，即为最后结果数据。
六、实验结果
1、实验数据记录表：
2、标准曲线的绘制
（注意：因为酪蛋白溶液和样品溶液都加入5mlFolin-酚试剂甲液和0.5mlFolin-酚试剂乙液然后再去测比色值，所以在绘制标准曲线时，直接使用标准酪蛋白溶液加水配成的1ml酪蛋白溶液的浓度即可，这样方便在全测定完后计算样品溶液浓度。）
3、计算样品中蛋白浓度：
（1）对于四支试管中样品溶液的比色值，取平均数：
（0.195+0.198+0.192+0.195）/4=0.195
（2）对比标准曲线：
根据六支试管测定的数值，绘制标准曲线，曲线即此处的直线，是根据六个数据拟合的直线。有OD值=0.195读出对应的酪蛋白溶液浓度为110μg/ml。
（3）样品溶液中蛋白质含量的计算公式：
样品溶液中的蛋白质含量=（X*5*200）/（10^6）
=（110*5*200）/（10^6）
=0.110g/ml
=11.0g/100ml
(样品溶液稀释了200倍，再加入试管测比色值；10^6μg=1g)
七、实验分析
1、我们小组本次实验顺利完成。对于实验结果，可以看到4支平行试管中样品溶液的比色值基本一致，说明平行性好，更是说明实验成功完成，前面的操作没有失误。
2、在没有大失误的前提下，对于结果同真实值有差距的误差进行分析，误差可能有如下来源：
（1）使用移液枪加试剂时，移液枪中残留一些液体使得加入的变少，或者移液枪的枪头外侧沾有液体并一起加入试管中使得加入的变多。
（2）使用分光光度计测比色值时，比色管润洗的不重分。
（3）分光光度计不很准确，数值易跳动。
（4）标准曲线是拟合的，实验中仅六组数据，拟合的曲线（此处是直线）和真实的有一定差距。
3、在今后使用标准曲线的实验中，要注意：学习本次实验，要将待测样品的浓度降到实验中绘制的标准曲线范围内。
八、实验注意事项
1、实验开始前，注意清洗试管，最后用去离子水冲洗试管。
2、注意，弄清楚实验步骤，加试剂的先后顺序。
3、特别注意：在实验时，不要将标准酪蛋白溶液和样品液加反了。
4、注意严格按照实验步骤所要求的时间进行水浴保温，不要超时或者时间不足。
5、一注意实验的时间，因为溶液的光密度值是随着时间在不断增大的，如果时间超过了30分钟，则测得的光密度值就不准确了。
6、由于分光光度计比较精密，所以往试管中加药品的时候要尽量做到准确。
7、在使用分光光度计时，那比色皿是要拿它的毛面，不可以用手接触它的光滑面，防止自己手上的油污是测量值不准确。
8、在擦拭比色皿时，要顺着一个方向擦。
9、在比色皿中装入的液体量大约要是比色皿体积的三分之二。
10注意：酚和柠檬酸对测定有干扰，低浓度尿素，胍，硫酸钠，硝酸钠，三氯乙烯，乙醇，乙醚，丙酮对显色无影响。
11、各种蛋白质含有不同量的酪氨酸和苯丙氨酸，显色的深浅往往随不同的蛋白质而变化。因而本测定法通常只适用于测定蛋白质的相对浓度（相对于标准蛋白质）。
12、注意在用移液枪向试管中加试剂之前，可以先使用去离子水进行练习。
13、使用移液枪时，不要按到底部，否则会不准。
14、计算时注意样品溶液稀释了200倍才加入试管中反应以及测定比色值。
15、计算时注意单位换算。
16、注意，每次关上盖子测定比色值前，都需要调节仪器，即在第一个比色管处透光率100%。
17、注意，在第一组测完比色值后，不要取出第一个比色管，一直用第一个比色管来调仪器。
18、实验结束后，清洗试管以及比色管，仪器归位。
19、在测比色值时，注意节约溶液。
20、注意测比色值是在640nm条件下。
21、分光光度计在使用前要打开预热30min，是为了确保测定的准确性。
22、注意使用移液枪加试剂时，枪头不要混试剂使用，以免污染试剂。
九、实验思考题
1、含有什么氨基酸的蛋白质能与Folin-酚试剂呈蓝色反应？
答：对于氨基酸，含有酚基的氨基酸（酪氨酸、色氨酸、苯丙氨酸）能与Folin-酚试剂反应呈蓝色，因为Folin-酚试剂在碱性溶液中极不稳定，易被酚类化合物还原为蓝色化合物（钼兰和钨兰混合物）。故含有这些氨基酸的蛋白质能和Folin-酚试剂发生蓝色反应。
2、Folin-酚法测定蛋白质含量的优缺点。
答：（1）优点：是灵敏度高，比双缩脲法灵敏得多；重复性好.颜色深,析光度。（2）缺点：是费时间较长，要精确控制操作时间，标准曲线也不是严格的直线形式，且专一性较差，干扰物质较多。
3、除血清外哪些样品可进行蛋白质测定?
答：尿液，脑脊液，胸腹水等在检验时都有蛋白的检测。不过脑脊液、胸腹水是检验其本身的蛋白含量以确定是否正常。尿液可以从一方面反映人体对蛋白质的吸收好坏，从而检测肾脏的健康与否。
4、通常蛋白质含量测定的方法有哪些？比较优缺点。
答：定氮法，双缩尿法（Biuret法），Folin－酚试剂法（Lowry法），紫外吸收法和考马斯亮蓝法（Bradford法）。
凯氏定氮：灵敏度低，适用于0.2~ 1.0mg氮，误差为 ±2％ ；费时，需8～10小时；将蛋白中的氮转化为氨，用酸吸收后滴定，故非蛋白的氮（非蛋白物质可用三氯乙酸沉淀蛋白质而分离）若不去除也含在测定量中。
双缩脲法（Biuret法）：灵敏度低，1～20mg，中速 20~30分钟，多肽键＋碱性Cu2＋®紫色络合物硫酸铵；测定含有某些氨基酸的蛋白质；用于快速测定，但不太灵敏；不同蛋白质显色相似。
紫外吸收法：较为灵敏，50～100mg，快速 5～10分钟，蛋白质中的酪氨酸和色氨酸残基在280nm处的光吸收。
Folin－酚试剂法（Lowry法）：灵敏度高，～5mg，慢速 40～60分钟，双缩脲反应；磷钼酸－磷钨酸试剂被Tyr和Phe还原；耗费时间长；操作要严格计时；颜色深浅随不同蛋白质变化。
考马斯亮蓝法(Bradford法)：灵敏度最高，1～5mg，快速5～15分钟 考马斯亮蓝染料与蛋白质结合时，其lmax由465nm变为595nm 强碱性缓冲液；
SDS：最好的方法；干扰物质少；颜色稳定； 颜色深浅随不同蛋白质变化。
5、Folin-酚试剂法测定蛋白质含量为什么比双缩脲法灵敏？
答：此法的显色原理与双缩脲方法是相同的，只是加入了第二种试剂，即Folin—酚B试剂，以增加显色量，从而提高了检测蛋白质的灵敏度。
6、Folin 酚法测蛋白质含量为什么要求加入乙试剂后立即混匀？
答：第一步相当于双缩脲反应，在碱性条件下蛋白质中的肽键与Cu2+作用生成络合物；第二步是基于Folin试剂(磷钼酸和磷钨酸试剂)在碱性条件下极不稳定，易被酚类化合物还原生成钼蓝和钨蓝混合物 (呈蓝色反应)，因此需要快速混匀, 继续实验。
十、实验小结
我们小组顺利完成了本次实验。在实验中，我们认真听讲，注意试剂的名称、用法以及用量，仔细认真，不出错误。又快又好的完成了本次实验任务。
本次实验，我收获了很多。我学会了Folin-酚试剂法测量蛋白含量的原理并掌握了它的方法，加强了该法的操作。我还学习了分光光度计以及移液枪的使用。本次实验操作较为简单，但是要认真仔细，不要加错试剂或者搞错试剂加入的顺序，而且操作要快而准确。使用仪器混匀液体时，一定要拿稳且按紧，不要洒出去液体。
在接下来的实验中，我要保持认真仔细，和同组者一起加油完成好每一次实验任务。
十一、参考文献
《生物化学实验（第四版）》 陈钧辉、李俊、张冬梅、张太平、朱婉华编；科学出版社出版。
十二、附录
（一）分光光度计的使用
722型分光光度计的使用
注意事项：
1、测量完毕，速将暗盒盖打开，关闭电源开关，将灵敏度旋钮调至最低档，取出比色皿，将装有硅胶的干燥剂袋放入暗盒内，关上盖子，将比色皿中的溶液倒入烧杯中，用蒸馏水洗净后放回比色皿盒内。
2、每台仪器所配套的比色皿不可与其它仪器上的表面皿单个调换。
使用方法
（1）预热仪器
将选择开关置于“T”，打开电源开关，使仪器预热20分钟。为了防止光电管疲劳，不要连续光照，预热仪器时和不测定时应将试样室盖打开，使光路切断。
（2）选定波长 根据实验要求，转动波长手轮，调至所需要的单色波长。
（3）固定灵敏度档
在能使空白溶液很好地调到“100%”的情况下，尽可能采用灵敏度较低的挡，使用时，首先调到“1”挡，灵敏度不够时再逐渐升高。但换挡改变灵敏度后，须重新校正“0%”和“100%”。选好的灵敏度，实验过程中不要再变动。
（4）调节T=0% 轻轻旋动“0%”旋钮，使数字显示为“00.0”，（此时试样室是打开的）。
（5）调节T=100% 将盛蒸馏水（或空白溶液，或纯溶剂）的比色皿放入比色皿座架中的第一格内，并对准光路，把试样室盖子轻轻盖上，调节透过率“100%”旋钮，使数字显示正好为“100.0”。
（6）吸光度的测定
将选择开关置于“A”，盖上试样室盖子，将空白液置于光路中，调节吸光度调节旋钮，使数字显示为“.000”。将盛有待测溶液的比色皿放入比色皿座架中的其它格内，盖上试样室盖，轻轻拉动试样架拉手，使待测溶液进入光路，此时数字显示值即为该待测溶液的吸光度值。读数后，打开试样室盖，切断光路。
重复上述测定操作1-2次，读取相应的吸光度值，取平均值。
（7）浓度的测定
选择开关由“A”旋置“C”，将已标定浓度的样品放入光路，调节浓度旋钮，使得数字显示为标定值，将被测样品放入光路，此时数字显示值即为该待测溶液的浓度值。
（8）关机 实验完毕，切断电源，将比色皿取出洗净，并将比色皿座架用软纸擦净。
（二）移液枪的使用：
移液枪是实验操作上不可缺少的工具，对于一般的实验而言，重要的就是实验的误差最小，重复再现性好。下面详细谈谈移液枪的使用。
1.影响移液枪精度因素：
A.温度：室温低时，手温较高，使得空气膨胀，吸入冷溶液时往往发生误差
B.气密性：枪头和枪体的结合部，以及枪内柱体之间的长期磨损，造成误差
C.吸速：容易造成枪头内气泡产生，而且会污染枪头
D. 试剂的挥发：吸挥发性高的试剂时，蒸汽进入枪头，内压增高，结果在压出液体时，压力变大，而产生误差。解决办法：反复抽吸4-5次就可改善。
2 具体使用方法：
A：调节旋钮到所需刻度位置，诀窍：首先可略超过一些，再回旋至刻度。注意禁止超过最大刻度，避免人为误差。
B：插上枪头:无菌操作时，要注意动作迅速正确，不能用手碰枪头，动作的力度要保持一致，禁止多余的动作。普通操作时，可用拇指食指上紧，但手不能碰枪头尖端处。
C：指压到第一段，枪头尖端接触试剂。白色枪头进到液面1mm一下，黄色枪头 2-3mm,蓝色枪头2-4mm，避免液压的影响造成的误差。
D：缓慢吸试剂，禁止速度过快，液体进入枪头。
E：移出枪头后，先在容器内壁轻轻靠住，使枪头外壁液体流下。
F：将枪头贴在目标容器内壁，轻轻按到第一段，压出液体。
G：枪头 尖端在容器内壁略上滑动，保留尖端少量液体，移出目标容器，手指卸掉 枪头，注意不要使试剂溅出。