实验四 人类染色体的识别与核型分析
一、实验目的
1. 学习染色体核型的分析方法;
2. 了解人类染色体的特征。
二、实验原理
1.染色体组型(核型)是指生物体细胞所有可测定的染色体表型特征的总称。包括:染色体的总数,染色体组的数目,组内染色体基数,每条染色体的形态、长度、着丝粒的位置,随体或次缢痕等。染色体组型是物种特有的染色体信息之一,具有很高的稳定性和再现性。组型分析能进行染色体分组外,还能对染色体的各种特征做出定量和定性的描述,是研究染色体的基本手段之一。利用这一方法可以鉴别染色体结构变异、染色体数目变异,同时也是研究物种的起源、遗传与进化,细胞遗传学,现代分类学的重要手段。
2.人类的单倍体染色体组(n=23)上约有30000-40000个结构基因。平均每条染色体上有上千个基因。各染色体上的基因都有严格的排列顺序,各基因间的毗邻关系也是较为恒定的。人类的 24种染色体形成了24个基因连锁群,所以,染色体上发生任何数目异常、甚至是微小的结构变异,都必将导致许多获某些基因的增加或减少,从而产生临床效应。染色体异常常表现为具有多种畸形的综合征,称为染色体综合征,其症状表现为多发畸形、智力低下和生长发育异常,此外还可看到一些特征性皮肤纹理改变。染色体畸变还将导致胎儿死产或流产。染色体病已成为临床上较常见的危害较为严重的病种之一,染色体病的检查、诊断已经成为临床实验室检查的重要内容。
1960年,在美国Denver市召开了第一届国际遗传学会议,讨论并确定正常人核型(karyotype)的基本特点即Denver体制,并成为识别人类各种染色体病的基础。按照Denver体制,将待测细胞的染色体进行分析和确定是否正常,以及异常特点即为核型分析。人类染色体分组及形态特征见表1。
表1 人类染色体分组及形态特征(非显带标本)
A组:1-3号,可以区分。1号,最大,M,长臂近侧有一次缢痕;2号,较大,SM;3号,较大,比1号染色体段1/3-1/4)。
B组:4-5号,体积较大,SM,短臂相对较短,两者不容易区分。
C组:6-12,X。中等大小,SM,较难区分。6、7、8、11和X染色体的着丝粒略近中央,短臂相对较长,9、10、12染色体的着丝粒偏离中央。9号染色体长臂有较大次缢痕。X染色体介于7-8之间,但在非显带标本中难以区分。
D组:13-14号,中等大小,ST,均具有随体,但不一定显现或同时显现,随体的大小存在个体的差异。在非显带标本中难以区分13-15号染色体。
E组:16-18。染色体小。16,M,长臂近着丝粒处有一次缢痕,其存在使16号染色体的大小存在较大差异;17,SM,短臂较长;18,SM,是SM中最短的一对染色体,短臂较短。在质量较好的标本中,一般可以区分16-18染色体。
F组:19-20,次小的M。在非显带标本中难以区分。
G组:21-22,Y,最小的ST。21、22染色体的长度略有差别,但为适应临床上已将Down综合征沿用为21三体(而显带证明与此综合征相关的是较小的那条染色体)综合征的叫法,巴黎会议(1971)建议,把这最小的一对改称为第21号(而稍大的一对称为22号),而把这较小的这对第21号染色体排在稍大的22号前面。
Y染色体的特征,无随体,染色体一般比21、22长;两条姊妹染色单体长臂常平行并拢,而21、22则相互叉开;长臂端部常呈现绒毛状,形态不清晰;与其他染色体相比,着色往往较深;着丝粒不明显。
根据Denver体制规定,正常核型的描述方式为:46,XX;46,XY。
3.人们用各种不同的方法,以及用不同的染料处理染色体标本后,使每条染色体上出现明暗相间,或深浅不同带纹的技术称为显带技术(banding technique)。
本世纪70年代以来,显带技术得到了很大发展,且在众多的显带技术中(Q带、G带、C带、R带、T带)。G带是目前被广泛应用的一种带型。染色体标本经胰蛋白酶、NaOH、柠檬酸盐或尿素等试剂处理后,再用Giemsa染色,可使每条染色体上显示出深浅交替的横纹,因为它主要是被Giemsa染料染色后而显带,故称之为G显带技术,其所显示的带纹分布在整个染色体上。每条染色体都有其较为恒定的带纹特征,所以G显带后,可以较为准确的识别每条染色体,并可发现染色体上较细微的结构畸变。
三、材料与试剂
人类染色体非显带、显带标本。直尺,剪刀等。
四、实验步骤
1.分析的主要依据
着丝粒指数(%)——短臂占整条染色体的百分比:
臂比——长臂与短臂的比值(q/p)。反映着丝粒位置的指标。SAT(随体)
1.0-1.7(M); 1.7-3.0(SM); 3.0-7.0(St); 7.0-(Ot);
相对长度(%)——某条染色体的相对长度为该染色体长度占染色体总长度的百分比。
人类某条染色体的相对长度(%) =该条染色体长度/∑22条染色体长度+X染色体长
2.分析的主要步骤
① 测量、计算,。
② 配对
③ 剪贴
④ 排列——原则:从大到小;短臂向上;着丝粒在一条线上;性染色体单排
⑤ 画出模式图——(相对比例)原则同上。
3.图像分析方法
20世纪60年代起,人们开始将图像处理技术应用于核型分析中来。目前已实现计算机自动检测染色体分散良好的中期细胞,并自动完成核型分析。但这样的软件往往价格高昂,一般的单位是不具有的。Abode Photoshop 是一款流行的功能强大的图像处理软件 ,它比专门的核型分析软件容易获得。用这款软件,可以很容易的完成染色体的排列、测量等工作。程序远较传统方法简单。同时,他还具备传统方法所不具备的诸多功能,诸如去除原照片中的斑点、划痕,调整亮度、对比,对交叉重叠的染色体臂进行修整等,使分析结果比较完美。基本方法如下:
(1) 图片获得
将图片输入电脑中。有两种获得图片的方法:一是选择染色体分散良好的有丝分裂中期的细胞,用数码相机进行拍摄(100万像素即可),然后输入电脑;一是按传统方法拍摄,再用300dpi或更高的分辨率将照片扫描进计算机。
(2) 图片处理
用剪裁工具(Crop tool)将不需要的部分裁去,调整图像的位置,视情况调整亮度、对比度;去除斑点、划痕等,然后储存图像,名之为“原始图”。在进一步分析前,用橡皮工具(Eraser tool)等将照片中除染色体以外的其他区域擦除干净。然后将图像另存为“核型图”,利用这张背景干净的“核型图”进行核型分析。
(3) 图片分析
根据目测,对染色体进行大致归拢。首先将一组染色体中非常明显(如最长、最短,具有随体等)、较易分辨的同源染色体进行配对,归类。其余的染色体可以根据自己的判断,暂且将它们配对。按从长到短的顺序或其他规则,将这些配对的染色体排列起来。然后,测量各条染色体的总长及各臂长度。根据测量结果,再对第一步中“误配”的染色体进行调整。
将染色体大致归类的过程仅需要反复使用套索(Lasso)与自由变形(Free transform)两个工具即可。用套索工具从图中圈选同源染色体,从Edit菜单中选择Free transform,此时被圈选的染色体外出现一个矩形的框,用鼠标按住矩形框的一个角可自由地旋转被圈选中的染色体,使短臂朝上,长臂朝下。而将鼠标伸入矩形框中并按住,则可将选中的染色体拖向任何位置。移动到目的地后,按回车键又可回到套索工具中来。自由变形的快捷键是Ctrl+T,使用此快捷键可省力不少。重复上述过程,将所有同源染色体配成对。在配对过程中,可借助放大工具(zoom tool),看清染色体的细节。
染色体间如存在交叉重叠,我们可以同时处理几个染色体重叠较少的细胞,先用套索工具小心地将叠在上面的染色体圈选、移走,再从另一张照片找到相应的细节,用橡皮图章工具(clone stamp tool)仔细地“克隆”到因“分离”而造成的“断臂”处。注意,克隆前要将两个染色体的尺寸调整成一样大。这样“修补”后的染色体比“嵌合体”式的染色体特征更典型。
视需要在画布中拉一条或几条参考线,选用套索与自由变形两种工具,按核型分析中染色体排列的规则,圈选并拖动配好对的染色体排列,将着丝点排在参考线上。
测量每条染色体的总长与臂长,调整“误配”的染色体。在菜单中选Edit→preference→Guide、Grid&Slice,将其中的Grid line every设为1cm,Subdivision则可视精度需要设为10或其他值,在菜单中选View→Ruler、View→Show→Grid显示标尺与网格,将图像放大到300%左右,根据网格线标示准确测量每条染色体的长度及相应的臂长,并做记录。由此读出的尺寸即是被扫描的原始照片中的染色体的尺寸,虽然显示在屏幕上的染色体要比原始照片中的大。如果一条染色体臂是弯曲的,可按前文叙述的方法圈选并旋转染色体,分段测量。这种测量方法既简便又准确。
算出每条染色体的总长、臂长、臂比等参数。这些参数最为接近的两条染色体为同源染色体。根据这些结果,对目测有误的配对结果进行调整。
调整“核型图”画布的大小,将“原始图”移进“核型图”中来,按需要调整大小和位置。用文字工具(type tool)在图的下方对核型图做些说明。合并所有的图层。另存成“核型分析”。最后,用光泽照片纸或高分辨率纸将结果打印出来或插入到其他文档中即可。
五、结果分析
1.根据所给定的染色体图片(非显带和显带标本)进行测量,结果填写表2
表2 人类染色体分析数据
2. 按照Denver体制规定,分组贴图。
六、参考文献
1.刘祖洞,江绍慧编,遗传学实验(第二版), 高等教育出版社,北京, 2004.
2.李凤霞,遗传学实验指导及图谱,吉林人民出版社,长春,2006.
3.王金发,戚康标,何炎明,遗传学实验教程,高等教育出版社,北京, 2008.
4.杨大翔,遗传学实验,科学出版社,北京,2004.
图2 人类G-显带染色体
附人类染色体非显带标本。
图1 人类非显带染色体(上为男性,下为女性)
第二篇:实验十 人类染色体G显带技术及G带核型分析
实验十人类染色体G显带技术及G带核型分析
实验目的
1、初步掌握染色体G带标本的制备技术。
2、了解人类染色体的G显带的带型特征。
实验用品
1、材料:常规方法制备的中期人类染色体标本(标本片龄不超过30天为宜)。
2、器材:显微镜、恒温培养箱、烤箱、恒温水浴箱、冰箱、染色缸、小镊子、玻片架、香柏油、二甲苯、擦镜纸、吸水纸。
3、试剂:0.125%胰蛋白酶溶液、0.02%EDTA溶液、胰蛋白酶一EDTA混合液、0.85%生理盐水、蒸馏水、Giemsa原液、Giemsa稀释液、1/15mol /L磷酸缓冲液。
实验原理
人们将用各种不同的方法,以及用不同的染料处理染色体标本后,使每条染色体上出现明暗相间,或深浅不同带纹的技术称为显带技术(banding technique)。本世纪70年代以来,显带技术得到了很大发展,且在众多的显带技术中(Q带、G带、C带、R带、T带),G带是目前被广泛应用的一种带型。因为它主要是被Giemsa染料染色后而显带,故称之为G显带技术,其所显示的带纹分布在整个染色体上。
研究发现,人染色体标本经胰蛋白酶、Na0H、柠檬酸盐或尿素等试剂处理后,再用Giemsa染色,可使每条染色体上显示出深浅交替的横纹,这就是染色体的G带。每条染色体都有其较为恒定的带纹特征,所以G显带后,可以较为准确的识别每条染色体,并可发现染色体上较细微的结构畸变。关于G显带的机理目前有多种说法,例如,Lee等(1973)认为染色体上与DNA结合疏松的组蛋白易被胰蛋白酶分解掉,染色后这些区段成为浅带,而那些组蛋白和DNA结合牢固的区段可被染成深带。有人认为,染色体显带现象是染色体本身存在着带的结构。比如用相差显微镜观察未染色的染色体时,就能直接观察到带的存在。用特殊方法处理后,再用染料染色,则带更加清楚,随显带方法不同,显出来的带特点也不一样,说明带的出现又与染料特异结合有关。一般认为,易着色的阳性带为含有AT多的染色体节段,相反,含GC多的染色体段则不易着色。总的来说,G显带的机理还未搞清。
内容与方法
一、人类染色体G显带标本制备
1、胰蛋白酶法
①将常规制备的人染色体玻片标本(未染色的白片)置70℃烤箱中处理2小时,然后转入37℃培养箱中备用,一般在第3~7天进行显带。
②取2.5%的胰蛋白酶原液2.5ml加生理盐水至50ml,配成0.125%的工作液并用NaHCO3调pH值至7左右。
③将配好的胰蛋白酶工作液放入37℃水浴箱中预热。
④将玻片标本浸入胰蛋白酶中,不断摆动使胰蛋白酶的作用均匀,处理1~2分钟(精确的时间自行摸索)。
⑤立即取出玻片,放入生理盐水中漂洗两次。
⑥染色。将标本浸入37℃预温的Giemsa染液(1:10的Giemsa原液和pH6.8的磷酸缓冲液)中染色10分钟左右。
⑦自来水冲洗(用细水小心冲洗)、晾干。
⑧镜检显带效果。在低倍镜下选择分散良好的长度适中的分裂相转换油镜观察,若染色体未出现带纹,则为显带不足;若染色体边缘发毛为显带过头,此时应根据具体情况增减胰蛋白酶处理时间重新处理一张标本。
2、EDTA一胰蛋白酶法
①取25ml生理盐水和25ml0.02%的EDTA溶液倒入立式染色缸中混匀。
②取2.5%的胰蛋白酶原液1ml加入到上液中混匀,并用5%NaHCO3调pH值至7左右。置水浴箱预温至37℃。
③将染色体标本片浸入胰蛋白酶一EDTA溶液中处理5~20秒,同时轻轻摇动玻片。
④取出标本立即浸入生理盐水中洗两次。
⑤浸入37℃的Giemsa染液中染色5~10分钟。
⑥细水冲洗后晾干、镜检。
二、正常人各染色体的G带特征
A组:1~3号染色体。
1号染色体。
短臂:近侧段有2条深带,第2深带稍宽,在处理较好的标本上,远侧段可显出3~4条淡染的深带。此臂分为3个区,近侧的第1深带为lp 21;第2深带为1p31。
长臂:副缢痕紧贴着丝粒,染色浓。其远侧为一宽的浅带,近中段与远侧段各有两条深带,此中段第2深带染色较浓,中段两条深带稍靠近,此臂
分为4个区,副缢痕远侧的浅带为lp21号带、中段第2深带为lp31号带,远侧段第1深带为lp41号带。
2号染色体。
短臂:可见4条深带,中段的2条深带稍靠近,此臂分为2个区,中段两条深带之间的浅带为2p21。
长臂:可见7条深带,第3和第4深带有时融合。此臂分为3个区,第2和第3深带之间的浅带为2p21带,第4和第5深带之间的浅带为2p31号带。
3号染色体。在长臂与短臂的近中段各具有1条明显的宽的浅带。
短臂:一般在近侧段可见1条较宽的深带,远侧段可见2条深带,其中远侧1条较窄,且着色淡,这是区别3号染色体短臂的显著特征。在处理较好的标本上,近侧段的深带可分为2条深带,此臂分2个区,中段浅带为2区1带。
长臂:一般在近侧段和远侧段各有1条较宽的深带,在处理好的标本上,近侧段的深带可分为2条深带,远侧段的深带可分为3条深带,此臂分为2个区,中段浅带为2区1带。该染色体的G带图有点象蝴蝶结。
B组:4~5号染色体。
4号染色体
短臂:可见2条深带,近侧深带染色较浅,短臂只有1个区。
长臂:可见均匀分布的4条深带,在处理较好的标本上,远侧段的2条深带可各自分为2条较宽的深带。此臂分为3区,近侧段第1和第2深带之间的浅带为2区1带,远侧段两条深带之间的浅带为3区1带。
5号染色体
短臂:可见2条深带,其远侧的深带宽且着色浓,此臂仅1个区。
长臂:近侧段2条深带,染色较淡,有时不明显,中段可见3条深带,染色较浓,有时融合成1条宽的深带,远侧段可见2条深带,近末端的1条着色较浓,此臂分为3个区,中段第2深带为2区l带,中段深带与远侧深带之间的宽阔的浅带为3区1带。
C组:6~12号和X染色体
6号染色体
短臂:中段有1条明显宽阔的浅带,形如“小白脸”,是此染色体的特征,近侧段和远侧段各有1条深带,近侧深带贴着丝粒。在处理较好的标本上,远侧段的深带可分为两条深带。此臂分为2个区,中段的明显而宽的浅带为2区1带。
长臂:可见5条深带,近侧1条紧贴着丝粒,远侧末端的1条深带着色较淡;此臂分为2个区,第2和第3深带之间的浅带为2区1带。
7号染色体
着丝粒着色浓。
短臂:有3条深带,中段深带着色较淡,有时不明显,远测深带着色浓,形似“瓶塞”。此臂分为2个区,远侧段的深带为2区1带。
长臂:有3条明显深带,远侧近末端的1条着色较淡;第2和第3带稍接近。此臂分为3个区,近侧第1深带为2区1带、中段的第2深带为3区1带。
8号染色体。
短臂:有2条深带,中段有1条较明显的浅带,这是与10号染色体相鉴别的主要特征。此臂分为2个区,中段的浅带为2区1带。
长臂:可见3条分界极不明显的深带,此臂分2个区,中段的深带为2区1带。
9号染色体
着丝粒着色浓。
短臂:近侧段和中段各有1条深带,在处理较好的标本上,中段可见2条较窄的深带。此臂分为2个区,中段深带为2区1带。
长臂:可见明显的2条深带,次缢痕一般不着色,在有些标本上呈现出特有的颈部区。此臂分为3个区,近侧的1条深带为2区1带,远侧的1条深带为3区1带。
10号染色体
着丝粒着丝浓。
短臂:近侧段和近中段各有1条深带,在有些标本上近中段可见2条深带,但与8号染色体短臂比较,其上深带的分界欠清晰。此臂只有1个区。
长臂:可见明显的3条深带,远侧段的2条深带稍靠近,这是与8号染色体相鉴别的一个主要特征,此臂分为2个区,近侧段的1条深带为2区1带。
11号染色体
短臂:近中段可见1条深带,在处理较好的标本上,这条深带可分为3条较窄的深带。此臂只有1个区。
长臂:近侧有1条深带,紧贴着丝粒。远侧段可见1条明显的较宽的深带,这条深带与近侧的深带之间是1条宽阔的浅带,这是与12号染色体相鉴别的一个明显的特征,在处理较好的标本上,远侧段的这条较宽的深带可分为2条较窄的浅带,两深带之间有1条很窄的浅带,一般极难辨认,但它是分区的一个界标,在有些标本上近末端处可见1条窄的淡染的深带。此臂分2个区,上述远侧两条深带之间的那条很窄的淡带为2区1带。
12号染色体
短臂:中段可见1条深带,此臂只有1个区。
长臂:近侧有1条深带,紧贴着丝粒,中段有1条宽的深带,这条深带与近侧深带之间有1条明显的浅带,但与11号染色体比较这条浅带较窄,这是鉴别11号与12号染色体的一个主要特征。在处理较好的标本上,中段这条较宽的深带可分为3条深带。其正中一条着色较浓,在有些标本上,远侧段还可以看到l~2条染色较淡的深带。此臂分为2个区,中段正中的深带为2区1带。
X染色体
其长度介于7号和8号染色体之间,主要特点是长臂和短臂中段各有1条深带,有“一担挑”之名。
短臂:中段有一明显的深带,宛如竹节状。在有些标本上远侧段还可以看见1条窄的着色淡的深带,此臂分为2个区,中段的深带为2区1带。
长臂:看见3~4条深带,近中部1条最明显,此臂分为2个区,近中段的深带为2区1带。
D组:13~15号染色体,具有近端着丝粒和随体。
13号染色体
着丝粒区深染。
长臂:可见4条深带,第1和第4深带较窄,染色较淡;第2和第3深带较宽,染色较浓。此臂分为3个区,第2深带为2区1带,第3深带为3区1带。
14号染色体
着丝粒区深染。
长臂:近侧和远侧各有1条较明显的深带。在处理较好的标本上,中段尚看见1条着色较浅的深带。此臂分为3个区,近侧深带为2区1带,远侧深带为3区1带。
15号染色体
着丝粒区深染。
长臂:中段有一条明显深带;染色较浓,有的标本上近侧段可见l~2条淡染的深带。此臂分为2个区,中段深带为2区1带。
E组:16一18号染色体
16号染色体
短臂:中段有1条深带,在较好的标本上看见2条深带,此臂只有1个区。
长臂:近侧段和远侧段各有1条深带。有时远侧段1条不明显,次缢痕着色浓;此臂分2个区,中段深带为2区1带。
17号染色体
短臂:有1条深带,紧贴着丝粒,此臂只有1个区。
长臂:远侧段看见1条深带,这条深带与着丝粒之间为一明显而宽的浅带,此臂分为2个区,这条明显而宽的浅带为2区1带。
18号染色体
短臂:一般为浅带,此臂只有1个区。
长臂:近侧和远侧各有1条明显的深带,此臂分为2个区,两深带之间的浅带为2区1带。
19号染色体
着丝粒及其周围为深带,其余为浅带。短臂和长臂均只有1个区。
20号染色体
着丝粒区浓染。短臂有一条明显的深带,此臂只有1个区。
长臂:中段和远侧段看见1~2条染色较淡的深带,有时全为浅带。此臂只有1个区。此染色体有“头重脚轻”之名。
G组;21~22号染色体和Y染色体,21、22号有随体。
21号染色体
着丝粒区着色淡。其长度比22号短,其长臂上有明显而宽的深带。此臂分2个区,其深带为2区1带。
22号染色体
着丝粒区染色浓。其长度比21号长,在长臂上可见2条深带,近侧的1条着色浓,而且紧贴着丝粒。近中段的1条着色淡,在有的标本上不显现。此臂只有1个区。
Y染色体
长度变化大,有时整个长臂被染成深带,在处理好的标本上可见2条深带。此臂只有1个区。
三、镜下带型分析
每人用自己所作的G显带标本,选择分散好,染色体带型清晰的分裂相,在油镜下根据上述G显带各号染色体的特征,依次找出1至22号染色体和性染色体,绘成草图。各染色体的位置、形状大小尽量真实(不必绘出带型)。并在各染色体旁边标明染色体序号。
四、正常人染色体G带照片分析
1、在G带染色体显微摄影照片上,用剪刀将染色体沿边缘一条条剪下。
2、按染色体分类标准,分组配对排列在报告纸上,经反复调整,认为准确无误后用胶水贴上。
注:本实验内容较多,可分二次进行。第一次进行G显带标本的制备并在镜下识别l~10号染色体;第二次进行11~22号染色体及X、Y染色体的识别并完成染色体G显带核型分析。
作业与思考
1、每人剪贴一张G带染色体照片,作为对照的中期分裂相贴在报告单上方,核型贴在下方。
2、要制备出良好的G带标本,操作时需注意哪些问题?
3、染色体显带有何意义?
男性G显带
女性G显带