实验七    DNA指纹的遗传分析

【实验原理】

u  “DNA指纹”是指利用DNA差异来进行与传统指纹分析相似的身份识别。DNA指纹是以DNA的多态性为基础，而卫星DNA的发现则是其最重要的奠基石。

u  卫星DNA是由一短序列（即重复单位或核心序列）多次重复而成，因此也有人称其为可变数目串联重复序列（variable numbers of tandem reprat，VNTR）,在人类基因组中存在多种由不同重复单位组成的卫星DNA，重复单位的碱基序列在不同个体中具有高度的保守性，而卫星DNA的多态性则来源于重复单位的重复次数不同，并形成了众多的等位基因。例如，人类1号染色体上的VNTR D1S80，核心序列由16个核苷酸组成，拷贝数在14～41个之间，已知有29种不同的等位基因。

DNA指纹图谱的基本特点：

u  多位点性：基因组中某些位点的小卫星重复单位含有相同或相似的核心序列。在一定的杂交条件下，一个小卫星探针可以同时与十几个甚至几十个小卫星位点上的等位基因杂交。

u  高变异性：DNA指纹图谱反应的是多个位点上的等位基因的特征，具有很高的变异性。发现两个无血缘关系个体具有相同DNA指纹图谱的概率仅为5×10-19，因此，除了同卵双胞胎，几乎不可能有两个人的DNA指纹图谱完全相同。

u  稳定的遗传性：DNA指纹图谱中的谱带能够稳定遗传，杂合带遵守孟德尔遗传规律。子代DNA指纹图谱中产生与双亲都不同的新带的概率（基因突变）仅在0.001～0.004之间。DNA指纹图谱还具有体细胞稳定性，即用同一个体的不同组织如血液、肌肉、毛发、精液等的DNA作出的DNA指纹图谱是一致的。

【材料】

人类口腔细胞。

【仪器与试剂】

1．  仪器

微量移液器，小型离心机，恒温水浴锅，漩涡振荡器，PCR仪，电泳仪，电泳槽，透射式紫外分析仪（或凝胶成像仪）。

枪头，1.5mL，0.2 mL离心管，棉签，使用前均需121℃高温灭菌

2．试剂

NaCl，琼脂糖，溴化乙锭，Na2-EDTA，SDS，Tris，Proteinase K，冰醋酸，溴酚蓝，二甲苯腈蓝，蔗糖，甘油，DNA相对分子质量标记，Chelex 100树脂（Bio-Rad），PCR pre-mix。

3．溶液配制

（1）5%  Chelex树脂

    Chelex 100(Bio-Rad)  0.5g

    50mmol/L Tris-HCl   10mL

    用4mol/L NaOH调pH至11，室温可保存3个月，使用前充分混匀。

（2）2.0％琼脂糖凝胶

    称2.0g琼脂糖放入250ml三角烧瓶，加 入1×TAE溶液100mL微波炉加热溶解，冷却至60℃左右加入1μg/mL溴化乙锭（EB），缓慢混匀后倒胶板。

（3）溴化乙锭（EB）

    用无菌水配制5mg/mL储藏液，工作浓度1μg/mL。

    注意；溴化乙锭为诱变剂，有致癌作用。配制、稀释和染色时必须戴手套。

（4）0.5mol/L  EDTA(pH8.0)

    Na2-EDTA                18.61g

    NaOH                       2g

    蒸馏水定容至100mL，室温保存。

（5）10×TAE电泳缓冲液

    Tris                        48.4g

    冰醋酸                     11.42mL

    0.5mol/L EDTA(pH8.0)        20mL

    蒸馏水定容至1000mL，室温保存。

（6）10%SDS

    SDS 10g用无菌水溶解后（可加热），定容至100mL，室温保存。

（7）蛋白酶K溶液

    20mg/mL蛋白酶K水溶液       5mL

    10%SDS                     1mL

    无菌水                    94mL

    冰箱冷藏。

（8）无菌水：蒸馏水或去离子水，高温灭菌。

（9）1mol/L Tris-HCl(pH8.0)

     将12.1g Tris溶解在80mL蒸馏水中，加盐酸调节pH至8.0，加蒸馏水定容至100mL。

4．引物

Primer1：5’-GAAACTGGCCTCCAAACACTGCCCGCCG-3’

Primer2：5’-GTCTTGTTGGAGATGCACGTGCCCCTTGC-3’

【实验步骤】

1．收集DNA样本

（1）先漱口，然后用灭菌的牙签充分擦刮口腔内壁，将该牙签放入 1.5mL装有1mL无菌水的小离心管中，使粘附在牙签表面的口腔细胞悬浮其中（以能看到悬浮物为好）。震荡10s，10000 r/min离心1min。

（2）从离心管中吸出970μL无菌水，注意不要吸到沉淀。

（3）向离心管中加入200μL 5% Chelex 100，震荡10s混匀。

（4）加入2μL蛋白酶K，混匀，56℃保温5min。

（5）剧烈震荡10s,沸水浴8min。

（6）10000r/min离心3min，离心管中溶液分成上下两层：下层为Chelex100和细胞碎片的沉淀，上层溶液含DNA分子，可以直接用作PCR模板。

    此DNA样本可在4℃或-20℃保存，必要时可在使用前再次加热并离心，使管内物质分层。

2．PCR扩增D1S80等位基因

（1）每个人用记号笔在0.2mL PCR管上做好标记。

（2）准备冰盒，开始反应前尽量使PCR管保持在冰上。

（3）依次加入下列成分，配制25μL体系的PCR反应溶液：

    PCR  pre-mix          12.5μL

    引物1                    1μL

    引物2                    1μL

    口腔细胞DNA样本         10μL

    加无菌水至总体积25uL。

（4）轻弹管壁，混匀溶液。

（5）离心10s，使管壁上的液滴落下。

（6）按下列程序开始PCR反应：

       94℃，1min

             $

       94℃，15s

       68℃，15s

       72℃，15 s

       30个循环

             $

       72℃，10min

             $

       4℃暂时放置，直至开始电泳

3．PCR扩增产物鉴定与D1S80等位基因分析

（1）用1×TAE电泳缓冲液配制2.0%琼脂糖电泳凝胶。

（2）60V预电泳1～2min。

（3）在凝胶上选一孔加入6µL的DNA相对分子质量标记（DNA100bp Ladder）。

（4）每位同学将各自的20µLD1S80 PCR扩增产物加入指定凝胶样孔，注意不要有气泡进入。

（5）60V电泳40min-50min。

（6）取出凝胶用清水漂洗。

（7）用紫外分析仪观察凝胶，记录每个个体的DNA条带数目及其位置。

【结果与分析】

本次实验所选择的方法是D1S80指纹图谱分析的常用方法。人群中D1S80座位的杂合率约为86％。从理论上讲，可能存在435种不同的等位基因组合。利用D1S80座位两侧序列设计的引物（Kasai et al，1990），通过PCR反应，很容易确定特定个体的D1S80等位基因构成，纯合体只有一条DNA带，而杂合体有两条不同的DNA带。

1．  将小组的电泳结果拍照，并把照片贴在实验报告上，对照片进行必要的说明，例如，相对分子质量的标记各片段的大小（bp）。

（见附图）

2．  根据电泳结果，填写D1S80等位基因分析结果（表7-1）：

表7-1  结果记录表

注：因为重复数为l的DIS80 PCR 产物长161bp，所以，重复数每增加一个，序列增加长度16 bp。据此可以催算：

重复数=1+（PCR产物大小－161）/16

3．在班级中调查有无同学D1S80指纹图谱完全相同或部分相同。自行查找有关人群中D1S80各等位基因频率的资料，计算两个没有亲缘关系的个体，其D1S80指纹图谱完全相同或部分相同的概率。

从各小组的电泳紫外图谱看，有一些同学的DNA指纹图谱看起来有些相似，但鉴于本次实验误差大，难以确定其指纹图谱是相同的。理论上可能存在435种不同的等位基因组合。那么D1S80指纹图谱完全相同的概率应为1/(435*435)=1/189221.

【讨论】

从图电泳图可以看出，只有A、D两小组成员的条带清晰明显。小组成员E的PCR产物聚集在加样孔中没有迁移，可能是因为其产物不存导致的；其他成员均没有条带或很浅，可能是由于收集的DNA样本过少，未能PCR出足够的扩增产物。

【思考题】

用PCR、RFLP、RAPD方法产生DNA指纹图谱各有哪些利弊？

答：RFLP分析对样品纯度要求较高，样品用量大，步骤繁琐、工作量大、成本较高；RADP图谱中某些弱带重复性较差，而且目前该法在引物长度和序列及应用的引物数目、扩增反应条件等实验技术方面未标准化，影响了不同条件下结果的可比性；

第二篇：实验七 人类指纹的遗传分析

遗传学实验 人类指纹的遗传分析

在人类的手指、掌面、足趾、脚掌等器官的皮肤表面，分布着许多纤细的纹线。这些纹线可分两种：凸起的嵴纹及两条嵴纹之间凹陷的沟纹。由不同的嵴纹和沟纹形成了各种皮肤纹理，总称皮纹。皮纹具有一定的特征，可以分类识别。在手指端部的皮肤纹理称为指纹（finger print）。每个人都有一套特定的指纹，且这套指纹的纹理终生不变。因而早在1890年Galton就提出用指纹作为识别一个人的标志。至今人们还利用指纹确认嫌疑犯、死者、失踪的儿童或进出某些重要部门的成员等。

指纹有三种基本类型：弓形纹、箕形纹和涡形文（又称螺纹或斗形纹）。在后两种指纹中有三组纹线经过的三叉点，计算三叉点与指纹中心的连线上的纹嵴数即得一个手指的纹嵴数。将十指的纹嵴数相加得总指嵴数（有关概念在“结果辨析”中详细介绍）。有人研究了亲属间总指嵴数的相关，发现同卵双生子与异卵双生子间的相关系数分别为0.95±0.07（理论相关1.00）、0.49±0.08（0.50）（这个结果也为鉴定双生儿究竟是同卵还是异卵提供了一种方法），而父母与子女间为0.48±0.03（0.50）（Chen,1988）。这个结果说明，总指嵴数是一种遗传的性状，且遗传基因是加性的。目前认为这个性状是多基因控制的数量性状，但究竟由哪些基因控制、其遗传方式是什么至尽尚未弄清。

据研究，指纹在胚胎发育第13周开始形成，在第19周完成（Nora,et al.1981）。自然，如果有某种遗传或生理的因素造成嵴纹发育不良，就能在指纹上反映出来。许多研究证实了这个推论。如Down氏综合证患者的10个指头都是正箕纹的比例增加，食指和小指上的出现反箕的比例较正常人高；Klinefelter氏综合证患者弓形纹正常人多，从而使总指嵴数降低。因而指纹又可作为诊断某些先天畸形的一种辅助工具。

除指纹外，掌、趾、足等处的皮纹也用于遗传分析或临床诊断。

在本次实验中，诸位将获取并分析自己的指纹，计算总指嵴数，最后分析全班同学总指嵴数的分布情况。

实验材料和器具

2B以上的软铅（B是铅笔硬度的标记，B前面的数字越大，笔芯越软）；

白纸（一小片即可）；

透明胶带（胶带的宽度应与第一指节长度相当，不宜太窄）；

放大镜；

直尺（10cm左右）。

本实验中所用取手印的方法是Mertens(1998)的方法。作者认为使用这种方法获取手印很方便，同时得到的指纹也很清晰。也可用印泥或油墨等获取指印。用印泥或油墨取指印时，要注意各个手指在纸上滚压时，用力要均匀，同时不能太重，否则很难得到清晰的指纹。

实验步骤

1、洗净双手，擦干，用铅笔在白纸片上涂黑3~4cm见方的一小块。将要取指印的手指在涂黑的区域中涂抹，将整个指尖涂黑。揭一条宽度与手指第一指节长度相当的透明胶带，从指尖的一侧裹至另一侧，轻压，再揭下来，上面即附着你的指纹。将这条透明胶带贴在表1“我的指纹”一栏中相应的位置上。

2、重复第1个步骤，直至获得10个手指的指纹。

3、参照“结果辨析及统计分析”中的有关内容，在放大镜下检查、分析你的指纹类型。算出总指嵴数。算出总指嵴数，并统计分析同班的同学的指嵴数的情况。

结果辨析及统计分析

1、指纹的类型

人类的指纹主要有三种类型。

（1）弓形纹（arch）

由几种平行的弧形嵴纹组成。纹线由指的一侧延伸到另一侧，中间隆起成弓形。弓形纹又可分成两种。一种中央隆起很高形成帐篷状，称帐形弓（tented arch）；另一种是中间隆起较平缓的则称弧形弓（simple arch）。

（2）箕形纹（loop）

几种嵴纹从手指一侧发出后向指尖方向弯曲，再折回发出的一侧，形成一组簸箕状的纹线。箕口的开口方向有两种：一种朝着本手尺骨一侧（即小指方向），这种箕形纹称尺箕（ulnar）或正箕；而开口朝着桡骨一侧（即拇指方向）的称桡箕（radial loop）或反箕。

（3）斗形纹(whorl)

又称螺纹或涡形纹，有几条环形或螺线形的嵴纹绕着一个中心点组成。根据构成斗形纹的嵴纹的形态，又可将斗形纹分成环形斗、螺行斗、囊形斗等类型。环形斗由几条呈同心圆环状的嵴纹组成；螺形斗则由螺线形嵴纹组成。如果在斗形纹的中心，有一条闭合的曲线形嵴纹与其内部的几条弧形线共同组成一个囊状结构，则此斗形纹为囊形斗。

除了这三种基本类型的指纹外，还有其他类型。它们有的由这三种指纹混合而成（如箕、斗混合，箕，箕并列等），有的形状奇特，无法归类。在总指嵴数的记数中，无法归类的不做统计。

2、总指嵴数统计

皮纹中凡有3组不同走向的嵴纹汇聚的区域称为三叉点（tritadius）。用铅笔从指纹中心点到距中心最远的1个三叉点之间划一条连线，连线所经过的纹嵴数目（连线起止点处的嵴线数不计算在内）称纹嵴数（ridge count）。具体方法参见图。弓形纹没有圆心和三叉点，纹嵴数为零。斗形纹有两个甚至更多的三叉点，则取数值较大的一个作为其纹嵴数。双箕斗嵴线计数时，分别将两圆心与各自的轴作连线，计算出两条连线的嵴线数。两条嵴线数之和除以2，其得数为该指纹的嵴线数。将10个手指的嵴纹数相加，综合称为总指嵴数（total ridge count,TRC）。

表   我的指纹图型及纹嵴数

不同的种族间及不同和性别间总指嵴数存在差异。欧洲人平均男性约145，女性约127。有研究表明，中国人的总指嵴数比欧美人高，男约162.7，女约153.1（马慰国，1981）。另外，指纹类型的分布也存在着民族、种族的差异。统计表明，中国人弓、箕、斗三种纹出现的比例分别为2.5%、47.5%、50%（刘少聪，1984）。

参考文献

李崇高.1979.630例正常学龄儿童手的皮纹学观察.遗传，1（4）：7~9

刘少聪.1984.新指纹学.合肥：安徽人民出版社.

马慰国.1981.西安地区750例人手皮纹图型调查分析.遗传，3（1）：1~5

苏应元.1979.皮纹嵴图型与先天畸形.遗传，1（1）：21~24

Chen H.1988.Medical genetics handbook.Warren H.Green,Inc.,221~226

Levitan M,et al.1977.Textbook of human genetics,2nded.Oxford University Press,Inc.

Mertens T R,et al.1998.Genetics laboratory investigations,11thed.Prentice-Hall,Inc.

Nora J J,et al.1981.Medical genetics,2nded.Lea&Febiger,379~392

Penrose L S.1969.Dermatoglyphics.Scientific American,221(6):72~84