基因组DNA的提取与电泳鉴定

一. 【实验目的】

掌握基因组DNA的提取原理和方法

二. 【实验仪器与试剂】

实验仪器：琼脂糖凝胶电泳系统、紫外反射透射分析仪、离心机、恒温水浴锅

实验试剂：氯仿、巯基乙醇、植物基因组DNA提取试剂盒（离心柱型）

三. 【实验原理】

实验中有两种提取DNA的方法，即试剂盒提取法和普通手提法，本次试验采用试剂盒提取法。 试剂盒方法：试剂盒中有特异性结合DNA的离心吸附柱和独特的缓冲液系统，离心吸附柱是一种硅基质材料，可以高效、专一吸附DNA，最大限度去除植物细胞中杂质蛋白及其他有机化合物。

普通手提方法：用机械的方法使组织和细胞破碎，加入SDS等离子型活性剂，溶解细胞膜和核膜蛋白。加入酚氯仿等表面活性剂使蛋白变性。离心，除去组织和变性蛋白，上清液中加入冰冻的无水乙醇使DNA沉淀，离心，弃上清，用70%乙醇漂洗DNA，倒掉上清，风干，溶于灭菌的双蒸水中。

四. 【实验内容与步骤】

1.取出处理过的新鲜藻体0.1g，用液氮研磨至粉状。

2.将研磨好的粉末迅速转移到预先装有700μl 65℃预热缓冲液GP1的离心管中（实验前在预热的GP1中加入β-巯基乙醇，使其终浓度为0.1%），迅速颠倒混匀后，将离心管放在65℃水浴中加热20分钟，水浴过程中颠倒离心管以混合样品数次。

3、加入700μl氯仿，充分混匀，12000rpm 离心5min。

4、小心将上一步所得上层水相转入一个新的离心管中，加入700μl缓冲液GP2，充分混匀。

5、将混匀的液体转入吸附柱CB3中，12000rpm离心30s，弃掉废液（吸附柱容积为可以分次加入离心）。

6、向吸附柱CB3中加入500μl去蛋白液GD（使用前确认是否加入无水乙醇），12000rpm 离心30s，弃掉废液。 左右，

7、向吸附柱CB3中加入700μl漂洗液PW（使用前确认是否加入无水乙醇），12000rpm 离心30s，弃掉废液。

8、向吸附柱CB3中加入500μl漂洗液PW，12000rpm 离心30s，弃掉废液。

9、将吸附柱CB3放入废液回收管中，12000rpm 离心2min，目的是将吸附柱中残余的漂洗液去除。

10、将吸附柱CB3置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。

11、将吸附柱CB3转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加50μl洗脱缓冲液TE，室温放置2min，12，000rpm 离心2min；离心得到的溶液再加入吸附柱C3中，室温放置2min，12，000rpm 离心2min；取出1/10体积提取物进行电泳检测，其余 -20℃保存备用。

五. 【实验结果与讨论】

现象描述及分析

1. 根据电泳结果可以看出DNA条带亮度较高，说明提取出的DNA含量较高。且拖尾现象较轻，

说明可能有部分DNA降解，但是降解程度较小，DNA的完整性保存较好。

2. 由电泳结果看出条带位于marker2000bp条带上方，说明提取出的DNA质量大于2000bp，但

具体大小不能确定。

附图

C2

六. 【思考题】

1.简述DNA提取过程中需要注意哪些问题。

①使用液氮进行研磨时要戴手套，防止冻伤，并保持室内通风。

②研磨时要保证材料始终处于液氮环境中，不可使液氮完全挥发。研磨要充分，尽量不要外溅，因为收集细胞的多少是实验成功与否的关键。

③每人所取材料量不能太多,氯仿的加入量不能太少,且要充分摇匀,否则蛋白质变性不完全。

2.查阅资料简单介绍通过紫外分光光度计给核酸定量的原理。

分光光度计计采用一个可以产生多个波长的光源，通过系列分光装置，从而产生特定波长的光源，光源透过测试的样品后，部分光源被吸收，计算样品的吸光值，从而转化成样品的浓度。样品的吸光值与样品的浓度成正比。

第二篇：真核细胞基因组DNA的提取与鉴定

真核细胞基因组DNA的提取与鉴定

一、目的要求

掌握真核细胞基因组DNA的提取方法，掌握紫外分光光度法测定DNA含量的方法和DNA电泳方法。重点实践植物 DNA 的抽提，掌握 CTAB 法快速抽提白三叶草 DNA 。

二、基本原理

植物 DNA 的抽提常采用两种方法：

（1） SDS 法： 离子去污剂，过程长，纯度高；

（2） CTAB 法：该方法简便、快速，DNA产量高 (纯度稍次，适用于一般分子生物学操作 ) 。CTAB是一种非离子去污剂，植物材料在CTAB的处理下，结合65℃水浴使细胞裂解、蛋白质变性、DNA 被释放出来。CTAB与核酸形成复合物，此复合物在高盐 （>0.7mM ） 浓度下可溶，并稳定存在，但在低盐浓度（ 0.1-0.5mM NaCl ）下CTAB-核酸复合物就因溶解度降低而沉淀，而大部分的蛋白质及多糖等仍溶解于溶液中。经离心弃上清后，CTAB-核酸复合物再用70－75%酒精浸泡可洗脱掉CTAB。再经过氯仿 / 异戊醇 (24:1) 抽提去除蛋白质、多糖、色素等来纯化 DNA ，最后经异丙醇或乙醇等 DNA 沉淀剂将 DNA 沉淀分离出来。现生物试剂公司多依据此原理，经过改造，以吸附膜吸附DNA，除去杂质，从而减少了使用有害药品氯仿抽提的步骤。

琼脂糖凝胶电泳是分离、鉴定和纯化DNA片段的标准方法之一。琼脂糖是从海藻中提取出来的一种线状高聚物，将其熔化在所需缓冲液中使成清澈、透明的溶液，然后倒入胶模令其固化。不同浓度的琼脂糖形成的固体基质具有不同的密度（或孔隙度），因此适宜分离不同大小的DNA片段。在电场中，DNA分子主要因其分子大小不同而被分离。

三、实验步骤（具体见试剂盒操作说明）

植物基因组DNA的提取（参考步骤）

1． 采集适量幼嫩叶片，用液 N2 研成粉末， 0.4 g 装入 1.5ml 离心管中（ -20 ℃预冷）。

2． 预热 1.5 × CTAB 到 95 ℃，加 1ml 到装有叶片粉末的离心管中，混匀（防止冻融）。

3． 立即置于 65 ℃水浴 30min ，每 5 min，上下颠倒 1 次。

4． 12000g 离心 5 min。

5． 吸取上清液约 600μl ，加入等体积（ 600μl ）氯仿 / 异戊醇 (24:1) ，上下颠倒数次，至下层液相呈深绿色为止。

6． 12000g 离心 5 分钟。

7． 取 450μl 上清于一新 1.5ml 离心管，加入 1ml 95% 乙醇和 45μl 10M NH4AC ，混匀，室温放置 10min 。

8． 12000 g 离心 10min ，去上清，用 75% EtOH 浸洗沉淀，自然干燥约 30 min 。

9． 加入 50μl 1/10 TE 或无菌水（含 20μg/RNase ），置于 4 ℃过夜，待 DNA 溶解后，检测 DNA 浓度及质量。

琼脂糖凝胶电泳

1. 琼脂糖凝胶板的制备

配制1%琼脂糖-TAE（242 g Tris，57.1 ml乙酸，100ml 0.5M EDTA pH 8.0，用时稀释50倍）凝胶液。待琼脂糖完全溶解并冷却至65℃左右，小心倒入有机玻璃内槽，控制灌胶速度，使胶液缓慢展开，直到在整个有机玻璃板表面形成均匀的胶层。室温下静置1 h左右，待凝固完全后，将铺胶的有机玻璃内槽放在电泳槽中待用。

2. 加样

在电泳槽中注入TAE稀释液，没过整个胶面，拔下加样梳。向DNA样品中加入1/10

体积的加样缓冲液（0.25%溴酚蓝，40%蔗糖水溶液），充分混匀，用微量加样器将DNA样品加入加样孔中。可在相隔加样孔中加入DNA marker，以估计DNA条带分子量。

3. 电泳

加完样品的凝胶板立即通电，进行电泳，电场强度不高于5 V/cm。当指示剂移动到距离胶板下沿约1-2 cm处，停止电泳。

4. 观察

电泳凝胶用EB（溴乙锭）染色（可提前加入琼脂糖凝胶液中），在波长为254 nm的紫外灯下，观察染色后的电泳凝胶。紫外光激发30秒左右，肉眼可观察到清晰的条带。在紫外灯下观察时，应戴上防护眼镜或有机玻璃防护面罩，避免眼睛遭受强紫外光损伤。

四、注意事项：

1．尽量取材幼嫩叶片，如太老，酚类物质多，必须用 10 mM 的β -ME 处理

2．研钵预冻，粉末至加 CTAB 前不要融化

3．实验过程中动作应轻柔，转移用的枪头最好是剪宽了的

4．所用试剂必需灭菌

五、思考：

1. DNA 降解的可能原因

2. 提高DNA产量的措施

附注：

1．影响 DNA 在琼脂糖凝胶中迁移速率的因素：

① DNA 分子大小 迁移速率 U 与 logN 成反比（ N 为碱基对数目）。分子大小相等，电荷基本相等（ DNA 结构重复性）。分子越大，迁移越慢。等量的空间结构紧密的电泳快（超螺旋 > 线性 DNA ）

② 琼脂糖浓度： logU=logU0Krt胶浓度， U 为迁移率，U0为 DNA 的自由电泳迁移率， t 为胶浓度， Kr 为介质阻滞系数。不同的凝胶浓度，分辨不同范围的 DNA Agarose ： 0.5% ： 1-30 kb ； 0.7% ： 0.8-12 kb

1.2% ： 0.4-7 kb ； 1.5% ： 0.2-3 kb.

③ DNA 构象：一般迁移速率超螺旋环状 > 线状 DNA> 单链开环。当条件变化时，情况会相反，还与琼脂糖的浓度、电流强度、离子强度及 EB 含量有关。

④ 所加电压：低电压时，线状 DNA 片段的迁移速率与所加电压成正比。使分辨效果好，凝胶上所加电压不应超过 5V/cm

⑤ 碱基组成与温度：一般影响不大 4 -30 ℃

⑥ 嵌入染料的存在：降低线性 DNA 迁移率 ( 不提倡加在电泳液中 )

⑦ 电泳缓冲液 （ 0.5 × TBE ）的组成及其离子强度影响 DNA 的迁移率，无离子存在时，核酸基本不泳动，离子强度过大产热厉害，熔化凝胶并导致 DNA 变性，一般采用 1 × TAE ， 1 × TBE ， 1 × TPE （均含 EDTA pH 8.0 ）。

2．溴化乙锭（ EB ）为致癌剂，操作时应戴手套，尽量减少台面污染。

3．电泳指示剂：核酸电泳常用的指示剂有两种，溴酚蓝（ Bromophenol blue, Bb ）呈蓝紫色；二甲苯晴（ xylene cyanol, Xc ）呈蓝色，它携带的电荷量比溴酚蓝少，在凝胶中的迁移率比溴酚蓝慢。