建宁县客坊中心小学《培养低年级学生良好书写习惯的研究》课题组

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《培养低年级学生良好书写习惯的研究》

开题论证报告

建宁县客坊中心小学 李 玲

各位专家、领导、老师们：

大家好！今天我在这里就《培养低年级学生良好书写习惯的研究》课题作论证报告，下面，我就从选题、研究意义与目的、研究步骤与方法等方面加以阐述，请大家给予批评指正。

一、选题缘由或教学困惑：

教育家叶圣陶曾说过：“什么是教育，简单一句话，就是要培养良好的习惯。”可见，从小养成良好习惯，是小学阶段重要的教学内容。良好的学习习惯有很多，其中良好的书写习惯可以让一个人受益终生。本人多年从事小学低年级文教学，据调查很大部分学生并没有良好的书写习惯。如坐姿不正、握笔不到位、距离不合适、书写不规范等等。分析原因发现主要是现在的教学任务比较重，教学时间紧张，老师为了赶进度，挤占、挪用写字课的时间。大部分家长只注重学习成绩，对于书写时的姿势等习惯很少关心，没有引起足够的重视。俗话说：一手好字是人的第二外表，而写好字的前提是养成良好的书写习惯，可见，良好书写习惯的培养是小学低年级特别是低年级语文老师应该认真面对的问题。

二、研究的意义与目的：

《课程标准》对低年级的写字要求作了明确的规定：要有良好的书写习惯。因此“掌握汉字的基本笔画和常用的偏旁部首，能按笔顺规则用硬笔写字，注意间架结构。初步感受汉字的形体美。养成正确的写字姿势和良好的写字习惯，书写规范、端正、整洁。” 是低年级学生必须掌握的要领。在这一阶段，培养学生养成良好的书写

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习惯，对学生的终身学习和终身发展具有深远的意义。

通过课题的研究，培养学生良好的书写意识，使学生在学习和生活中养成良好的书写习惯，并内化为其学习生活的自觉行为。并探索培养学生快速握笔、正确坐姿、高质量书写的策略。

三、文献综述及对综述的评价：

主要参考文献有：《现代教育论》 黄 济、王策三编著 人民教育出版社，2000；《陶行之教育文选》陶行之 人民教育出版社， 1981；《班主任工作参考》沙北虹、姜 娜编著 大连出版社，2004.5；《找对方法》林 涛、王 硕编著 哈尔滨出版社 2005.11等。国内外有关培养低年级学生良好书写习惯的研究策略为本课题研究提供了可资借鉴的宝贵经验和财富。学生良好的书写习惯的培养作为学习心理研究的一个重要方面，在国内外都取得了很大的成就，有许多这方面的专著。《陶行之教育文选》陶行之著，《班主任工作参考》沙北虹、姜 娜著，《现代教育论》 黄 济、王策三著等。许多学校也有类似的研究课题，取得了一定的成效。这为本课题研究奠定了扎实的基础，但对新时期小学生书写习惯出现的新特点、新问题、新动向而言，适应性不是很高，尤其是在信息化、网络化、手机智能化时期，从小培养学生良好的书写习惯的培养方面显得薄弱。本课题的研究主要是在以往研究的基础上，针对当前小学生的特点探讨如何从小学低年级开始培养良好的书写习惯，从而培养出良好的学习习惯。

四、研究步骤及措施：

(一)、研究步骤，一共分为三个阶段：

第一阶段：（20xx年1月---20xx年3月）

（1）成立课题研究小组。

（2）收集资料，调查分析，确立课题，进行课题前测与课题立项工作。

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（3）制定课题研究方案、实施计划，做好开题论证。

第二阶段：（20xx年3月----20xx年1月）

（1）正式开始实施研究。

（2）收集研究的原始资料。

（3）组织阶段性测评和研究评估。

（4）结合实践，撰写论文，做好课题中期报告。

第三阶段：（20xx年1月----20xx年3月）

（1）整理课题研究资料、撰写经验总结、撰写结题研究报告。

（2）进行结题鉴定等。

(二)、研究措施：

1、课题开始阶段由班主任会同各科任教师查找书写方面存在哪些不良习惯。

2、分阶段设定需达成的目标。第一阶段：纠正学生的不良坐姿、纠正学生的握笔姿势、纠正学生的手眼距离等。第二阶段：培养学生良好的书写质量意识、注意养成正确的笔顺、笔画，逐渐养成书写美感，写出美观、整洁、大方的作品。

3、班主任建立每位学生的书写成长档案。（每一份材料含有当时所具备的习惯。）

4、与各科教师沟通，达成书写习惯教育的一致性，每一门学科教学过程中都必须渗透良好书写习惯的培养。

5、开展“三个一”常规活动：①每天保证20分钟书写训练（可以占用语文小课，也可以是写字课时间）；②每月一次班级书写评比（含书写质量、书写习惯的评比，评出几名“书写习惯之星”，将评比作品和书写姿势照片要存入“书写成长档案”）； ③学期末举办一次书写习惯及成果展示（资料和照片要整理、存档）。

6、跟踪做好一到两个比较典型的个案研究。（有素材、有照

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片、有档案）

五、研究方法及工具：

1、文献研究法：通过对《小学生心理学》、《语文新课程标准》等相关文献的研究，为此课题奠定理论基础。

2、观察研究法：通过此方法了解平时没有良好书写习惯的学生数量以及研究前后的变化。

3、调查分析法：一、二年级小学生书写习惯养成教育的现状进行问卷调查并作相应的成因分析。

4、经验总结法：通过对数据进行统计、对比，依据研究成果，在学期末对课题研究进行全面的反思与总结。

六、成果预期：

(一)、培养学生正确的写字姿势

小学生的骨骼正处于逐渐完成的过程，如果不重视培养正确的写字姿势，他们在写字时就会歪头、斜肩、驼背。时间长了，就容易造成脊柱侧弯和眼睛近视，对孩子的健康成长极为不利。因此，必须从学生上一年级开始，就让他们知道，什么姿势是正确的，什么姿势是不正确的，深深懂得写字姿势不正确对身体的危害是非常大的。

(二)、培养良好的写字习惯

培养学生认真的写字态度非常重要。学生必须按照教师所教的写字方法进行刻苦训练，做到一丝不苟，始终如一。先要求学生写的正确、端正、整洁，再要求行款整齐，逐步提高写字速度。还要教育学生爱惜写字用具，教给他们使用和保管各种写字用具的方法，如怎样削铅笔，本子怎样放，写完字后怎样整理写字用具等。这些良好的习惯不是一朝一夕就能养成的，教师要耐心细致地指导学生。

(三)、注重书写兴趣的培养

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兴趣是做好每一件事情的基本保证。教师利用书写训练开展生动有趣的活动，激励学生对书写产生浓厚的兴趣，让学生在活动中学习、锻炼并逐步提高。

培养小学生良好的书写习惯，是一个循序渐进，逐步提高的漫长过程。必须付出艰辛的劳动，持之以恒，常抓不懈，方能使学生从小养成认真书写的良好习惯。我们想通过课题的研究带动其他班级的师生重视书写的习惯的培养，从而养成良好的书写习惯，让学生受益终身。

七、本研究希望得到的支持：希望得到校级领导的重视，学校经费的保障以及县进修学校专家的悉心指导。

附:参考文献：

1、黄 济、王策三《现代教育论》 人民教育出版社 2000

2、陶行之 《陶行之教育文选》 人民教育出版社 1981

3、沙北虹、姜 娜《班主任工作参考》 大连出版 2004.5

4、林 涛、王 硕 《找对方法》 哈尔滨出版社 2005.11

第二篇：开题论证报告陆惠

开 题 论 证 报 告

右归丸对卵巢早衰模型小鼠Th17/Treg表达的影响

研 究 生： 陆惠

导 师： 丁 青 教授

专 业： 中西医结合妇科学

研究方向： 妇科内分泌病症防治机理研究

中国·湖南·长沙

二零一一年五月

目 录

附：中英文缩略词表???????????????????????? 2

一、项目研究的意义 ??????????????????????? 3

二、国内外研究现状分析 ??????????????????????3

（1）中医对卵巢早衰的认识 ??????????????????3

（2）对右归丸的认识 ?????????????????????4

(3) 西医对POF的认识 ????????????????????4

1. Thl7的调控??????????????????????????5

2. Treg的调控??????????????????????????6

三、实验方案 ???????????????????????????7 1 研究内容 ??????????????????????????7 2 实验材料 ??????????????????????????7

2.1实验药物???????????????????????? 7

2.2常用试剂?????????????????????????8

2.3实验动物 ????????????????????????8

2.4实验仪器 ????????????????????????8

3.实验方法 ???????????????????????????9

3.1实验分组 ????????????????????????9

3.2 造模 ?????????????????????????10

3.3 给药方法 ???????????????????????10

3.4 实验取材 ???????????????????????11

3.5 检测方法 ???????????????????????11

4. 统计学处理 ?????????????????????????11

5.技术路线图??????????????????????????12

四、毕业论文整体设计???????????????????????13

五、时间安排???????????????????????????13

六、参考文献???????????????????????????14

附：综述???????????????????????????19

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【中英文缩略词表】

卵巢早衰 POF

卵泡刺激素 FSH

黄体生成素 LH

孕激素 P

雌激素 E2

抗透明带抗体 AzpAb

转化生长因子-β TGF-

卵泡抑制素-β INH-

抗苗勒激素 AMH

调节性T 细胞 Treg

辅助T淋巴细胞17 Th17

维甲酸相关孤儿素受体-γt R0R-

叉头转录因子3 Foxp3

信号传导蛋白和转录激活物5 STST-5

白细胞介素-2 IL-2 白细胞介素-6 IL-6

白细胞介素-12 IL-12

白细胞介素-17 IL-17

白细胞介素-23 IL-23

完全弗氏佐剂-透明带多肽 CFA-PZP3 酶联免疫吸附试验 ELISA

簇分化抗原4 CD4 β β γt

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一、项目研究的意义

卵巢早衰(premature ovarian failure, POF)是指性器官发育正常的女性在40岁以前出现闭经，伴卵泡刺激素(follicle stimulating hormone， FSH)和黄体生成素(luteinizing hormone， LH)水平升高，雌激素（estradiol, E2）水平降低，卵泡数量减

少，卵巢体积缩小并最终萎缩的卵巢功能衰退现象。发病率约为1%~3%[1] 。目前POF的发病机理尚无定论。发病原因包括遗传免疫因素、理化因素、代谢因素、促性腺因素及其酶和受体的缺陷、各种感染、精神心理因素等。近年来，临床发病率有逐年上升趋势。大约10%~30%的POF是由于免疫系统不能识别自身卵巢组织所致,该类患者常合并多种自身免疫性疾病。本病影响夫妻生活质量和正常生育,且绝经后症状明显，患者出现骨质疏松、心血管病变及脂质代谢紊乱等症状，因治疗相对困难给患者及其家庭造成痛苦。西医激素替代疗法有远期雌激素依赖性肿瘤风险,辅助赠卵有伦理学争议及流产风险, 近年报道的卵巢组织冻存法（OTCP）成功率低。而中医药治疗临床报道有一定的疗效且无副作用。因此，积极探讨自身免疫性POF发病机理可望开辟一条经济、安全而有效的中医药防治道路。 [2]

二、国内外研究现状分析

（1）中医对卵巢早衰的认识

传统医学认为，本病属 “血膈”、“血枯”、“闭经”、“年未老经水断”、“不孕”等范畴。《冯氏锦囊秘录》曰：“气之根肾中之真阳也；血之根肾中之真阴也”。冲任通盛以肾气盛为前提，受天癸调节，故冲任之本在肾。胞宫司月经，肾与胞宫相系，故肾是产生月经的基础。《内经》云：“女子七岁肾气盛，齿更，发长；二七而天癸至，任脉通，太冲脉盛，月事以时下；??七七任脉虚，太冲脉衰少，天癸竭，地道不通，故形坏而无子也。” 《傅青主女科》曰：“经水出诸肾”、“经水早断，似乎肾水衰涸”。说明肾气的盛衰主宰着天癸的至与竭，月经的行与止。可见肾在女性生殖生理中有不可替代的作用。卵巢早衰的临床特点就是未至绝经年龄而过早绝经，因此对该病的治疗多从肾虚考虑。中医肾主生殖中，肾代表了脑、冲任、天癸、脑肾间功能的控制和调节，这与现代医学中的中枢神经系统通过下丘脑、垂体和卵巢间生殖功能调节有相应之处。大量研究结果及临床观察表明，“肾虚”患者生殖内分泌存在不同程度的功能异常[3]。因此，肾虚是卵巢早衰的主要病机。

3

卵巢早衰以阳虚为主，卵子是肾所藏之精，肾精是其物质基础。肾精充盛，则卵子得以正常发育。阳主乎动，只有通过肾阳的鼓动，天癸才能至，任脉才能通，太冲脉才能盛，月时才能以时下。“肾者主蛰，司开合”，肾主闭藏，司开合是肾阳功能的表现。肾阳保证肾在排卵前只合不开，发挥主蛰主闭藏之功能，肾藏精而不泻，肾精充盛，卵子发育成熟；阳主乎动，肾阳之气化使肾在排卵期短暂开放，作为内在动力鼓动成熟卵子排出。若肾阳亏虚，闭藏功能失调，当合不合，则卵泡不能发育成熟，当开不开，则不能作为内在动力而鼓动卵子释放。阴阳互根互用，肾阳亏虚可致肾阴阳的动态平衡失调，最终引起肾阴虚或肾阴阳两虚。而肾阴虚则表现为卵巢功能不足或衰退，没有发育的卵泡或卵泡不能发育成熟造成E2水平低落，垂体功能亢进，FSH水平升高，从而对垂体促性腺激素的分泌失去负反馈作

用。肾阴阳两虚则阴气不能润泽、阳气失于施化、天癸难于泌至、冲任之气行艰，故至经水断绝或不孕。

（2）对右归丸的认识

右归丸出自明代杰出医家张景岳之《景岳全书》，由熟地、山药、山茱萸、枸杞、鹿角胶、菟丝子、杜仲、当归、肉桂、制附子组成，具有温补肾阳，填精益髓之功，是“阴中求阳”的代表方。方中附子、肉桂、鹿角胶为君药，温阳化气，直补肾阳；臣以熟地黄、枸杞子、山茱萸、山药滋阴益肾，养肝补脾；佐以杜仲、菟丝子共补肝肾之阴；当归养血和血，配伍补肾之品，养血补经。全方补阳药与补阴药相配，则阳得阴助，生化无穷。有助于卵巢功能的调节和排卵功能的恢复。

古代医家在应用有归丸时，病种以不孕不育10.87%、虚劳9.78%、腰痛8.70%居前３位，现代医家应用右归丸时，以不孕不育14.3%、虚劳11.9%、泄泻10.7%居前３位。从医案记载的症状来看，不孕不育、虚劳、腰痛等病种，病机均为肾阳虚衰、肾精不足。故选右归丸以温补肾阳，补肾填精。而有关泄泻病案中，其病机多为脾肾阳虚，故在选用右归丸温补肾阳的同时，还常与温运脾阳之方如四神丸、理中丸等合用以温肾暖脾、固肠止泻。可见古今医家在应用右归丸时，其适应证为肾阳虚衰所致的不孕不育、虚劳、腰痛、泄泻等病种。

管华全，樊巧玲，张永文.肾气丸与右归丸主治疾病比较。浙江中医药大学学报，2010，34（1）。

临床应用该方治疗不孕症、更年期综合征、骨质疏松疗效显著[4-5]。从大量动物实验研究中发现，本方对下丘脑-垂体-卵巢-性腺轴具有多层次的调节作用，并能延缓衰老[6]，

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抑制卵巢卵泡细胞凋亡[7]，调节机体免疫力[8]作用。右归丸能降低病理性囊性卵泡数，促进卵泡发育成熟及排出，并促进黄体形成，能增加血清中E2含量[9]。在自身免疫疾病的治疗方面

能够降低自身免疫性脑脊髓炎（EAE）的发病率，能通过上调EAE缓解期血浆Th1/ Th2水平或下调CD4+表达，下调CD4+/ CD8+的水平减轻自身免疫疾病的严重程度[10-11]。

(3) 西医对POF的认识

POF 的发病因素复杂，发病原因尚不清楚，目前研究认为与遗传因素、自身免疫因素、先天性酶缺乏及医源性损伤等有关。早在上世纪90年代即有研究表明POF患者存在多种自身抗体或伴有自身免疫性疾病。在某些POF患者血中都可测出高浓度的抗透明带抗体

（AzpAb），抗卵巢抗体（AoAb）和抗颗粒细胞抗体（MG-Ab）[12]。对POF患者的卵巢活检发现，卵巢内各级卵泡周围存在淋巴细胞和白细胞浸润。其机制是在体内卵巢抗原及透明带抗原等自身抗原的作用下，产生大量自身免疫抗体，与细胞免疫有关的初始CD4+ T细胞接受抗原刺激信号，在共刺激信号的作用下活化，在不同的条件下分化成不同亚型的T淋巴细胞，包括Th1型、Th2 型、Th17 型效应T细胞，或调节性T 细胞（Treg细胞），执行不同的生物学功能[13],这些淋巴细胞亚群在各种细胞因子的协同作用下导致卵巢自身免疫异常，使卵巢组织细胞损伤，原始卵泡数量减少、卵泡闭锁增加或加速、卵泡成熟障碍，抗苗勒激素(anti-mullerian hormone,AMH)下降，最终表现为卵巢合成性激素功能低下或者不能合成，降低了对下丘脑-垂体轴的负反馈作用，导致FSH、LH升高，E2的降低 [14] 而发生POF。研究表明，AMH

与早期窦卵泡数目呈显著正相关，这种相关性大于窦卵泡数与卵泡抑制素-β（INH-β）和FSH的相关性。AMH比INH-β和FSH等更能反应卵巢储备功能[15]。血清AMH的浓度可以反映始基卵泡库的大小，能够作为卵巢储备功能的标志物。在POF患者中，血清AMH水平明显低于正常女性[16]。

目前对于CD4+分化的两大细胞亚群Th1细胞/ Th2细胞的失衡与POF关系的研究已颇具成果。然而Th17细胞和Treg细胞这两个在其他自身免疫性疾病中已成为新的研究热点的T细胞亚型，在自身免疫性POF中的研究还有待深入。Th17 细胞具有独立的分化和发育调节机制，能表达IL-6、IL-17和TNF-α等炎性细胞因子，与多种免疫失调性疾病相关。系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎及多发性硬化症等患者的血清及组织中均能检测到IL-17 的高表达[17-19]。Treg 细胞是一类能够控制免疫应答强度，减轻对机体组织损伤的具有免疫抑制作用的T 细胞亚群。研究发现在多种自身免疫性疾病中，均存在Treg细胞的功能缺陷或数量减少[20]。Th17

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/Treg细胞平衡状态的打破是很多自身免疫性疾病发病的关键因素。自身免疫性POF可能与Th17细胞的过度激活和（或）Treg细胞数目减少有关。

1. Thl7的调控

20xx年，Park等[21]和Harrington等[22]研究发现，IL-23通过促进CD4+T细胞分泌炎性细胞因子IL-17而发挥其促炎效应，因此IL-23 p19基因的敲除影响了细胞因子IL-17的水平，间接影响自身免疫性疾病的发生，并首次提出Thl7细胞的概念．Xu等[23]做了一项研究，体外激活纯化的小鼠CD25+T细胞后产生大量TGF-β,IL-6存在时CD4+CD25+Foxp3+T细胞分化为Thl7。因此IL-6是决定初始CD4+T细胞分化为Treg还是Thl7的关键因子。研究发现Thl7能自分泌产生IL-21来促进自身分化进程[24]．IL-6可诱导Th17自分泌IL-2l，后者通过正反馈诱导IL-21和IL-23R的表达，同时IL-21诱导STATA3表达并与IL-23系统共同诱导维甲酸相关孤儿素受体γt (R0R-γt )表达，促进IL-17的产生[25]。总之，Thl7的分化主要包括3个阶段：TGF-β和IL-6首先启动Thl7分化，IL-21介导Thl7扩大分化规模，IL-23则在分化后期维持Thl7稳定分化成熟。R0Rγt 是Th17分化的重要转录因子[26]。有研究发现，未致敏T细胞充分表达ROR-γt可诱导其向Thl7细胞方向分化，分泌IL-17发挥致炎作用；若缺乏ROR-γt 的表达，则不能向Th17细胞方向分化[27]。

2. Treg的调控

根据细胞因子表面标记、转录因子的表达及分泌细胞因子的不同，CD4+Treg主要分为两个亚群：自然调节性T细胞(nature Treg，nTreg)和适应调节性T细胞(adaptive or induced Treg．aTreg or iTreg)。nTreg主要指在胸腺发育成熟后进入外周淋巴组织的Treg细胞，在预防病理性自身免疫反应方面起作用；iTreg主要由成熟T细胞诱导产生，在微生物感染和移植免疫中起主要作用。nTreg主要为CD4+CD25+Treg，是维持机体内环境稳定的主要Treg，其功能为通过下调自身免疫应答来诱导自身免疫耐受和抑制自身免疫疾病的发生[28]. 在转基因动物实验中发现，随着FOXP3表达水平的降低，nTreg的抑制功能丧失，并分化为Th2细胞，最终导致自身免疫综合征[29]．还有实验证明，T细胞表面过度表达FOXP3可以使其转变为Treg表型,并发挥其抑制活性[30]。持续表达FOXP3是维持Treg抑制活性的关键因素[31]。因此FOXP3对

CD4+CD25+Treg的发育、外周表达和功能维持起关键性作用。TGF-β由Th3分泌，是重要的免疫调节分子,通过调节FOXP3表达来影响Treg的功能．研究表明TGF-β对维持小鼠外周

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CD4+CD25+Treg的数量，功能及在外周诱导FOXP3的表达至关重要[32,33]。在没有TGF-β存在的情况下，Treg细胞抑制功能减弱，在体内存活率降低。此外，诱导FOXP3的表达还需要IL一2介导激活STAT5，TGF-β和IL-2可维持分化后Treg细胞的生存和功能[34]

Th17 细胞和Treg 细胞的分化发育和功能发挥受到多种细胞因子的正负调节。由于Th17细胞/Treg细胞失衡与多种自身免疫性疾病的发生发展密切相关，本研究认为TGF-β、IL-2、IL-6可能是调控二者平衡的重要因素。右归丸可能对关键调节因子有调控作用,并通过上调Treg 细胞或下调Th17 细胞在疾病中的水平以达到动态平衡，发挥治疗作用。故拟通过注射完全弗氏佐剂-透明带多肽（CFA-PZP3）建立POF小鼠模型[35]，观察右归丸有效成分干预前后卵泡形态学、垂体及卵巢内分泌功能及Th17细胞/Treg细胞的平衡状态的改变，并进一步从Th17细胞和Treg细胞的细胞因子正负调节网络入手，找出右归丸有效成分的治疗靶点，丰富中药治疗机理的研究。

三、实验方案

1 研究内容

（1）观察动物模型是否造模成功：阴道脱落细胞检查观察小鼠的动情周期、放射免疫荧光法检测血清中抗透明带抗体、雌二醇、卵泡刺激素、黄体生成素及抗透明带抗体水平，小鼠卵巢HE染色光学显微镜下观察组织形态学改变。

（2）小鼠眼球后动脉采血后予以颈椎脱臼处死，留取双侧卵巢组织称重，并固定，脱水，石蜡包埋、切片，常规HE染色后置光镜下观察，探讨右归丸干预后卵巢重量及超微结构的变化。

（3）流式细胞仪检测POF模型小鼠外周血血清及卵巢组织局部Th17细胞和Treg细胞的表达及并探讨其相关机制。

2 实验材料

2.1实验药物

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右归丸成药由湖南中医药大学第一附属医院提供，北京同仁堂生产，规格：9g/10丸，国药准字号：J20080036；交由湖南中医药大学药学院生物工程实验室制成中药水提纯液。中药换算方法：按成人体重60kg，小鼠体重20g计算，成人每日成药剂量：9g/60kg，小鼠剂量换算后约为9g×1.0÷346.68≈0.026g，即每20g小鼠每天约0.026g成药。右归丸水提纯液配置成浓度为0.13g/mL（即每0.2ml含成药0.026g）。

对照组选用雌孕激素序贯疗法，参照文献[36]：按大鼠的戊酸雌二醇日用药量为

0.12mg/kg换算，则每200g大鼠的日用药量为0.024mg,那么每20g小鼠的日用药量则为0.024×1.0÷7.04≈0.0034mg， 配成的灌胃药物浓度约为0.017mg/mL；按大鼠醋酸甲羟孕酮的用量为0.96mg/kg换算，则每200g大鼠的日用药量为0.192mg,那么每20g小鼠的日用药量则为0.192×1.0÷7.04≈0.0273mg，配成的灌胃药物浓度约为0.1365mg/mL。

戊酸雌二醇片（补佳乐片）规格为1mg/粒，由湖南中医药大学第一附属医院提供，DELPHARM Lille S.A.S公司生产，国药准字号：J20080036；醋酸甲羟孕酮片（安宫黄体酮片）规格为2mg/粒，由湖南中医药大学第一附属医院提供，浙江仙琚制药股份有限公司生产，国药准字号：H33020715。

2.2常用试剂

pZP3（小鼠透明带3多肽片段，为透明带3的第330-342个氨基酸，其序列为：Asn-Ser-Ser-Ser-Ser-Gln-Phe-Gln-Ile-His-Gly-Pro-Arg,经过HPLC分析纯度＞90%。）、弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂、FITC标记羊抗小鼠IgG荧光抗体、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、乙醇、甲醇、戊二酸、苏木精伊红染色剂、二甲苯、柠檬酸缓冲液、小鼠PE-anti-CD4抗体、小鼠FITC-anti-CD25抗体、小鼠anti-Th17抗体、Foxp3抗体、R0R-γt抗体、生物素标记的兔抗羊抗体、链霉素抗生物素一过过氧化物酶溶液、DBA显色剂等等。

2.3实验动物

SPF级BALB/c雌性小鼠90只，1月龄，体重18～22g，由湖南斯莱克景达实验动物有限公司提供，中国科学院上海实验动物中心检验。许可证号为CXK（湘）2009-0004。

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饲养条件：小鼠每笼8只，每5天更换消毒垫料一次。实验室温度22±1℃，湿度50%～70%,通风换气20～22次/h，压力梯度为20～50Kpa。实验室环境符合SPF动物实验室要求。

2.4实验仪器

Biofuge primo台式高速离心机；

Millipore公司超纯水系统；

Baker公司超净工作台；

日本电子公司JEM-1200EX型透射电子显微镜；

日本OLYMPUS BX41光学显微镜（带显微测微尺，0.01mm ）；

德国Leitz公司冰冻切片机；

Finland移液器；

Derby低温冰箱；

SKG-01电热恒温干燥箱；

XW-80A漩涡混合器YMSⅡ-28013手提式压力蒸汽灭菌器；

ET1-Max30000型DiaSorin全自动酶标检测仪；

1ml、5ml一次性注射器；

金诺天平仪器有限公司的电子天平；

英国Shandon公司的325型石蜡切片机。

3.实验方法

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3.1实验分组

按体重分层后将90只小鼠均衡的分为5组，每组18只（根据中药一般药理学研究技术指导原则中每组不少于10只和动物实验过程中出现死亡的可能，故设每组18只），设其中一组为正常组。造模成功后再将72只自身免疫性卵巢早衰小鼠按体重分层后以随机区组法的分成4组，分别为：模型组、右归丸组（简称右归组）、雌孕激素序贯疗法对照组（简称西药组）、序贯疗法加右归丸组(简称中西组)。正常组不变。

3.2 造模

3.2.1造模方法

小鼠自身免疫性POF模型建立参照文献方法[35]：称取4mg ZP3透明带多肽粉末，加入4mL三蒸水配成溶液，取2mL溶液稀释至12mL溶液，与弗氏完全佐剂按1:1比例配制成24ml免疫试剂，另取2mL溶液稀释至12mL与弗氏不完全佐剂按1:1比例配制成24mL免疫强化试剂。实验组各取0.15mL免疫试剂皮下多点注射双后脚掌及腹腔，2W后以免疫强化试剂0.15mL皮下多点注射小鼠双后脚掌及腹腔加强免疫。7d后阴道脱落细胞检查及每组随机抽取一只小鼠观察卵巢形态学及血清学改变确定造模是否成功。正常组双后脚掌及腹腔皮下多点注射生理盐水。若造模不成功则继续予免疫强化剂注射。

3.2.2 造模成功的检测方法

（1）阴道脱落细胞学检查，出现长的动情间期或一直未到动情期，即算作动情周期紊乱，有卵巢早衰可能。

（2）每组取2只小鼠处死，取卵巢称重，较正常组重量减轻。

（3）荧光免疫法检测小鼠外周血E2、FSH、LH含量。造模成功，则以上激素水平较正常组有明显差异。

（4）卵巢组织形态学观察，成熟卵泡减少，闭锁卵泡增多，卵泡结构塌陷都是卵巢早衰表现。

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3.3 给药方法

（1）右归组于造模成功后第2天予每日每20克小鼠0.2mL右归丸水提纯液灌胃,每日1次。4d一疗程，每4d休息1d，共6疗程；

（2）西药组于造模成功后第2日开始每4d予每20g小鼠0.2 mL西药补佳乐灌胃,第4d每20g小鼠加用安宫黄体酮0.2mL。4d一疗程，每4d休息1d，共6疗程；

（3）中西组于造模成功后第2d按上法分别予等量中药和西药。

（4）正常组和模型组每日予每20g小鼠0.2mL蒸馏水灌胃。灌胃疗程如前。每灌胃一周后重新称重以调整用药剂量。

3.4 实验取材

所有动物末次给药后禁食12h，乙醚麻醉，眶静脉取2mL全血，4℃静置30min后

3500r/min转速离心10min，分离血清，分装后分别置―4℃和―20℃冰箱中冷冻保存待检测。取血后断颈处死小鼠，取出双卵巢，生理盐水洗净，滤纸干燥后称重，一部分立即置液氮罐中冰冻，一部分固定于4 %多聚甲醛，待检测。

3.5 检测方法

3.5.1采用HE染色，在40倍电镜下观察小鼠卵巢组织形态学结构，计数成熟卵泡及闭锁卵泡数：无菌条件下取出卵巢组织→生理盐水冲洗血污，滤纸滤干→称重→4%多聚甲醛室温下固定→梯度酒精脱水→透明、浸蜡、包埋→常规切片后（6μm）裱于载玻片上→切片放入苏木精中染色10min→自来水冲洗20min→放入1%盐酸乙醇（盐酸一份加70%乙醇100份）中褪色→自来水漂洗、梯度酒精脱水→伊红乙醇液对比染色5min→脱水干燥→二甲苯透明、封片→电子显微镜观察卵巢组织形态结构，计数成熟卵泡及闭锁卵泡数。

3.5.2小鼠血清E2、P、FSH、LH、抗透明带抗体采用定量酶联检测法。（E2试剂盒购自

罗氏公司，P、FSH及LH试剂盒购自上海生物工程公司）

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3.5.3用RT-PCR法检测卵巢组织中Treg和Th17的表达及分布。（Th17及Trag试剂盒购自eBioscience公司）

4. 统计学处理

本实验全部数据采用SPSS18.0版统计软件包处理。计量资料用均数±标准差(X±S)表示，组间比较用单因素方差分析。计数资料用卡方检验，方差不齐者用秩和检验。（P＞0.05表示无统计学意义；P＜0.05说明有统计学意义；P＜0.01表示有显著统计学意义）

5.技术路线图

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四、毕业论文整体设计 (1) 标题 （2）目录

（3）中英文缩略词表 （4）中英文摘要 （5）前言 （6）材料与方法 （7）结果 （8）讨论 （9）结论 （10）参考文献 （11）致谢 （12）综述

五、时间安排

2010.9—2010.12 2011.1—2011.4 2011.4-2011.8 2011.9-2011.12 2012.1-2012.3 2012.4-2012.6

文献检索 文献综述购买动物 预备实验正式实验 重复实验整理资料 数据分析撰写论文 发表论文修改论文 论文答辩14

主要参考文献

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