缺氧动物模型复制及中枢神经系统功能抑制和低温对缺氧的影响

摘要目的  本实验学习复制乏氧性缺氧和血液性缺氧动物模型的方法，观察缺氧过程中呼吸的反应及血液色泽和全身一般情况的变化，并了解温度和中枢神经系统机能状态对缺氧耐受的影响以及对照实验和控制实验条件的重要性。方法  通过测定耗氧量和小鼠的存活时间来观察中枢神经系统功能抑制和低温对缺氧的影响。通过复制乏氧性缺氧、CO中毒、注射NaNO₂及注射NaNO₂和美蓝的动物模型，来观察不同缺氧类型动物在缺氧过程中呼吸、黏膜和血液色泽的变化。结果　注射生理盐水的小鼠的存活时间为24.63±7.29min, 注射氯丙嗪的小鼠的存活时间为45.75±13.64 min,两者相比有高度显著性差异（P<0.01）。注射生理盐水的小鼠的耗氧量为14.59±2.92 ml，注射氯丙嗪的小鼠的耗氧量为9.64±3.61 ml。注射生理盐水的小鼠的耗氧率0.03±0.012 (ml/g/min), 注射氯丙嗪的小鼠的耗氧率为0.01±0.004 (ml/g/min)，两者相比有高度显著性差异（P<0.01）。在复制乏氧性缺氧、CO中毒、注射NaNO₂、注射NaNO₂和美蓝的动物模型过程中，CO中毒的小鼠比乏氧性缺氧小鼠的存活时间短，注射NaNO₂小鼠比注射NaNO₂和美蓝的小鼠存活时间短。结论　中枢神经系统功能抑制并处于低温的小鼠对缺氧耐受性增强。不同缺氧模型有不同的死亡表现和死亡后体征。

1. 材料和方法

1.1 中枢神经系统功能抑制和低温对缺氧的影响

1.1.1实验动物  小鼠(mouse)

1.1.2药品  0.25%氯丙嗪(chlorpromazine) 、钠石灰（soda Lime)

1.1.3器材  密闭瓶、注射器，测耗氧装置（oxygen consumption gauge）

           

              图1                                  图2

1.1.4方法 取性别相同、体重相近的小鼠2只，准确称取其体重。按随机分配的原则，将其中1只小鼠做为实验组，另一只作为对照组。实验组按0.1ml/10g体重腹腔内注射2.5g/L氯丙嗪，安放在 冰浴的纱布上10～15min，使呼吸频率降为70～80次/min；对照组鼠按0.1ml/10g体重腹腔注射生理盐水，室温放置10～15min。将2只鼠分别放入100mL的广口瓶内，按图1连接测耗氧装置。

1.2缺氧动物模型的复制

1.2.1实验动物  小鼠(mouse)

1.2.2药品  钠石灰（soda lime) 亚硝酸钠（ sodium nitrite ) 、亚甲基蓝(美蓝）（methylene blue）、 0.9％NaCl (physiological saline solution) 、 CO(carbon monoxide)。

1.2.3装置：  缺氧装置（hypoxic gauge）

1.2.4方法  

1.2.4.1将小鼠随机分为乏氧性缺氧组和一氧化碳中毒组。乏氧性缺氧组小鼠放入含有5g钠石灰的100ml密闭瓶中；一氧化碳中毒组小鼠放入500ml密闭瓶，注入10ml CO气体。

1.2.4.2将小鼠随机分为亚硝酸钠组和亚硝酸钠治疗组。亚硝酸钠组小鼠腹腔注射50g/L亚硝酸钠0.2ml；亚硝酸钠治疗组小鼠腹腔注射50g/L亚硝酸钠0.2ml后即刻腹腔注射10g/L亚甲基蓝0.2ml 。

1.2.4.3记录实验前和实验过程中小鼠呼吸频率（每5min观察1次，次数/10秒）及行为（挣扎、痉挛）和耳、唇、尾的颜色。记录死亡时间和死亡小鼠肝脏颜色.

2.观察项目

2.1  在中枢神经系统功能抑制和低温对缺氧的影响试验中，从密闭测耗氧装置开始计时至鼠死亡，记录小鼠存活时间，用测耗氧装置测定总耗氧量(A)。根据总耗氧量A(mL)、存活时间T(min)、鼠体重W(g)三项指标，求出总耗氧率R[mL/(g·min)]：

                 R[mL/(g·min)]＝A(mL)÷W(g) ÷T(min)

列各项指标的原始数据表并进行统计处理，数据以X±S表示，对实验组和对照组的T、R做t－检验。

2.2  记录实验前和实验过程中小鼠呼吸频率（每5min观察1次，次数/10秒）及行为（挣扎、痉挛）和耳、唇、尾的颜色。记录死亡时间和死亡小鼠肝脏颜色。

3.结果

3.1 中枢神经系统功能抑制和低温对缺氧的影响

注射生理盐水的小鼠的存活时间为24.63±7.29min, 注射氯丙嗪的小鼠的存活时间为45.75±13.64 min,两者相比有高度显著性差异（P<0.01）。注射生理盐水的小鼠的耗氧量为14.59±2.92 ml，注射氯丙嗪的小鼠的耗氧量为9.64±3.61 ml。注射生理盐水的小鼠的耗氧率0.03±0.012 (ml/g/min), 注射氯丙嗪的小鼠的耗氧率为0.01±0.004 (ml/g/min)，两者相比有高度显著性差异（P<0.01）。（见表1）

注：数据以x±s表示，采用t检验；*P<0.01, **P<0.01，与生理盐水比较

3.2 缺氧动物模型的复制

注：数据以x±s表示

3.3 亚硝酸盐中毒及其美兰的治疗效果

注：数据以x±s表示，采用t检验；P<0.01

3.4 不同原因缺氧小鼠皮肤及肝脏颜色的特征变化

4.讨论(discussion)

4.1  影响机体对缺氧耐受的因素主要有两点，代谢耗氧率和机体的代偿能力。^[1]氯丙嗪具有神经安定作用，它对中枢神经系统有较强的抑制作用，而且氯丙嗪有降温作用，动物试验中，氯丙嗪能明显减少自发活动，诱导入睡，但动物对刺激有良好的觉醒反应，与巴比妥类催眠药不同，加大剂量也不会引起麻醉；氯丙嗪能减少动物的攻击行为，使之驯服，易于接近。^[2]注射氯丙嗪后冰浴使机体处于低温环境下，体温下降，同时神经系统受到抑制，两者结合就能通过降低集体耗氧率使动物对缺氧的耐受性升高。^[1]

4.2 　乏氧性缺氧，主要表现为动脉血氧分压降低，氧含量减少，组织供养不足。正常毛细血管血液中氧离血红蛋白浓度约为26g/L。乏氧性缺氧时，动、静脉血中的氧离血红蛋白浓度增高。当毛细血管血液中氧离血红蛋白浓度达到或超过50g/L时，可使皮肤和粘膜呈青紫色。抑制动物动物中枢神经系统功能和降低体温，降低其代谢率可增加机体的耐受缺氧性。^[3]解剖小鼠后观察到乏氧性缺氧的小鼠耳、尾、口唇颜色呈青紫色，肝呈暗红。

4.3 　一氧化碳（CO）与血红蛋白的亲和力比氧与血红蛋白的亲和力高210倍。当吸入气中含0.1％的CO时，血液中的血红蛋白可能有50％为碳氧血红蛋白。HbCO不能与O₂结合，同时还可抑制红细胞的糖酵解，使2，3－二磷酸甘油酸生成减少，氧离曲线左移，HbO₂中的氧气不易释放，从而加重组织缺氧。当血液中的HbCO增加至50％时，动物可迅速出现痉挛，呼吸困难，昏迷，甚至死亡。此时，动物的动脉血含过多的HbCO，其皮肤，粘膜呈樱桃红色。^[3]解剖小鼠可以观察到CO中毒的小鼠耳、尾、口唇颜色鲜红，肝呈樱桃红色。

4.4  亚硝酸盐可使血红素中的二价铁氧化成三价铁，形成高铁血红蛋白，导致高铁血红蛋白血症。高铁血红蛋白中的三价铁因与羟基结合牢固而失去结合氧的能力，或者血红蛋白分子中的四个二价铁中有部分氧化成三价铁，剩余的二价铁虽能结合氧，但不易解离，导致氧离曲线左移，使组织缺氧。低浓度美蓝为还原剂，可抑制氧化剂的中毒反应。亚硝酸盐等氧化剂中毒时，如高铁血红蛋白含量超过血红蛋白总量的10％，就可出现缺氧表现，当血液中的HbFe³⁺OH达到15g/L时，皮肤和粘膜可出现青紫色；当达到30％－50％时，则发生严重缺氧。^[3]实验中亚硝酸盐中毒性缺氧的小鼠只存活了8分钟，而注射亚硝酸盐中毒性+美兰的小鼠存活了70分钟，解剖后观察到的小鼠脏器颜色，这些都完全符合理论分析。

4.5 密闭瓶中的小鼠在缺氧过程中，小鼠外周化学感受器在动脉血PaO₂降低、PaCO₂升高和H^＋浓度升高时发生兴奋，冲动最终传入延髓，反射性的引起呼吸加深加快，^[4]此外缺氧过程中小鼠会挣扎、颤抖等，这些原因可能使呼吸频率的技术有所偏差。

5.参考文献

[1] Chen Ji-qiang（陈季强）﹒基础医学教程各论（上）﹒20##年8月第一版﹒北京：科学出版社，2004.8：P505

[2] Chen Ji-qiang（陈季强）﹒基础医学教程各论（下）﹒20##年9月第一版﹒北京：科学出版社，2004.9：P337

[3] Lu Yuan，Xia Qiang（陆源, 夏强）﹒生理科学实验﹒20##年7月第二版﹒杭州：浙江大学出版社，2006.7：P 240-241

[4] Chen Ji-qiang（陈季强）﹒基础医学教程各论（上）﹒20##年8月第一版﹒北京：科学出版社，2004.9：P461

第二篇：缺氧

不同类型缺氧小鼠观察

实验目的

1． 在动物身上复制乏氧性、血液性、组织中毒性缺氧，并了解缺氧分类。

2． 观察缺氧对呼吸的影响和血液颜色的变化。

3． 掌握各种类型缺氧的概念、发生机制及特点。

实验动物

小白鼠，体重20—25克，雌雄不拘。

实验步骤

1． 正常对照组 取正常小鼠一只，观察动物的一般情况，呼吸频率及幅度，皮肤和口唇的颜色，然后处死动物。

2． 乏氧性缺氧 取钠石灰少许（约5克）及小鼠一只放入缺氧瓶中，塞紧瓶塞。观察动物的一般情况，呼吸频率及幅度，皮肤和口唇的颜色，以后每3分钟重复观察上述指标一次（如有其他变化则随时记录），直到动物死亡。动物尸体留待实验完毕后，再依此打开其腹腔，比较血液或肝脏颜色。

3． 一氧化碳中毒性缺氧 将小鼠一只放入广口瓶中，观察其正常表现，然后抽取5ml CO注入广口瓶内，观察动物的一般情况，呼吸频率及幅度，皮肤和口唇的颜色，死亡时间。

4． 亚硝酸钠中毒性缺氧 取体重相近的小鼠2只，观察正常表现后，向腹腔注入5%亚硝酸钠0.3ml，其中一只注入亚硝酸钠后，立即向腹腔内注入1%美兰溶液0.3ml，另一只注入生理盐水0.3ml。观察指标与方法同上，比较两鼠的表现及死亡时间有无差异。

5． 氰化物中毒性缺氧 取小鼠两只，观察其正常表现后，腹腔注射0.1%KCN0.2ml，观察动物的一般情况，呼吸频率及幅度，皮肤和口唇的颜色，待动物出现四肢软瘫时立即取一只向腹腔注入10%硫代硫酸钠0.4ml，另一只注入等量生理盐水，记录死亡时间。

6． 依此打开1—5项实验后小鼠尸体腹腔，比较血液或肝脏颜色。

实验结果

思考题 各型缺氧对呼吸有何影响？血液颜色有无不同？为什么？

实验设计原理

一．乏氧性缺氧

乏氧性缺氧的常见原因有大气中氧分压降低（高空或高原缺氧）和呼吸系统疾病（呼吸性缺氧），其共同特征是动脉氧分压（PaO2）、氧含量和血氧饱和度降低。本实验将小鼠放入盛有钠石灰（NaOH.CaO）的密闭缺氧瓶中，以模拟大气中氧分压降低引起的乏氧性缺氧。

小鼠放入盛有钠石灰（NaOH.CaO）的密闭缺氧瓶中，由于瓶内氧气逐渐被小鼠利用，而呼出的CO2被钠石灰吸收，因此缺氧瓶内空气的氧分压逐渐降低，而不伴有CO2浓度的增加，所以此种类型的缺氧为乏氧性缺氧。钠石灰吸收CO2和水蒸气的反应式为：

NaOH.CaO+H2O+CO2 ———→NaHCO3+Ca(OH)2

二血液性缺氧

血红蛋白（Hb）含量减少（贫血）或性质改变，使血液携氧能力下降，从而供给组织的氧不足所导致的缺氧为血液性缺氧。本实验用一氧化碳中毒和亚硝酸钠中毒，使血红蛋白变性复制血液性缺氧。

1． 一氧化碳（CO）中毒 给缺氧瓶中注入CO后，CO与Hb结合形成碳氧血红

蛋白（Hb-CO），从而使Hb失去同氧结合的能力，而引起缺氧。

2． 亚硝酸钠（NaNO2）中毒 NaNO2为一强氧化剂，进入体内后可使Hb分子中

的二价铁离子（Fe2+）氧化为三价铁(Fe3+)， 形成高铁血红蛋白即变性蛋白（MHb），从而失去结合氧的能力。

NaNO2

—————→

Hb-Fe2+ 氧化 Hb-Fe3

( Hb) (MHb)

本实验将NaNO2溶液注入小鼠腹腔内，复制MHb导致的血液性缺氧。同时取另一只小鼠，用美蓝作为还原剂对抗NaNO2的作用，以使MHb中的Fe3+重新还原为Fe2+，恢复带氧能力，解除缺氧。

美蓝

MHb-Fe3+ ——————→ Hb-Fe2+

（还原）

三．组织中毒性缺氧

此型缺氧是组织细胞用氧障碍，即组织细胞不能利用氧进行新陈代谢，使生物氧化过程中断。常见原因有组织中毒或维生素缺乏，使细胞线粒体氧化还原酶系统受毒物抑制或氧化酶系统缺乏必需原料，而使组织氧化过程发生障碍。

本实验将KCN注入小鼠腹腔，造成组织中毒。氰化物进入体内，释出CN-，易与细胞线粒体内氧化型细胞色素氧化酶中的Fe3+结合，形成氰化高铁细胞色素氧化酶, (CN-+Cyt-Fe3+-—→Cyt-Fe3+-CN)从而失去传递电子的功能，呼吸链中断，引起细胞内窒息，造成组织中毒性缺氧。

本实验用10%硫代硫酸钠 Na2S2O3 进行抢救。注射Na2S2O3 后，硫代硫酸钠在体内转硫酶作用下，使游离的和已结合的氰基变成基本无毒的硫氰酸盐（SCN基化合物）而随尿排出体外。硫氰酸盐毒性仅为氰化物的1/200。

转硫酶

Na2S2O3 + CN- ————————→ Na2SO3 （亚硫酸钠）+SCN-