一 实验光学显微镜的操作及测微尺的使用
一、实验目的
1. 掌握光学显微镜的结构、原理，学习显微镜的操作方法和保养
2.观察细菌的形态，并学会测量细菌的大小。
二、实验原理
1．显微镜的结构和各部分的作用
显微镜分机械装置和光学系统两部分(图1—1)。
(1)机械部分
①镜筒：镜筒上端装目镜，下端接转换器。镜简有单筒和双筒两种。双筒者可调节两筒之间的距离，以适应不同瞳距者使用。
②转换器：转换器装在镜筒的下方，其上有3个孔，有的有4个或5个孔。不同规格的物镜分别安装在各孔上。
③载物台：载物台是放置标本的平台，中央有一圆孔，使下面的光线可以通过。两旁有弹簧挟用以固定标本或载玻片。有的载物台上装有自动推物器。
④镜臂：镜臂支撑镜筒、载物台、聚光器和调节器。镜臂有固定式和活动式(可改变倾斜度)两种。
⑤镜座：镜座为马蹄形，支撑整台显微镜，其上有反光镜。
⑥调节器：调节器包括大、小螺旋调节器(调焦距)各一个。可调节物镜和所需观察的物体之间的距离。
(2)光学部分
①目镜：一般使用的显微镜具有2—3个目镜，其上常刻有“5x”、“l0x”或“15x”等数字及符号，意即使用时可放大5倍、l0倍或15倍。观察微生物时常用放大l0倍或15倍的目镜。
②物镜：物镜装在转换器上，可分低倍镜、高倍镜和油镜三种，其相应的放大倍数常是10、40、100。物镜的性能由数值孔径(numerical aperture，N．A．)决定，数值孔径＝n.sinα/2．其意为玻片和物镜之间的折射率n乘上光线投射到物镜上的最大夹角α的一半
的正弦。光线投射到物镜的角度越大，显微镜的效能越大，该角度的大小决定于物镜的直径和焦距。n是影响数值孔径的因素，显微镜的总放大倍数为物镜放大倍数和目镜放大倍数的乘积。
⑦聚光器：聚光器安装在载物台的下面．反光镜反射来的光线通过聚光器被聚集成光锥照射到标本上，可增强照明度，造成适宜的光锥角度，提高物镜的分辨力。聚光器可上、下调节，以求得最适光度。案光器还附有虹彩光圈，推动把手可随意调整透进光的强弱。合理调节案光器的高度和光圈的大小，可得到适当的光照和清晰的图像。
④反光镜：反光镜装在镜座上，有平、凹两面，光源为自然光时用平面镜，光源为灯光时用凹面镑。它可自由转动方向。反光镜可反射光线到聚光器上。有的显微镑不具反光镜，使用的是电光源。
⑤滤光片：可见光由各种颜色的光组成，不同颜色的光线波长不同。如只需某一波长的光线时，就要用滤光片。选用适当的滤光片，可以提高分辨力，增加影像的反差和清晰度。滤光片有紫、青、蓝、绿、黄、橙、红等各种颜色，分别透过不同波长的可见光，可根据标本本身的颜色，在聚光器下加相应的滤光片。
三、实验装置与设备
1.实验设备
（1）生物显微镜。
（2）测微尺
四、实验步骤
1．显微镜使用方法
(1)低倍镜的使用法
a.置显微镜于固定的桌上。
b.旋动转换器，将低倍镜移到镑筒正下方，和镜筒对直。
c.转动反光镜向着光源处，同时用眼对准目镜仔细观察，使视野亮度均匀。
d.将标本片放在载物台上，使观察的目的物置于圆孔正中。
e.将粗调节器向下旋转(或载物台向上旋转)，眼睛注视物镜，以防物镜和载玻片相碰。当物镜的尖端距载玻片约0.5cm处时停止旋转。
f.左眼向目镜里观察，将租调节器向上旋转，如果见到目的物．但不十分清楚，可用细调节器调节，至目的物清晰为止。
g.如果粗调节器旋转得太快，使超过焦点，必须从第e步重调，不应正视目镜情况下调粗调节器，以防没把握的旋转使物镜与载玻片相碰撞坏。
h.观察时两眼同时睁开，如用左眼看显微镜，有眼看桌上纸张，便可一面看一面画出所看到的物像。
(2)高倍镜的使用法
①使用高倍镜前，先用低倍镜观察，发现目的物后将它移至视野正处。
②旋动转换器换高倍镜，如果高倍镜触及载玻片应立即停止旋动，说明原来低倍镜就没有调准焦距，目的物并没有找到，要用低倍镜重调。如果调对了,换高倍镜时基本可以看到目的物若有点模糊，用细调节器就清晰可见。
(3)油镜的使用方法
①如果用高倍镜目的物未能看清，可用油镜。高倍镜检查标本片，将目的物移到视野正中。
②在载玻片上滴一滴香柏油(或液体石蜡)，将油镜移至正中使油镜镜头浸没在油中，刚好贴近载玻片。用细调节器微微向上调(切记不用粗调节器)即可。
③用油镜观察完毕，用擦镜纸将镜头上的油擦净、纸蘸少许二甲苯擦试镜头，再用擦镜纸揩干。
(4)显微镜的保护法
①显微镜应放在干燥的地方，使用时需避免强烈的日光照射。
②物镜和目镜不清洁时，应当用擦镜纸或软绸揩干。
③用完显微镜后，应当立即放到镜匣中。
2．目测微尺、物测微尺及其使用方法
(1)目测微尺 目测微尺是一圆形玻片，其中央刻有5mm长的、等分为50格(或100格)的标尺，每格的长度随使用目镜和物镜的放大倍数及镜筒长度而定。使用前用物测微尺标定，用时放在目镜内。
(2)物测微尺 物测微只是一厚玻片。中央有一圆形盖玻片。中央刻有1mm长的标尺，等分为100格，每格为10um，用以标定目测微尺在不同放大倍数下每格的实际长度。
(3)目测微尺的标定 将目测微尺装入目镜的隔板上，使刻度朝下；把物测微尺放在载物台上使刻度朝上，用低倍镜找到物测微尺的刻度，移动物测微尺和目测微尺使两者的第一条线重合，顺着刻度找出另一条重合线。再求出高倍镜下目测微尺每格的长度。
(4)菌体大小的测量 将物测微尺取下，换上标本片，选择适当的物镜测量目的物大小，分别找出菌体的长和宽占目测微尺的格数，再按目测微尺l格的长度算出菌体的长度和宽度。
3．细菌个体形态的观察
(1)严格按光学显微镜的操作方法，依低倍、高倍及油镜的次序观察各示范片，并用铅笔分别绘出其形态图。
(2)选择一种细菌，量出其尺寸。
五、实验结果
1．结果
分别绘出在显微镜下观察到的细菌形态，及细菌的尺寸。
六、实验结果讨论
(1)镜检玻片标本时，为什么要先用低倍物镜观察，而不是直接用高倍物镜或油镜观察?
(2)用油镜观察时．为什么要在载玻片上满加香柏油?
(3)为什么目测微尺必须用物测微尺标定?在某一放大倍数下，标定了目测微尺，如果放大倍数改变，它还需重新标定吗?
实验二 原生动物及微型后生动物的观察
一、实验目的
1．建立对活性污泥及常见微生物的感性认识，掌握微生物活体观察技术；
2．掌握根据微生物种类数量判别活性污泥的状况。
二、实验原理
污水处理厂活性污泥中含有大量的原生动物及微型后生动物，这些原生动物及微型后生动物可作为污泥活性的指示生物。利用生物显微镜对原生动物及微型后生动物进行观察，根据其种类和数量可判定活性污泥的活性。
三、实验装置与设备
1．显微镜。
2．活性污泥。取自污水处理厂曝气池。
3．l00mL量简、载玻片、盖玻片、玻璃小吸管、橡皮吸头、镊子。
四、实验步骤
1．肉眼观察
取曝气他的混合液置于100ml量筒内，直观活性污泥在量筒中呈现的絮绒体外观及沉降性能(30min沉降后的污泥体积)。
2．制片
取活性污泥法曝气池混合液一小滴，放在洁净的载玻片中央(如混合液中污泥较少，可待其沉淀后，取沉淀污泥一小滴加到载玻片上；如混合液中污泥较多，则应稀释后进行观察)。加盖玻片时应使其中央已接触到水滴后才放下，否则会在片内形成气泡，影响观察。
3．镜检
在显微镜下低倍或高倍下观察生物相。
(1)污泥茵胶团絮绒体 形状、大小、稠密度等。
(2)丝状微生物 伸出絮绒体外的多寡。
(3)微型动物 微型动物的识别参阅教材。
五、实验结果
列举镜检的主要生物相，并绘制其生物图。
六、实验结果讨论
根据实验观察情况，试对污水厂活性污泥质量及运行情况作初步评价。
实验三 微生物细胞的计数
一、实验目的
1．掌握血球计数板的原理和使用方法；
2．能熟练使用血球计数半对微生物细胞悬液进行细胞计数。
二、实验原理
血球计数板(图3-1)是由一块比普通玻片厚的特制玻片制成的。玻片中央刻有四条槽，中央两条槽之间的平面比其他平面略低，中央有一小槽，槽的两边的平面上备刻有9个大方格，中间的一个大方格为计数室，它的长相宽各为1mm，深度为0.1mm，其体积为0.1mm3。计数室有两种规格：
一种是大方格分成16中格，每一中格分成25小格，共400小格；另一种是把一大方格分成25中格，每一中格分成16小格，总共也是400小格。计算方法如下：
(1)16x25的计数板计算公式
细胞数／m1＝（100小格细胞数/100）x400xl0 xl000x稀释倍数
(2)25x16的计数板计算公式
细胞数／m1＝（80小格细胞数/80）x400xl0xl000x稀释倍数
三、实验装置与设备
显微镜、血球计数板、移液管、酵母菌液。
四、实验步骤
1．稀释样品。为了便于计数，将样品适当稀释，使每格约含5个细胞。
2．取干净的血球计数板，用厚盖玻片盖住中央的计数室，用移液管吸取少许充分格匀的待测苗液于盖玻片的边缘，菌液则自行渗入计数室，静置5—10min即可计数。
3．将血球计数板置于载物台上，用低倍镜找到小方格网后换高倍镜观察计数。需不断地上、下旋动细调节器，以便看到计数室内不同深度的菌体。现以16x 25规格的计数板为例，数四个角(左上、右上、左下、右下)的四中格(即l00小格)的酵母菌数。如果是25x16规格的计数板，除取四个角上四中格外，还取正中的一个中格(即80小格)，对位于格线上的酵母菌只计格的上方及左方线上的酵母茵，或只计下方及右方线上的酵母菌。
每个样品重复计数3次，取平均值，再按公式计算每1m1菌液中所含的酵母菌数。
五、实验结果
将实验结果计入下表：
六、实验结果讨论
根据实验体会，说明用血球计数板进行微生物计数时，其误差来自哪些方面？如何避免?
实验四 微生物纯种分离及初步鉴定（综合性实验）
一、实验目的
该综合性试验包括以下内容：
（1）培养基的配制与高压蒸汽灭菌：目的是让学生建立微生物营养的概念，掌握营养琼脂培养基的制备方法和灭菌原理、方法，初步建立微生物试验的“无菌操作观念”。
（2）细菌纯种分离、培养和接种技术：目的是让学生掌握从环境中分离微生物纯种，掌握纯种菌种的培养接种技术，）进一步树立无菌观念，学会无菌操作的实验技术。
（3）细菌纯种的菌体、菌落形态的观察：目的是让学生建立对细菌菌落的感性认识，掌握对细菌菌落形态的描述方法，并通过菌落特征初步对细菌进行分类。
（4）微生物的染色：目的是让学生掌握细菌革兰氏染色的原理及方法，对细菌进行革兰氏染色的阴阳性鉴定。
（5）过氧化氢酶的定性测定：通过此实验对纯种分离的细菌进行过氧化氢酶的阴阳性判定，加深对细菌胞外酶催化生物化学反应的感性认识。
二、实验装置与设备
1．培养基的配制与高压蒸汽灭菌：
(1)培养皿(直径90mm)、试管、吸管、锥形瓶、烧杯
(2)纱布、棉花、报纸、牛皮纸。
(3)pH试纸、洗液、10％HCl、10％NaOH。
(4)牛肉膏、蛋白胨、氯化纳、琼脂、蒸馏水。
(5)高压蒸汽灭菌器、烘箱、冰箱、电炉等。
2.细菌纯种分离、培养、接种技术、菌落观察：
(1)无菌培养皿(直径90cm)10套，无菌移液管1ml2支、10m11支。
(2)营养琼脂培养基1瓶．活性污泥或土壤或湖水
菌稀释水90mLl瓶、9mL的5管。
(3)接种环、酒精灯、恒温箱。
3.革兰氏染色
(1)显微镜、香柏油(或液体石蜡)、二甲苯、擦镜纸、接
种环、载玻片、酒精灯。
(2)草酸铵结晶紫染液、革氏碘液、95％乙醇、番红染液。
三、实验步骤
1．培养基的配制与高压蒸汽灭菌：
a．玻璃器皿的洗涤与包装
(1)洗涤 玻璃器皿在使用前必须洗涤干净。培养皿、试管、锥形瓶等可用去污粉或肥皂洗刷，并用自来水冲净。移液管先用洗液浸泡，再用水冲洗干净。洗刷干净的玻璃器皿自然晾干或放入烘箱中烘干备用。
(2)包装
①培养皿由一底一盖组成一套，按实验所需的套数一起用皮纸包装。
②吸管应在吸端用铁丝塞入少许棉花，构成l-1.5cm长的棉塞（以防细菌吸入口中，并避免将口中细菌吹入管内)。棉塞要塞得松紧适宜，吸时既能通气，又不致使棉花滑入管中。将塞好棉花的移液管的尖端，放在4—5cm宽的长纸条的一端,移液管与纸条约成30°夹角，折叠包装纸包住移液管的尖端(图4-1)，用左手将移液管压紧，在桌面上向前搓转，纸条螺旋式地包在移液管外面，余下纸头折叠打结。按实验需要，可单支包装或多支包装，待灭菌。
③试管和锥形瓶等的管日或瓶口均需用棉塞堵塞。
做好的棉塞，四周应紧贴管壁和瓶口，不留缝隙，以防空气中微生物会沿棉塞皱折浸入。棉塞不宜过松或过紧，以手提棉塞，管、瓶不掉下为准。棉塞的2／3应在管内或瓶口内，上端露出少许，以便拔塞。棉塞的大小及形状应如图4—2所示。待灭菌的试管和瓶子的口都要用牛皮纸包裹，并用线绳捆扎后存放在铁丝篓内(用纸包裹是为了避免灭菌时冷凝水淋湿棉塞)，以备灭菌。
b．培养基的制备
(1)步骤
①配制溶液：取一定容量的烧杯盛入定量无菌水，按培养基配方(见附录三)逐一称取各种成分，依次加入水中溶解，难溶的物质，例如蛋白陈、肉膏等可加热促进溶解，待全部溶解后，加水补充加热蒸发的水量。加热对应不断搅拌以防原料在杯底烧焦。
②调节PH：用PH试纸测定培养基溶液的pH。按要求以l0％Hcl或10％NaoH调整至所需的PH。
③过滤：用纱布、滤纸或棉花过滤均可。如培养基内杂质很少，可省略过滤。
④分装：按图4-3所示，将培养基分装于试管或锥形瓶中(注意防止培养基沾污管口或瓶口，避免浸湿棉塞引起杂菌污染)，装入试管的培养基量视试管的大小及需要而定，一般制斜面培养基时，每支试管装量为试管高度的1/4—1/3。
⑤斜面培养基的制作：将装有琼脂培养基的已灭菌的试管趁热取出，斜置于木棒(或橡皮管)上，使试管内的培养基斜面长度为试管长度的l/3—1/2，待培养基凝固后即成斜面(图4-4)。
(2)营养琼脂培养基的制备
①培养基配方：牛肉膏0.75g，蛋白陈1.5g，0.75g，琼脂3g，蒸馏水150mL， pH7.6。0.1MPa下灭菌 20min。
②操作：
取300ml的烧杯一个，装150m1蒸馏水。
在药物天平上依次称取配方中各成分，放入水中溶解，待琼脂完全融合后停止加热，补足蒸发损失的水量。用10％NaOH调整pH至7.6，本实验省略过滤。将培养基分装5支试管中，其余的全部倒入250ml的锥形瓶中，分别塞上棉塞，包扎好待灭菌。
c．无菌水的制备
(1)取一个250m1的锥形瓶装90(99)ml蒸馏水，塞棉塞，包扎，待灭菌。
(2)另取5支18mm×180mm的试管，分别装9ml蒸馏水，塞棉塞，包扎，待灭菌。
d．灭菌
灭菌是用物理、化学因素杀死全部微生物的营养细胞和它们的芽孢{或孢子)。消毒和灭菌有些不同，它是用物理、化学因素杀死部分或全部微生物的营养细胞及一部分芽抱。
灭菌的操作过程
①使用前，先在灭菌锅内加入适量的水．然后把灭菌的物品放入锅内，盖上锅盖，对称地拧紧螺栓，以防漏气。
②在灭菌锅底部加热、同时打开排气阀、待自徘气阀冒热气3—5min后关闭。至压力表所示压力升至所需压力时开始计时。通过调整热源，而维持一定的疙力。达到灭菌时间后，停止加热。
③待锅内蒸汽全部排完后（压力表示零)，方可打开排气阀，打开锅盖，取出灭菌物。如果压力末达到零就打开排气阀，就会因锅内压力突然下降，使容器内的培养基由于内外压力不平衡而冲出烧瓶口或试管口，造成棉塞沾染培养基而发生污染。
④将灭菌后的培养基置于37℃恒温箱中2物，作无菌培养，若无菌生长，可保存备用。
2. 细菌纯种分离、培养、接种技术、菌落观察：
(1)平板划线分离法
①平板的制作：将融化并冷至50℃的营养琼脂培养基10-15ml倒入无菌培养皿内，使凝固成平板。
②划线：以无菌操作，右手持经酒精灯灭菌冷却的接种环挑一环活性污泥(或土壤悬液)。同时左手持培养皿，以中指、无名指和小指托住皿底，拇指和食指夹住皿盖稍倾斜，左手拇指和食指将皿盖掀起半开，右手将接种环伸入培养皿内，在平板上轻轻划线(切勿划破培养基)，划线的方式可取图4-5任何一种；划线完毕盖好皿盖，倒置，于30℃恒温箱中培养48h后观察结果。
(2)接种斜面培养基
接种前将桌面擦净，将所需的物品整齐有序地放在桌上。
将试管贴上标签，注明接种日期、接种人、组别、姓名等。
点燃酒精灯。先将棉塞拧松动，以便接种时拔出。
在火焰旁，右手持经酒精灯灭菌冷却的接种环(环以上凡是可能进入试管的部分都应灼烧)，同时左手持培养皿，以中指、无名指和小指托住皿底，拇指和食指夹住皿盖稍倾斜，左手拇指和食指将皿盖掀起半开，右手将接种环伸入培养皿内，在平板单菌落上轻轻挑取少许菌种，将接种环停留在无菌范围内，放下平板，拿起待接种试管，用右手小指、无名指和手掌夹住棉塞将它拔出。试管口在火焰上微烧一周，将管口上可能沾染的少量菌或带菌尘埃烧掉。将挑取菌种的接种环伸入试管底部，在斜面上由底部向上划曲线。抽出接种环，将试管塞上棉塞并插在试管架上，最后再次烧红接种环，则接种完毕，置于30℃恒温箱中培养24-36h后观察。
(3)菌落形态特征的观察
由于微生物个体表面结构、分裂方式、运动能力、生理特性及产生色素的能力等各不相同，个体及它们的群体在固体培养基上生长状况各不一样。按照微生物在固体培养基上形成的菌落特征，可粗略辨别是何种类型的微生物。应注意菌落的形状、大小、表面结构、边缘结构、菌丛高度、颜色、透明度、气味、粘滞性、质地软硬情况、表面光滑与粗糙情况等。通常，细菌菌落多为光滑型，湿润，质地软、表面结构特征很多，具各种颜色。但也有干燥粗糙的，甚至呈霉状但不起绒毛。酵母菌菌落呈圆形，大小接近细菌，表面光滑，质地软，颜色多为白色和红色。放线菌的菌落硬度较大，干燥致密，且与基质结合紧密，不易被针挑取。菌落表面呈粉状或皱折，呈龟裂状，具有各种颜色，且正面和背面颜色不同。霉菌菌落长成绒状或棉状，能扩散生长，疏松，用接种环很易挑取。
对微生物在斜面培养基上生长的特征进行详细的观察，观察菌落生长旺盛程度、形状、颜色及光泽等。
3.革兰氏染色
(1)涂片 取干净的载玻片于实验台上，在正面边角做个记号并滴一滴无菌蒸馏水于裁玻片的中央，将接种环在火焰上烧红，待冷却后从斜面桃取少量纯培养菌种与玻片上的水滴混匀后，在载玻片上涂布成一均匀的薄层，涂布面不宜过大(注：活性污泥染色是用滴管取一滴活性污泥于载玻片上铺成一薄层即可)。
(2)干燥 在空气中自然干燥，使菌体的位置不再移动(也可将玻片置酒精灯火焰高处稍稍加热以干燥之，涂抹面应向上)。
(3)固定 将已干燥的涂片正面向上，在微小的火焰上通过2-3次，由于加热使蛋白质凝固而固着在载玻片上。
(4)用草酸铵结晶紫染色lmin，水洗。
(5)加革氏碘液媒染lmin，水洗。
(6)斜置载玻片于一烧杯之上，滴加95％酒精脱色，至流洗出的酒精不呈现紫色时，立即用水冲净酒精，脱色时间约20min，或视涂片厚簿而赂有差异。
(7)用番红(或称沙黄)染液染色l-2min，水洗。
(8)吸干，置于显微镜下观察，阳性者为紫色，阴性者为红色。
革兰氏染色的关键在于严格掌握酒精脱色程度。如脱色过度，则阳性菌可被误染为阴性菌；而脱色不够时．阴性菌可被误染为阳性菌。此外，菌龄也影响染色结果，如阳性菌培养时间过长，或巳死亡及部分菌自行溶解了，都常呈阴性反应。
4.过氧化氢酶定性测定
（1）将制备的微生物斜面放在试管架上
（2）用滴管吸取过氧化氢滴加入斜面上，有气泡产生的为接触酶阳性(有过氧化氢酶)；无气泡产生的为接触酶阴性(无过氧化氢酶)。
四、实验结果
1.绘出菌落形态，并进行文字描述。
2.镜检并绘制与菌落对应的细菌形态，并标明是革兰氏阳性菌还是革兰氏阴性菌，是过氧化氢酶阳性还是过氧化氢酶阴性。
五、实验结果讨论
1.怎样检查培养基灭菌是否彻底?
2.微生物的染色原理是什么?
3.微生物经固定后是死的还是活的?
4.过氧化氢酶是胞外酶、胞内酶还是表面酶，产气泡的原因是什么？