南昌大学实验报告

学生姓名：   叶落不晓       学    号： 6002212025    专业班级： 给排水121班         

实验类型：√ 验证□ 综合□ 设计□ 创新  实验日期：20##-12-02～09  实验成绩：           

水处理微生物学实验实验设计：

水体中总大肠菌群的检验

一、实验目的和要求

1．掌握多管发酵法测定水中大肠菌群的技术；

2、通过大肠杆菌群的测定，了解大肠杆菌群的生化特性；

3、学习使用大肠菌群检数表；

3、进一步巩固光学显微镜的使用方法。

二、实验基本原理

总大肠菌群可用多管发酵法或滤膜法检验。多管发酵法的原理是根据大肠菌群能发酵乳糖、产酸、产气，以及具备革兰氏染色阴性，无芽孢，呈杆状等有关特性，通过初发酵试验、平板分离和复发酵试验等三个步骤进行检验求得水样中的总大肠菌群数。试验结果以最可能数（Most Probable Number），简称MPN表示。

如果接种的水样量不是10mL、1mL和0.1mL，而是较低或较高的三个浓度的水样量，也可查表求得MPN指数，再经下面公式换算成每100mL的MPN值：

大肠菌群数系指每升水样中所含有的有大肠菌群的数目。大肠菌数一般包括大肠埃希氏杆菌、产气杆菌、枸椽酸杆菌和副大肠杆菌。本实验的发酵试验采用含有乳糖的培养基，测定结果不包括副大肠杆菌。

我国现行生活饮用水卫生标准GB 5749-85规定：细菌总数1mL水中不得超过100个，大肠菌群1L水中不得超过3个。

三、主要仪器设备及耗材

1、器材

高压蒸气灭菌器、干热灭菌箱、恒温培养箱、显微镜、镜油、二甲苯、酒精灯、镍络丝接种棒、载玻片若干、锥形瓶若干、试管架、洗耳球、记号笔、吹风机、培养皿（8×100mm）、试管（16×150mm）、移液管（10×1mL、2×10mL）、烧杯若干等

2、试剂

脱水的乳糖蛋白胨培养基 、磷酸氢二钾、琼脂、蛋白胨、邻酸二氢钾、乳糖、结晶紫染液、番红染液、碘液、95％乙醇、5％孔雀绿染液、0.5％番红水染液等

四、实验步骤

20##-12-02  9：30  实验准备、复发酵

1、仪器准备

a、 培养皿的包装：先将培养皿用自来水冲洗干净，再用旧报纸将八个培养皿包扎一起，写上实验组合（第四组）

b、移液管的包装： 将各型号（1mL、10mL）的移液管用水冲洗干净，分别用长条旧报纸包扎、打结，然后统一包扎一起，写上实验组号。

将打包好的玻璃器皿放入干热灭菌箱内进行灭菌2.5个小时以上。

2、试剂准备

a、普通浓度乳糖蛋白胨培养液：将9g脱水的乳糖蛋白胨培养基加入煮沸的100ml水中，充分搅拌混匀。

b、三倍浓缩乳糖蛋白胨培养液：将27g脱水的乳糖蛋白胨培养基加入煮沸的100ml水中，充分搅拌混匀。

c、品红亚硫酸钠培养基（远藤式培养基）：

于2000mL烧杯中，先将20～30g琼脂加到900mL蒸馏水中，加热溶解，然后加入3.5g磷酸氢二钾及10g蛋白胨，混匀，使其溶解，再用蒸馏水补充到1000mL，调节溶液pH为7.2～7.4。趁热用脱脂棉或绒布过滤，再加入10g乳糖，混匀，定量分装于250mL或500mL锥形瓶内，置于高压灭菌器中，在121℃灭菌15min，贮存于冷暗处备用。

d、伊红美蓝培养基（EMB）：

于2000mL烧杯中，先将20～30g琼脂加到900mL蒸馏水中，加热溶解。再家人2.0g邻酸二氢钾及10g蛋白胨，混合使之溶解，用蒸馏水补充至1000mL，调节溶液pH值为7.2～7.4。趁热用脱脂棉或绒布过滤，再加入10g乳糖，混匀后定量分装于250mL或500mL锥形瓶内，于121℃高压灭菌15min，贮于冷暗处备用。

3、初发酵实验初步准备

a、取11支干净的试管（内有倒管）分别加入10ml普通浓度乳糖蛋白胨培养基。其中10支试管为自备水用，另1支试管为备用试管；

b、取5支干净的试管（内有倒管）分别加入5ml三倍浓缩乳糖蛋白胨培养液。

将16支试管加塞，捆成两捆，用旧报纸包扎好，用记号笔注明组号，放入高压蒸汽锅内进行湿热灭菌。

4、清洁实验室

20##-12-02  13:30  接种水样

1、 初发酵试验：接种水样

    接种水样为商店销售的润田矿泉水。

    a、于5支装有5ml三倍浓度乳糖发酵管（内有倒管）内各注入10ml自备水样。（共5管，需水样50ml）

    b、于5支装有10ml普通浓度乳糖发酵管（内有倒管）内各注入1ml原水样。（共5管，需水样5ml）

c、于5支装有10ml普通浓度乳糖发酵管（内有倒管）内各注入0.1ml 水样（或先将水样1:10稀释，接种1ml稀释水样）。（共5管，需原水样0.5ml）

d、备用试管中接种含大肠杆菌的试液1ml。

以上操作需在酒精灯下进行无菌操作，所用移液管均为已杀菌的移液管。总用自备水量为55.5ml。置于37℃恒温箱中培养24～48h。

2、清洁实验室

20##-12-06   9:30   初发酵结果、平板划线

1、实验结果

初发酵实验取用润田矿泉水样的15支试管均未变色，即紫色，一部分表现为无气体和酸产生，为阴性反应，表示为无大肠杆菌群存在；一部分表现为有气体形成，但没有产酸，溶液也不浑浊，可能原因是操作不规范等技术原因引起；另一支接种了大肠杆菌的试管产生了较多的气泡，由原先的紫色变成了黄色，证明产酸产气，为大肠杆菌群阳性。（其他组选用的池塘水、寝室饮用水均产酸产气，说明都含有大肠菌群的存在。）

2、倒平板、平板划线

a、取出原先配置好的远藤式培养基，水浴溶解成液体

b、将灭菌过的培养皿放在火焰旁的桌面上，右手拿装有培养基的锥形瓶，左手拔出棉塞。

c、右手拿锥形瓶，使瓶口迅速通过火焰；

d、用左手将培养皿打开一条稍大于瓶口的缝隙，右手将锥形瓶中的培养基（约10～20ml）倒入培养皿，左手立即盖上培养皿的皿盖，轻轻摇匀。

e、等待平板冷却凝固（约5min）后，将平板倒过来放置，使皿盖在下，皿底在上。

3、平板划线

a、将接种环放在火焰上灼烧，直到接种环烧红；

b、在火焰旁冷却接种环，并打开盛有菌液的试管的棉塞；

c、将试管口通过火焰，将已冷却的接种环伸入产酸产气的菌液中，沾取一环菌液，将试管口通过火焰，并塞上棉塞； 

f、左手将皿盖打开一条缝隙，右手将沾有菌种的接种环迅速伸入平板内，划三至五条平行线，盖上皿盖；

g、灼烧接种环，待其冷却后，从第一区域划线的末端开始往第二区域内划线。重复以上操作，在三区域内划线。注意不要将最后一区域的划线与第一区相连。

h、划线好后，将平板倒置，并用记号笔写上组号及所接种的菌样。

每种产酸产气的菌液接种两个培养皿中，没有产酸产气组的借用其他产酸产气组的菌液操作。划线好后放入37℃恒温培养箱中培养24h。

4、 清洁实验室                                                                                                    

20##-12-07   14:30  划线结果观察、复发酵

1、划线结果观察

本组  品红亚硫酸钠培养基上：一部分菌落显示为紫红色，具有金属光泽；还有一部分菌落略带金属光泽，中心色较深。

其他组  伊红美蓝培养基上：一部分菌落显示为深紫黑色，有金属光泽；另一部分菌落为紫黑色，略带金属光泽、中心色较深。

  

2、革兰氏染色镜检

a、涂片：取新载玻片一块，清洗干净，并滴一滴蒸馏水，将较为完整独立的大肠杆菌菌种涂布在蒸馏水中。

b、干燥：将涂片置火焰高处微热烘干或自然干燥。

c、固定：涂面朝上，通过微火2-3次。

d、染色：结晶紫染色约1min--水洗--碘液媒染1min后--水洗--酒精脱色15-20秒--水洗--番红复染色2-3min--水洗--干燥—置于油镜下观察，阴性无芽胞杆菌者为红色，阳性者为紫色。

3、复发酵试验

上述涂片镜检的菌落如为革兰氏阴性无芽孢的杆菌，则挑选该菌落的另一部分接种于装有普通浓度乳糖蛋白胨培养液的试管中（内有倒管），每管可接种分离自同一初发酵管（瓶）的最典型菌落1～3个，然后置于37℃恒温箱中培养24h。

4、清洁实验室

20##-12-09  14:30  复发酵结果观察

1、结果观察

本组试管内均产酸、产气，证实了有大肠菌群存在。（其他组有产酸产气、不产酸只产气、既不产酸也不产气现象）

2、清洁实验室

清洗培养皿、清洗试管、拖地、擦试验桌等。

五、实验结果分析与报告

1、初发酵结果

总接种量55.5mL，其中5份10mL水样，5份1mL水样，5份0.1mL水样

(根据证实有大肠菌群存在的阳性管（瓶）数查附表1“大肠菌群检数表”，报告每升水样中的大肠菌群数。)

2、复发酵结果

接种的5支试管均产酸产气

六、结果讨论

1、本实验测定的结果说明了什么？

答：a、本组实验测定的是商店日常售卖的水，润田矿泉水。从测定结果看，该饮用水内无大肠杆菌群的存在，说明在这方面，水质还是达标的，可以放心饮用。b、另一组测了寝室内桶装饮用水，发现十五支试管均产酸产气，表面水内含有大量的大肠杆菌群，一方面可能是学校选用的水厂设备等没有达到国家规定的生产标准，另一方面可能是因为饮水机本身不干净造成的，所以在寝室饮用水方面要注意清洁、卫生。以防疾病。

2、大肠菌群的定义是什么？

答：大肠菌群是水污染检测中常见的几种主要指示微生物之一，指一群以大肠埃希氏菌为主的需氧及兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌，在32-37℃24小时内，能发酵乳糖，产酸产气。

3、EMB培养基在检查大肠杆菌群时，起着什么作用？

EMB培养基的机制就是靠微生物在发酵过程中，使培养基发生分解，产生大量的氢离子，从改变培养基的PH，由于提前添加的指示剂，在PH值的改变下，就会发生颜色的变化，从而鉴定生产的菌种。在检测大肠杆菌的同时，蛋白胨提供了氮源，磷酸二氢钾提供了磷元素和钾元素。

4、实验改进建议

答：发酵法操作时间过长，步骤较为繁琐，且需要进一步进行试验，不能快速得出实验结果，这个在实际运用中不能对卫生状况快速评价。滤膜法和固定底物酶底物法也是检测水样中的大肠杆菌群的方法，且固定底物法操作时间较短，过程简单，希望能接触了解下。

七、参考资料

l  我国《生活饮用水卫生标准》 GB5749-85

l  水处理生物学  第四版  顾夏声 胡洪营等编著  Page350-362

l  课堂教学PPT （ 实验设计：水体中总大肠菌群的检验）

l  百度文库 水体中总大肠杆菌的检测-多管发酵法

附表1  最可能数（MPN）表

（接种5份10mL水样、5份1mL水样、5份0.1mL水样时，不同阳性及阴性情况下100mL水样中细菌数的最可能数和95%可信限值）

第二篇：微生物实验室设计规划

环保技术公司微生物实验室

设计规划

环保技术公司技术部 二零一一年十二月十八日

目 录

微生物实验室建设 ................................................................................. 3

微生物学实验室的主要设备 .................................................................. 7

微生物实验室管理 ............................................................................... 15

微生物实验室建设

微生物实验室准备室、灭菌室、无菌室、恒温培养室和普通实验室五部分组成。这些房间的共同特点是地板和墙壁的质地光滑坚硬，仪器和设备的陈设简洁，便于打扫卫生。微生物实验室基本要求如下：

（一）准备室

准备室用于配制培养基和样品处理等。室内设有试剂柜、存放器具或材料的专柜、实验台、电炉、冰箱和上下水道、电源等。

准备室还要用于洗刷器皿等。室内应备有加热器、蒸锅，洗刷器皿用的盆、桶等，还应有各种瓶刷、去污粉、肥皂、洗衣粉等。

（二）灭菌室

灭菌室主要用于培养基的灭菌和各种器具的灭菌，室内应备有高压蒸汽灭菌器、烘箱等灭菌设备及设施。

（三）无菌室

无菌室也称接种室，是系统接种、纯化菌种等无菌操作的专用实验室。在微生物工作中，菌种的接种移植是一项主要操作，这项操作的特点就是要保证菌种纯种，防止杂菌的污染。在一般环境的空气中，由于存在许多尘埃和杂菌，很易造成污染，对接种工作干扰很大。

1. 无菌室的设置

无菌室应根据既经济又科学的原则来设置。其基本要求有以下几点：

（1）无菌室应有内、外两间，内间是无菌室，外间是缓冲室。房间容积不宜过大，以便于空气灭菌。最小内间面积2×2.5＝5m2，外间面积1×2＝2m2，高以2.5m以下为宜，都应有天花板。

（2）内间应当设拉门，以减少空气的波动，门应设在离工作台最远的位置上；外间的门最好也用拉门，要设在距内间最远的位置上。

（3）在分隔内间与外间的墙壁或“隔扇”上，应开一个小窗，作接种过程中必要的内外传递物品的通道，以减少人员进出内间的次数，降低污染程度。小窗宽60cm、高40cm、厚30cm，内外都挂对拉的窗扇。

（4）无菌室容积小而严密，使用一段时间后，室内温度很高，故应设置通气窗。通气窗应设在内室进门处的顶棚上（即离工作台最远的位置），最好为双层结构，外层为百叶窗，内层可用抽板式窗扇。通气窗可在内室使用后、灭菌前开启，以流通空气。有条件可安装恒温恒湿机。

2. 无菌室内设备和用具

（1）无菌室内的工作台，不论是什么材质、用途的，都要求表面光滑和台面水平。

（2）在内室和外室各安装一个紫外灯（多为30W）。内室的紫外线灯应安装在经常工作的座位正上方，离地面2m，外室的紫外线灯可安装在外室中央。

（3）外室应有专用的工作服、鞋、帽、口罩、盛有来苏儿水的瓷盆和毛巾、手持喷雾器和5%石炭酸溶液等。

（4）内室应有酒精灯、常用接种工具、不锈钢制的刀、剪、镊子、70%的酒精棉球、工业酒精、载玻璃片、特种蜡笔、记录本、铅笔、标签纸、胶水、废物筐等。

3. 无菌室的灭菌消毒

（1）薰蒸：这是无菌室彻底灭菌的措施。无菌室使用了较长时间，污染比较严重时，应进行薰蒸灭菌。可用甲醛、乳酸或硫磺薰蒸。

（2）喷雾：在每次使用无菌室前进行。喷雾可促使空气中微粒及微生物沉降，防止桌面、地面上的微尘飞场，并有杀菌作用。可用5%石炭酸喷雾。

（3）紫外线照射：在每次使用无菌室前进行。紫外线有较好的杀菌效果。通常应开启紫外线灯照射30～60min。

4. 无菌室工作规程

（1）无菌室灭菌。每次使用前开启紫外线灯照射30min以上，或在使用前30min，对内外室用5%石炭酸喷雾。

（2）用肥皂洗手后，把所需器材搬入外室；在外室换上已灭菌的工作服、工作帽和工作鞋，戴好口罩，然后用2%煤酚皂液将手浸洗2分钟。

（3）将各种需用物品搬进内室清点、就位，用5%石炭酸在工作台面上方和操作员站位空间喷雾，返回外室，5～10min后再进内室工作。

（4）接种操作前，用70%酒精棉球擦手；进行无菌操作时，动作要轻缓，尽量减少空气波动和地面扬尘。

（5）工作中应注意安全。如遇棉塞着火，用手紧握或用湿布包裹熄灭，切勿用嘴吹，以免扩大燃烧；如遇有菌培养物洒落或打碎有菌容器时，应用浸润5%石炭酸的抹布包裹后，并用浸润5%石炭酸的抹布擦拭台面或地面，用酒精棉球擦手后再继续操作。

（6）工作结束，立即将台面收拾干净，将不应在无菌室存放的物品和废弃物全部拿出无菌室后，对无菌室用5%石炭酸喷雾，或开紫外线灯照射30min。

（四）恒温培养室

1. 培养室的设置

（1）培养室应有内、外两间，内室是培养室，外室是缓冲室。房间容积不宜大，以利于空气灭菌，内室面积在3.2×4.4＝14m2左右，外室面积在

3.2×1.8＝6m2左右，高以2.5m左右为宜，都应有天花板。

（2）分隔内室与外室的墙壁上部应设带空气过滤装置的通风口。

（3）为满足微生物对温度的需要，需安装恒温恒湿机。

（4）内外室都应在室中央安装紫外线灯，以供灭菌用。

2. 培养室内设备及用具

（1）内室通常配备培养架和摇瓶机（摇床）。常用的摇瓶机有旋转式、往复式两种。

（2）外室应有专用的工作服、鞋、帽、口罩、手持喷雾器和5%石炭酸溶液、70%酒精棉球等。

3. 培养室的灭菌、消毒

同无菌室的灭菌、消毒措施。

小规模的培养可不启用恒温培养室，而在恒温培养箱中进行。

（五）普通实验室

进行微生物的观察、计数和生理生化测定工作的场所。室内的陈设因工作侧重点不同而有很大的差异。一般均配备实验台、显微镜、柜子及凳子。实验台要求平整、光滑，实验柜要足以容纳日常使用的用具及药品等。

微生物学实验室主要设备

（一）净化工作台

净化工作台是一种局部层流装置，能在局部形成高洁度的工作环境。它由工作台、过滤器、风机、静压箱和支撑体等组成，采用过滤空气使工作台操作区达到净化除菌的目的。室内空气经预过滤器和高效过滤除尘后以垂直或水平层流状态通过工作台的操作区，由于空气没有涡流，所以，任何一点灰尘或附着在灰尘上的杂菌都能被排除，不易向别处扩散和转移。因此，可使操作区保持无菌状态。

与无菌室和接种箱比较，使用净化工作台具有工作条件好、操作方便、无菌效果可靠、无消毒药剂对人体危害、占用面积小且可移动等优点。如果放在无菌室内使用，无菌效果更好。其缺点是价格昂贵，预过滤器和高效过滤器还需要定期清洗和更换。

（二）高压蒸汽灭菌锅

高压蒸汽灭菌锅是一个密闭的、可以耐受一定压力的双层金属锅。锅底或夹层内盛水，当水在锅内沸腾时由于蒸汽不能逸出，使锅内压力逐渐升高，水的沸点和温度可随之升高，从而达到高温灭菌的目的。一般在0.11MPa的压力下，121℃灭菌20~30min，包括芽孢在内的所有微生物均可被杀死。如果灭菌物品体积较大，蒸汽穿透困难，可以适当提高蒸汽压力或延长灭菌时间。

高压灭菌锅有卧式、立式、手提式等多种类型，在微生物学实验室，最为常用的是手提式和立式高压蒸汽灭菌锅。和常压灭菌锅相比，高压灭菌锅的优

点是灭菌所需的时间短、节约燃料、灭菌彻底等。其缺点是价格昂贵，灭菌容量较小。

（三）培养箱

培养箱是培养微生物的专用设备。制热式培养箱是由电炉丝和温度控制仪合成的固定体积的恒温培养装置，大小规格不一。微生物实验室常用的培养箱工作容积有450×450×350mm3或650×500×500mm3，适用于室温至60℃之间的各类微生物培养。目前，随着科学水平的发展，培养箱设备的完善程度和价格有很大差别。有各种结构合理、功能齐全的培养箱，如恒温培养箱、恒温恒湿培养箱、低温培养箱、微生物多用培养箱和二氧化碳培养箱等。有的用计算机控制，可选择多条时间线变换温差，从而克服了环境温度的影响，一年四季均能达到培养要求的温度。

微生物多用培养箱是集加热、制冷和振荡于一体的微生物液体发酵装置。工作室的温度在15~50℃范围内任意选定，选定后经温控仪自动控制，保持工作室内恒温。同时设有可控硅调速系统，振荡机转速可在1~220rpm范围内任意调控。

（四）干燥箱

干燥箱是用于除去潮湿物料内及器皿内外水分或其它挥发性溶液的设备。类型很多，有箱式、滚筒式、套间式、回转式等。微生物学实验室多用箱式干燥箱，大小规格不一。工作室内配有可活动的铁丝网板，便于放置被干燥的物品。制热升温式干燥箱也是有电炉丝和温度控制仪组成，可调节温度从室温至300℃任意选择。有的干燥箱采用导电温度计为敏感元件，配合晶体管和继电器组成自动控制系统，克服了金属管型热膨胀控制的缺点。

此外，还有真空干燥箱(配有真空泵和气压表)，可在常压或减压下操作。

（五）摇床

摇床又称摇瓶机，它是培养好气性微生物的小型试验设备或作为种子扩大培养之用，常用的摇床有往复式和旋转式两种。往复式摇床的往复频率一般在80~140次/min，冲程一般为5~14cm，如频率过快、冲程过大或瓶内液体装量过多，在摇动时液体会溅到包扎瓶口的纱布或棉塞上，导致杂菌污染，特别是启动时更容易发生这种情况。

旋转式摇床的偏心距一般在3~6cm之间，旋转次数为60~300rpm。

放在摇床上的培养瓶（一般为三角瓶）中的发酵液所需要的氧是由空气经瓶口包扎的纱布(一般8层)或棉塞通入的，所以氧的传递与瓶口的大小、瓶口的几何形状、棉塞或纱布的厚度和密度有关。在通常情况下，摇瓶的氧吸收系数取决于摇床的特性和三角瓶的装样量。

往复式摇床是利用曲柄原理带动摇床作往复运动，机身为铁制或木制的长方框子，有一层至三层托盘，托盘上有圆孔备放培养瓶，孔中凸出一个三角形橡皮，用以固定培养瓶并减少瓶的振动，传动机构一般采用二级皮带轮减速，调换调速皮带轮可改变往复频率。偏心轮上开有不同的偏心孔，以便调节偏心距。往复式摇床的频率和偏心距的大小对氧的吸收有明显的影响。

旋转式摇床是利用旋转的偏心轴使托盘摆动，托盘有一层或两层，可用不锈钢板、铝板或木制板制造。在三个偏心轴上装有螺栓可调节上下，使托盘保持水平。这种摇床结构复杂，造价高。其优点是氧的传递较好、功率消耗小、培养基不会溅到瓶口的纱布上。

（六）显微镜

微生物个体微小，必须借助显微镜才能观察清楚它们的个体形态和细胞结构。因此，在微生物学的各项研究中，显微镜就成为不可缺少的工具。

显微镜的种类很多，根据其结构，可以分为光学显微镜和非光学显微镜两大类。光学显微镜又可分为单式显微镜和复式显微镜。最简单的单式显微镜即放大镜（放大倍数常在10倍左右），构造复杂的单式显微镜为解剖显微镜（放

大倍数在200左右）。在微生物学的研究中，主要是复式显微镜。其中以普通光学显微镜（明视野显微镜）最为常用。此外，还有暗视野显微镜、相差显微镜、荧光显微镜、偏光显微镜、紫外光显微镜和倒置显微镜等。非光学显微镜为电子显微镜。

下面以普通光学显微镜为例，简单介绍一下显微镜的结构、原理等。

1. 基本构造

普通光学显微镜由机械装置和光学系统两部分组成（如图1.1）。机械装置由镜座、镜臂、载物台、镜筒、物镜转换器和调焦装置（粗调焦螺旋和微调焦螺旋）等组成。光学系统包括物镜、目镜、聚光器、彩虹光阑和光源等。

2. 成像原理和性能

普通光学显微镜的成像原理如图1.2所示。将被检物体置于集光器和物镜之间，平行的光线自反光镜折入聚光器，光线经过聚光器穿过透明的物体进入物镜后，即在目镜的焦点平面（光阑部位或附近）上形成一个初生倒置的实像。从初生实像射过来的光线，经目镜的接目透镜而达到眼球。这时的光线已变为或接近平行光，再透过眼球的水晶体时，便在视网膜后形成一个直立的实像。

图1.2 复式光学显微镜成像原理图

显微镜的主要性能包括放大率、工作距离、焦点距离、焦点深度、分辨率、镜像亮度和视场亮度等。

（1）放大率

在显微镜组合中，光线通过物镜先将物体放大为一个左右相反、前后倒置的实像，经目镜再次放大为一个虚像，这一虚像的大小和物体大小的比例，就叫放大率。

显微镜的放大率 = 物镜的放大倍数×目镜的放大倍数

= （光学筒长/ 物镜焦距）×（明视距离/ 目镜焦距）

明视距离是已知数，物镜焦距和目镜焦距在说明书上有数据可查，而光学筒长是指物镜上焦平面到目镜下焦平面的距离，一般为160mm。

（2）工作距离

当显微镜调准焦距时，从盖玻片到物镜前透镜表面之间的距离叫工作距离。工作距离的大小和物镜的放大倍数与数值口径有关。物镜放大倍数和数值口径愈大，则工作距离愈小，反之愈大。表1.1表示标准物镜的主要性质。一般油镜的工作距离最短，约0.2mm。因此，要求盖玻片的厚度为

0.17~0.18mm。若盖玻片过厚，就不可能将被检体聚焦，且易引起物镜的意外损坏。

表1.1标准物镜的主要性质

（3）焦点距离（焦距）

它是指平行光线经过单一透镜后集于一点，由这一点到透镜中心的距离。一个物镜通常有几个不同性质的透镜组成。因此，它的焦距的测定比较复杂。一般，显微镜的物镜上都注明焦距的长度。物镜的放大倍数越大，焦距越短。

（4）焦点深度

在使用显微镜时，当焦点对准某一物体时，不仅位于该点平面上的各点都可看清楚，而且在此平面的上下一定厚度内，也可看清楚，这个清晰部分的厚度就是焦点深度。焦深与总放大率和数值口径成反比，因此，高放大率和高数值口径的显微镜其焦深就浅，不能看到标本的全厚度。必须调节螺旋仔细地从

上到下进行观察。另外，被检物体周围介质（封片剂）的折射率加大可增大焦深。尤其在显微照相时，更应考虑封片剂的使用。

（5）数值口径（numerical aperture 简写为NA）

数值口径是指物镜与标本间介质折射率（n）和光线投射到物镜上的最大入射角（α）一半正弦的乘积。其计算公式为：

NA=n×sin(α/2)

其中，n=介质折射率，干燥系物镜n=1，油浸系物镜n=1.515；α=光线进入物镜的最大夹角，也称镜口角。

（6）分辨率

显微镜能够分辨物体结构中两点之间的最小距离的能力，就叫分辨率。分辨率与物镜的数值口径成正比，与光波波长成反比。因此物镜的数值口径愈大，光波波长愈短，则显微镜的分辨率愈大，被检物体的细微结构也愈明晰地区分出来。因此，一个高分辨率意味着一个小的分辨距离。显微镜的分辨率是用可分辨的最小距离（D）来表示的：

D=λ /（2 NA）

（7）镜像亮度与视野亮度

镜像亮度是显微镜的图像亮度的简称，指在显微镜下观察到的图像的明暗程度。使用时，对镜像亮度的要求，一般是使眼睛既不感到暗淡，又不耀眼。镜像亮度与数值口径平方成正比，，与总放大倍数的平方成反比。

视场亮度是指显微镜下整个视场的明暗程度。视场亮度不仅与目镜、物镜有关，还直接受聚光镜、光阑和光源等因素的影响。在不更换物镜和目镜的情况下，视场亮度大，镜像亮度也大。

3. 油镜的基本原理

油镜，也称油浸物镜，一般在镜头上标有“HI”和“HO”字样，或在镜头下缘刻有1~2道黑线作为标记。使用油镜时，需将镜头浸在香柏油中进行观

察，这是为了消除光由一种介质进入另一种介质时发生散射，结果不仅提高了放大倍数，还增加了照明度和分辨率。

（1）照明亮度

油镜与其它物镜不同之处在于玻片和物镜之间的介质不是空气，而是一种和玻璃折射率（n=1.52）相近的香柏油（n=1.515）。如果玻片与物镜之间的介质是空气（n=1.00），光线通过玻片后发生散射，进入视场的光线显然减少，结果降低了视场亮度。当光线通过玻片又通过香柏油进入物镜就不发生散射，结果，提高了照明度，观察的标本显得更清晰（图1.3）

（2）分辨率强

使用油镜还能增加显微镜的分辨率。由于显微镜分辨率与物镜的数值口径（NA）成反比，与波长成正比。因此物镜的数值口径愈大，光波愈短，则显微镜的分辨率就愈大。人们肉眼所能感受的光波平均长度为0.55μm，加入数值口径NA=0.65高倍物镜，能分辨两点之间的距离为0.42μm，而小于0.42μm的两点之间距离就分辨不出，而使用数值口径NA=1.25油镜，能分辨两点之间的最小距离为0.22μm。因为不论总放大倍数多大，用普通光学显微镜是无法观察到小于0.2μm的物体，但大部分细菌直径在0.5μm以上，故用油镜就能清晰地观察到细菌的个体形态。

4. 注意事项

使用显微镜应注意以下事项：

（1）取拿显微镜时，必须用一手握住镜臂，另一手托住显微镜的镜座，使显微镜保持直立的状态，切忌用单手提拿。

（2）将显微镜放置桌上时，务必要轻轻放下。

（3）显微镜的镜头必须保持清洁，必要时用擦镜纸擦拭镜头，不可使用布或一般的纸，以免损伤镜头。

（4）将显微镜轻轻地放置桌上，镜座后缘位于离桌子边缘约5cm处。

（七）接种箱

接种箱分为固体菌种接种箱和液体菌种接种箱两种。固体菌种接种箱是一个用木料和玻璃制成或由有机玻璃焊接而成的密闭小箱。又分为双人和单人操作箱。箱体可大可小，一般箱体长约143cm，宽86cm，总高154cm，支架76cm。箱的上部左右两侧各装有两扇能启闭的玻璃推拉门，方便菌种进出。窗的下部分别设有两个直径约13cm的圆洞，两洞的中心距离为52cm（同肩宽），洞口装有带松紧带的袖套，以防双手在箱内操作时，外界空气进入箱内造成污染。操作时两人相对而坐，双手通过袖套伸入箱内。箱两侧最好也装上玻璃，箱顶部为木板或玻璃。箱内顶部装有紫外线杀菌灯和照明用日光灯各一支。箱体安装木板或玻璃均可，但要注意密封。

液体菌种接种箱是专为移接液体菌种而设计的。比固体菌种箱窄长，单侧两人操作。内设轨道和紫外线灯，箱两端开有高25cm，宽10cm的长方形出口，方便菌种进出，洞口设有小推门。进出口下处设蒸汽源，接种时用蒸汽封住进出口，以防杂菌进入箱内。箱背面设有液体菌种移接管能进入的小孔。

接种箱灭菌时，用紫外线照射30min。如果没有紫外线灯，可用甲醛和高锰酸钾（甲醛10～14mL/m3+高锰酸钾5～7g/m3空间）熏蒸30min以上。使用时，先将所需物品和工具放入接种箱内，然后进行药剂熏蒸和紫外线灭菌，再按无菌操作进行接种。

接种箱的结构简单，造价低廉，易消毒灭菌，操作方便，而且人在箱外操作，气温较高时也能作业。缺点是进出培养基费工费时，每次接种前都需要进行灭菌。

（八）冰箱

微生物实验室的冰箱主要有两种：普通冰箱和低温冷冻冰箱。普通冰箱一般都具有两个柜子，即鲜藏柜和冷藏柜，温度分别为4℃和－20℃；低温冷冻冰箱温度一般控制在－40～－80℃。它们都可以用于微生物菌种保藏。鲜藏柜

常用于保存斜面菌种，保藏时间在3个月左右。超过3个月，斜面就会变干，因此需要转接菌种。如果要长时间保存菌种，则需要经过处理后，贮藏于普通冰箱的冷藏柜或低温冷冻冰箱中，它们的保藏时间较长，一般都在1年以上。

微生物实验室管理

一、实验室管理制度

1．实验室应制定仪器配备管理、使用制度，药品管理、使用制度，玻璃器皿管理、使用制度，并根据安全制度和环境条件的要求，本室工作人员应严格掌握，认真执行。

2．进入实验室必须穿工作服，非实验室人员不得进入实验室，严格执行安全操作规程。

3．实验室内物品摆放整齐，试剂定期检查并有明晰标签，仪器定期检查、保养、检修, 严禁在冰箱内存放和加工私人食品。

4．各种器材应建立请领消耗记录，贵重仪器有使用记录，破损遗失应填写报告；药品、器材、菌种不经批准不得擅自外借和转让，更不得私自拿出。

5．禁止在实验室内吸烟、进餐、会客、喧哗，实验室内不得带入私人物品，离开实验室前认真检查水电，对于有毒、有害、易燃、污染、腐蚀的物品和废弃物品应按有关要求执行。

6．负责人严格执行本制度，出现问题立即报告。

二、仪器配备、管理使用制度

1．食品微生物实验室应具备下列仪器：培养箱、高压锅、普通冰箱、低温冰箱、厌氧培养设备、显微镜、离心机、超净台、振荡器、普通天平、千分之一天平、烤箱、冷冻干燥设备、匀质器、恒温水浴箱、菌落计数器、生化培养箱，电位 pH计、高速离心机。

2.实验室所使用的仪器、容器应符合标准要求，保证准确可靠，凡计量器具须经计量部门检定合格方能使用。

3．实验室仪器安放合理，贵重仪器有专人保管，建立仪器档案，并备有操作方法，保养、维修、说明书及使用登记本，做到经常维护、保养和检查，精密仪器不得随意移动，若有损坏需要修理时，不得私自拆动、应写出报告、通知管理人员，由经理同意填报修理申请、送仪器维修部门。

4．各种仪器（冰箱、温箱除外），使用完毕后要立即切断电源，旋钮复原归位，待仔细检查后，方可离去。

5．一切仪器设备未经设备管理人员同意，不得外借，使用后按登记本的内容进行登记。

6．仪器设备应保持清洁，一般应有仪器套罩。

7．使用仪器时，应严格按操作规程进行，对违反操作规程的因管理不善致使仪器械损坏，要追究当事者责任。

三、药品管理、使用制度

1．依据本室检测任务，制定各种药品试剂采购计划，写清品名、单位、数量、纯度、包装规格，出厂日期等，领回后建立账目，专人管理，每半年做出消耗表，并清点剩余药品。

2．药品试剂陈列整齐，放置有序、避光、防潮、通风干燥，瓶签完整，剧毒药品加锁存放、易燃、挥发、腐蚀品种单独贮存。

3．领用药品试剂，需填写请领单、由使用人和室负责人签字，任何人无权私自

出借或馈送药品试剂，本单位科、室间或外单位互借时需经科室负责人签字。

4．称取药品试剂应按操作规范进行，用后盖好，必要时可封口或黑纸包裹，不使用过期或变质药品。

四、玻璃器皿管理、使用制度

1．根据测试项目的要求，申报玻璃仪器的采购计划、详细注明规格、产地、数量、要求，硬质中性玻璃仪器应经计量验证合格。

2．大型器皿建立账目，每年清查一次，一般低值易耗器皿损坏后随时填写损耗登记清单。

3．玻璃器皿使用前应除去污垢，并用清洁液或2%稀盐酸溶液浸泡24 h后，用清水冲洗干净备用。

4．器皿使用后随时清洗，染菌后应严格高压灭菌，不得乱弃乱扔。

五、安全制度

1．进入实验室工作衣、帽、鞋必须穿戴整齐。

2．在进行高压、干燥、消毒等工作时，工作人员不得擅自离现场，认真观察温度、时间，蒸馏易挥发、易燃液体时，不准直接加热，应置水浴锅上进行，试验过程中如产生毒气时应在避毒柜内操作。

3．严禁用口直接吸取药品和菌液，按无菌操作进行，如发生菌液、病原体溅出容器外时，应立即用有效消毒剂进行彻底消毒，安全处理后方可离开现场。

4．工作完毕，两手用清水肥皂洗净，必要时可用新洁尔灭、过氧乙酸泡手，然后用水冲洗，工作服应经常清洗，保持整洁，必要时高压消毒。

5．实验完毕，即时清理现场和实验用具，对染菌带毒物品，进行消毒灭菌处理。6．每日下班，尤其节假日前后认真检查水、电和正在使用的仪器设备，关好门窗，方可离去。

六、环境条件要求

1．实验室内要经常保持清洁卫生，每天上下班应进行清扫整理，桌柜等表面应

每天用消毒液擦拭，保持无尘，杜绝污染。2．实验室应井然有序，不得存放实验室外及个人物品、仪器等，实验室用品要摆放合理，并有固定位置。

3．随时保持实验室卫生，不得乱扔纸屑等杂物，测试用过的废弃物要倒在固定的箱筒内，并及时处理。

4．实验室应具有优良的采光条件和照明设备。

5．实验室工作台面应保持水平和无渗漏，墙壁和地面应当光滑和容易清洗。

6．实验室布局要合理，一般实验室应有准备间和无菌室，无菌室应有良好的通风条件，如安装空调设备及过滤设备，无菌室内空气测试应基本达到无菌。

7．严禁利用实验室作会议室及其他文娱活动和学习场所。