DNA指纹图谱实验

上课地点：化学楼120 上课时间：选课时

任课教师：薛闯 办公地点：生化楼215 电话：84706308

课程要求：

预习实验内容，掌握实验目的及原理、仪器和试剂、实验步骤；

手写完成预习报告（实验名称、实验目的、实验原理、实验器材与试剂、实验方法与步骤），课堂检查预习报告情况。

自带U盘和尺子。

实验注意事项：

1、实验台上物品按实验室管理老师要求摆放整齐；

2、实验废物按实验室管理老师要求收集；

3、实验结束后，经老师检查后方可离开。

实验纪律：

1、按时上课

2、穿实验服（白大衣）

3、不许吃东西，课堂严禁大声喧哗

4、手机静音

实验成绩：

预习报告： 20分

实验操作： 40分

报告内容：结果和讨论 40分

DNA指纹图谱实验

（指导教师：薛闯）

一．实验目的 1. 掌握 DNA 指纹图谱技术的概念、原理和基本操作过程

2. 掌握琼脂糖凝胶电泳的基本操作技术，学习利用琼脂糖凝胶电泳测定 DNA 片段的长度。

3. 掌握对DNA指纹数据进行基本统计分析方法。

二 . DNA指纹图谱实验原理 1984 年英国莱斯特大学的遗传学家 Jefferys 及其合作者首次将分离的人源小卫星 DNA 用作基因探针，同人体核 DNA 的酶切片段杂交，获得了由多个位点上的等位基因组成的长度不等的杂交带图纹，这种图纹极少有两个人完全相同，故称为 "DNA指纹"，意思是它同人的指纹一样是每个人所特有的。DNA指纹的图像在X光胶片中呈一系列条纹，很像商品上的条形码。由于 DNA 指纹图谱具有高度的变异性和稳定的遗传性，且仍按简单的孟德尔方式遗传，成为目前最具吸引力的遗传标记。

DNA 指纹具有下述特点：

1. 高度的特异性：研究表明，两个随机个体具有相同 DNA 图形的概率仅3×10-11 ；如果同时用两种探针进行比较，两个个体完全相同的概率小于 5×10 -19 。全世界人口约 50 亿，即 5×109 。因此，除非是同卵双生子女，否则几乎不可能有两个人的 DNA 指纹的图形完全相同。

2. 稳定的遗传性：DNA 是人的遗传物质，其特征是由父母遗传的。分析发现， DNA指纹图谱中几乎每一条带纹都能在其双亲之一的图谱中找到，这种带纹符合经典的孟德尔遗传规律，即双方的特征平均传递 50 % 给子代。

3. 体细胞稳定性：即同一个人的不同组织如血液、肌肉、毛发、精液等产生的 DNA 指纹图形完全一致。

DNA 指纹图谱法的基本操作：

从生物样品中提取 DNA

（ DNA 一般都有部分的降解），可运用 PCR 技术扩增出高可变位点（如 VNTR 系统，串联重复的小卫星 DNA 等）或者完整的基因组 DNA ，然后将扩增出的 DNA 酶切成 DNA 片断，经琼脂糖凝胶电泳，按分子量大小分离后，转移至尼龙滤膜上，然后将已标记的小卫星 DNA 探针与膜上具有互补碱基序列的 DNA 片段杂交，用放射自显影便可获得 DNA 指纹图谱。

DNA 指纹图谱法的基本操作示意图

琼脂糖凝胶电泳：

琼脂糖凝胶电泳是分离，鉴定和纯化DNA 片段的常规方法。利用低浓度的荧光嵌入染料-溴化乙锭进行染色，可确定DNA 在凝胶中的位置。如有必要，

还可以从凝胶中回收DNA 条带，用于各种克隆操作。琼脂糖凝胶的分辨能力要比聚丙烯酰胺凝胶低，但其分离范围较广。用各种浓度的琼脂糖凝胶可以分离长度为200bp至近50kbp 的DNA。长度100kb 或更大的DNA，可以通过电场方向呈周期性变化的脉冲电场凝胶电泳进行分离。

在基因工程的常规操作中，琼脂糖凝胶电泳应用最为广泛。它通常采用水平电泳装置，在强度和方向恒定的电场下进行电泳。DNA 分子在凝胶缓冲液（一般为碱性）中带负电荷，在电场中由负极向正极迁移。DNA分子迁移的速率受分子大小，构象。电场强度和方向，碱基组成，温度和嵌入染料等因素的影响。

DNA指纹数据处理：

1. DNA指纹图谱的共有带率（Band-sharing，简称BS）

BS=2NAB/(NA＋NB)

式中：NA指个体A的条带数，NB为个体B的条带数，NAB指个体A和个体B共有的条带数。

2. 平均等位基因频率(q)及最低平均杂合率(Ht)

q ＝l-(1-BS)1/2，Ht＝l-q

式中BS为共有带率。

3. 两个个体具有完全相同的DNA 指纹图谱的概率（P）

两个无关个体具有完全相同的DNA 指纹图谱的概率为：

P1 =（1-2BS＋2BS2 ）n/BS ；

两个同胞个体具有完全相同的DNA 指纹图谱的概率为：

P2 =［1-0.5q（1-q）2（4-q）］n／BS 式中：n 为个体的平均条带数，q 为平均等位基因频率。

三 . 实验材料和试剂

1. DNA 样品：犯罪现场CS DNA 样品、嫌疑犯S1 DNA 样品、嫌疑犯S2 DNA 样品、嫌疑犯 S3 DNA 样品

2. 化学试剂和溶液

(1). TAE（ 50 ×）

Tris 242g

冰醋酸 57.1ml

EDTA （ 0.5mol/L pH 8.0 ） 100ml

使用时用蒸馏水稀释 50 倍。

(2).琼脂糖 agarose （电泳级）

3. 仪器设备和消耗品

电泳仪、电泳槽、样品梳、微波炉、移液器（10 μ l）、离心管、一次性枪头，一次性手套。

四 . 实验步骤

DNA样本的琼脂糖凝胶电泳：

1. 用量筒量20ml电泳缓冲液TAE倒入烧杯中，然后用天平称量0.2g琼脂糖倒入烧杯中；

2. 用微波炉加热30秒左右使琼脂糖完全融化（当心煮沸的液体，溢出！）；

3. 冷却至 65 ℃左右时用微量移液器加入10 μl GoldviewTM核酸染料，充分混匀；

4. 将制胶器置于工作台面上，将胶模和梳子分别插入制胶器内，梳子应距胶模一端约1cm，梳齿底边与胶模表面保持0.5-1mm的间隙；

5. 待琼脂糖冷却至60℃左右时，小心倒入胶模内（避免产生气泡），使凝胶缓慢展开直至在胶模表面形成一层约3mm厚的均匀胶层，室温静置30分钟；

6. 待凝固完全后，双手均匀用力轻轻拔出梳子（注意切勿使样品槽破裂），在胶模上形成相互隔开的样品槽；

7. 将凝胶连同胶模放入电泳槽平台上，倒入TAE缓冲液直至浸没过凝胶面2-3mm，小心去除样品槽中的气泡；

8. 用微量移液器缓慢地将3μL DNA样品分别加入到样品槽内，注意避免因样品过多而溢出，污染邻近样品；

9. 加样完毕后，将靠近样品槽一端连接负极，另一端连接正极，接通电源，开始电泳，在样品进胶前可用略高电压，防止样品扩散，样品进胶后，应控制电压不高于5V/cm（电压值V/电泳槽两极之间距离cm）；

10. 当染料条带移动到距离凝胶前沿约1cm时，停止电泳；关闭电源，然后将胶板推至预先浸湿并铺在紫外灯观察台上的保鲜膜上，在波长254nm紫外灯下进行观察，DNA条带呈现荧光；在紫外灯下观察 DNA 的迁移位置；

11. 在电泳照片上用卡尺测量出犯罪现场DNA各片段的迁移距离（cm），以各片段分子碱基对的对数为纵坐标，它们的迁移距离为横坐标，用EXCEL软件上划出曲线，制作出DNA分子的标准曲线；并讨论实验结果。

五．作业与结果分析

1. 根据已知CS样本的DNA片段长度，计算S1，S2，S3样本的DNA片段长度。

2. 用现有的电泳图，练习计算嫌疑犯样本（S1，S2，S3）与犯罪现场CS样本图谱之间的共有带率（BS）. 判断 CS 与哪一个 DNA 样品是同一个样品，找出罪犯。

3. 实验的心得体会和建议。

六. 注意事项

1.观察时应戴上防护眼镜或有机玻璃护面罩，避免紫外光对眼睛的伤害；

2.DNA存在的位置呈现荧光，肉眼可观察到清晰的条带，荧光会逐渐减弱，因此初步观察后，应立即拍照记录下电泳结果；

3.每次取DNA样品时都应换一个无菌枪头 。避免样品间污染。

4.Goldview核酸染料是一种毒性物质，使用时必须带手套 。实验结束后，含Goldview的凝胶要进行净化处理。

附件2：大连理工大学实验报告封皮范本

大连理工大学

本科实验报告

课程名称： 普通生物学实验 学院（系）： 专 业： 班 级： 学 号： 学生姓名：

年 月 日

附件3：大连理工大学实验报告范本

大连理工大学实验报告

学院（系）： 专业： 班级： 姓 名： 学号： 组： ___ 实验时间： 实验室： 实验台： 指导教师签字： 实验班级号： 成绩：

实验名称：DNA指纹图谱实验

一、实验目的

二、实验原理

三、实验器材与试剂

四、实验步骤与操作方法

五、实验数据记录和处理

六、实验结果与分析

七、讨论、建议、质疑

注：预习报告完成前四项即可。

第二篇：DNA指纹图谱技术

DNA指纹图谱技术在土壤微生物多样性研究中的应用

pace等于19xx年首次利用rrna基因确定环境样品中的微生物，

通过对5s rrna基因的序列分析来研究微生物的生态和进化。该方

法很快被用于微生物多样性研究领域。由于5s rrna基因相对较小，

携带信息相对较少，因而揭示微生物群落多样性的能力有限。相比

之下，随后开展的16s rrna基因序列分析为微生物多样性研究提

供了更多信息，且效率更高。目前16s rrna基因序列分析已广泛

应用于微生物多样性的研究。16s rrna基因序列分析是主要基于已

建立的微生物16s rrna基因序列数据库，用以确定细菌的系统发

育关系，并使序列探针用于识别未知菌成为可能。当然序列探针的

确定也可根据分子标记方法，如rapd方法进行。利用16s rrna基

因序列研究微生物多样性可采用不同的策略。目前一般常用以下几

种方法。

一、变性梯度凝胶电泳（dgge）和温度梯度凝胶电泳（tgge ）

19xx年muyzer等将dgge技术引入环境微生物学多样性的研究。

随后该技术被广泛用于比较不同生态系统中的微生物群落的多样

性及监测特定微生物种群的动态变化，dgge和tgge的原理是根据

含有不同序列的dna片段（16s rrna基因扩增产物）在具有变性剂

梯度或温度梯度的凝胶上由于其解链行为的不同而导致迁移率的

不同，部分解链的dna片段在凝胶中的迁移速率低于完全螺旋形式

的dna分子，从而含有不同碱基序列的dna片段就得到有效分离。

结合pcr扩增标记基因或其转录物（rrna和mrna）的dgge方法能

直接显示微生物群落中优势组成成分。由于它可同时对多个样品进

行分析，使之非常适合研究微生物群落的时空变化，而且可以通过

对酶切条带进行序列分析，或通过与独特的探针杂交鉴定群落组

成，可以方便地了解环境被干扰后的微生物群落变化或某种指示微

生物的命运。oliver等用dgge方法考察了农田微生物的变化情况，

认为环境变化对农田微生物的多样性有很大影响。但是dgge/tgge

技术也存在一定的局限性。

其缺陷之一是只能分离约500 bp大小的dna片段，这限制了作为

下一步用于杂交分析的探针设计。并且研究报道有些种类细菌16s

rdna在dgge上不只显示1条带，而不同种细菌的16s rdna序列在

dgge上也可能因为具有相同的解链行为而不能被分开。即便存在以

上的一些局限性，dgge/tgge仍是分析微生物群落多样性较为敏感

的方法之一。

二、单链构象多态性（sscp）

sscp是对16s rrna基因扩增产物进行分析的另一种简便有效的方

法。该技术最初用来检测人类dna的基因多态性，lee等在19xx年

首次报道将sscp技术应用到环境样品微生物群体多样性分析。不

同碱基序列的单链dna分子构象不同，dna片段变性成单链后受到

凝胶不同分子筛作用力最终使不同dna片段得到分离。电泳结束后

可以将不同的条带切下并测序，或采用特异性探针进行杂交，进而

显示该特定微生物类群的动态变化。holly等利用sscp技术研究发

现在植物根际土壤中大量存在古菌crenarchaeot，该类微生物以往

一直被认为只存在于极端嗜热环境当中。但是sscp技术重现性较

差，易受胶浓度和电泳温度等条件的影响。另外，sscp能够有效分

离的dna序列过短，为150-400 bp。

三、随机引物扩增多态性dna（rapd ）

由williams建立的rapd技术，因具有操作简便、快速和经济等

优点而得到了广泛应用。该技术以随机寡核苷酸（5-10 nt）作为

引物，扩增得到的多态性片段较短，更方便检测两个同源或异源等

位基因的有无，适用于种内和亚种更为细致的分类。张峦等在室内

培养条件下，采用rapd分子标记技术研究了重金属镉和多环芳烃

菲复合污染对土壤中微生物群落dna序列多样性的影响。结果表明，

培养15 d和30 d后，镉-菲单一和复合污染均导致土壤微生物群

落dna序列的丰度、均度和多样性指数增加。重复性不好是该技术

存在的主要问题，而dna模板的质量与数量、mgcl2和引物浓度的

变化都有可能导致得到不同的图谱。另外，从条带图谱中无法得到

任何微生物系统发育信息。

四、限制性片段长度多态性（rflp ） 和扩增核糖体dna

限制性分析rflp方法和ardra方法也常用于微生物群落的分析。

通常用引物pcr扩增得到16s rdna片段，被限制酶切割，然后再

进行电泳形成不同长度的片断进行分析。其所获得的谱带更为简

单，易于分析，不受菌株是否纯培养的限制，不受宿主的干扰，具

有特异性强，效率高的特点。广泛应用于新物种的发现、微生物分

类及鉴定、共生菌、病原菌的微生物遗传多样性的检测等。后来有

人利用ardra方法考察两种不同农田土壤的微生物群落时，发现两

者无显著差异。张于光等利用rflp方法对三江源地区不同的植物

类型的土壤中固氮微生物群组成进行了研究，发现所有土壤样品中

分别具有1-2个优势微生物种群。但是该技术所能获得的信息量相

对较少，并且难以用来评估物种的丰度和均度。

五、末端限制性片段长度多态性（t-rflp ）

t-rflp是rflp/ardra方法的进一步发展，所不同的是在pcr扩增

16s rrna基因过程中，其中一个引物用荧光标记，在计算机程序自

动分析时仅分析荧光标记的末端限制片段，这样使得限制片段长度

多态性图谱更为简化，并且每个可见的条带都代表一个“核型”或

一个分类单元。此法能够得到一个群落的特征指纹图谱，可用于比

较不同群落的相似性和由于污染造成的群落结构在时间和空间上

的改变。pett等利用t-rflp技术考察氧化还原电位对土壤菌群的

影响，研究发现经过4 d的好氧/厌氧处理与未处理的土壤样品菌

群结构相似，而经过持续12 h的厌氧或好氧处理的土壤样品得到

的分子条带则明显不同，在所有样品的179种条带图谱中只有3种

是普遍存在的，同时还发现土著菌群对氧化还原电位的变化具有耐

受性。catherine等对t-rflp方法进行了完善，采用多个限制性酶

代替单一限制性酶更有利于排除选择酶的干扰，通过叠加靶基因酶

切位点，使待定鉴定种属在数据库中匹配度提高。为得到较精确的

结果，可以在产生图谱的同时，对分析样品创建克隆、测序鉴定，

但所需费用较高。