绪 论
一、授课章节
绪论。
二、学时安排
2学时。
三、教学目标
1．掌握生物技术、农业生物技术定义。
2．掌握农业生物技术的应用方面。
3．了解农业生物技术的发展史。
四、教学重点、难点分析
重点：
1．农业生物技术概念。
2．农业生物技术的应用。
难点：
农业生物技术内涵。
五、教具
电化教学设备。
六、教学方法
讲授法，多媒体课件。
七、教学过程
Ⅰ导入
21世纪是一个高科技迅猛发展的世纪，生命科学和生物技术必将得到进一步发展和广泛的应用，那么什么是生物技术呢？它包括哪些方面呢？ 本次课我们就来学习生物技术、农业生物技术及其应用等方面的知识。
II新课
一、农业生物技术的内涵
1．生物技术的内涵
生物技术是指“利用细胞和分子过程来解决问题或制造产品的技术”。 
2．农业生物技术
农业生物技术是以农业生物为主要研究对象，以农业应用为目的，以现代生物技术为主体的综合性的技术体系。
农业生物技术是生物技术的重要组成部分，农业生物技术的创新和发展，将成为推动世界农业跨越式发展的主导力量。
二、农业生物技术的发展史
农业生物技术这项新兴的高新技术孕育于古老悠久的农业生产技术之中。从“刀耕火种”的原始农业时代，不断驯化选择野生生物进行栽种和饲养，这便是生物学、栽培学、耕作学、饲养学等学科的萌芽。19世纪中期，法国伟大的微生物学家巴斯德，首先揭示了发酵作用的实质是由微生物引起的，由此奠定了发酵工程的科学基础。遗传学三大规律发明者之一孟德尔，根据８年（1857~1865）的豌豆杂交试验结果，在1866年“植物杂交的试验”论文中阐述了性状遗传是受细胞中的遗传因子控制的，并首次提出了遗传学的分离规律和独立分配规律。美国科学家摩尔根等人用果蝇做了大量试验，进一步证实了孟德尔的两个遗传规律，并把他假定的遗传因子（即基因）以直线定位在细胞核内的染色体上，进而创立了基因论。这样，摩尔根发现的连锁与交换规律和孟德尔的分离规律、独立分配规律共称为遗传学三大基本规律，也就是人们常说的经典遗传学。
1944年阿委瑞等人用生物化学方法证实了染色体上的重要组成部分DNA是主要的遗传物质。1953年沃森（Watson）和克里克（Crick）通过X射线衍射分析研究，提出了DNA分子双螺旋结构模型，进而明确了基因是DNA分子上的一个区段，从而奠定了分子遗传学的基础。
1973年，转基因的技术问题被解决。1983年首次获得转基因植物，至今已有35科120多种植物转基因获得成功。
1902年，德国植物学家哈伯兰特（Haberlandt）提出了高等植物的器官和组织为多种细胞组成的观点，以及植物细胞全能性的理论，并首次发表了植物离体细胞培养实验的报告。自哈伯兰特的实验之后，直到1934年美国的怀特（White）由番茄根建立了第一个活跃生长的无性繁殖系，并反复转移到新鲜培养基中继代培养，使根的离体培养实验获得了真正的成功，并在以后28年间培养了1600代。这之后，怀特又以小麦根尖为材料，研究了光、温度、通气条件、pH、培养基组成等各种培养条件对生长的影响，并于1937年建立了第一个组织培养的综合培养基，该培养基后来被定名为White培养基。怀特于1943年发表了《植物组织培养手册》专著，使植物组织培养开始成为一门新兴的技术。
20世纪40年代，抗生素的发现不但引起了医药界的革命，使不少过去难以医治的传染病能有效地控制，而且也将传统的厌氧发酵技术发展成为现代化的深层通气搅拌培养，包括菌种的分离、选育、发酵器设计、空气净化、发酵条件以及产品分离、提纯等技术。人们可以利用这套技术大规模生产人类必需的氨基酸和维生素。
可以认为，20世纪40年代到60年代是奠定农业生物技术理论的阶段，而70年代以来，农业生物技术的应用才发生了质的飞跃，进入了实用阶段。生物技术作物、生物农药、生物肥料、名特优新植物的组培快繁、食用菌生产等迅速发展，在全球范围内显示出极好的发展前景。
三、农业生物技术的应用
1．生物技术作物
生物技术作物是指利用组织培养技术和基因重组技术引入其他生物或物种的基因而培育出来的作物，这种作物也叫基因改性作物或基因重组作物。
生物技术作物最初实现商品化是在1996年，全球的种植面积仅为170万hm2。而20##年，生物技术作物的种植面积已达到1.25亿hm2，种植的国家有25个。截至20##年，全球生物技术作物累计种植面积达到8亿hm2，距首次4亿hm2大关仅用时3年，而突破4亿hm2大关用了整整10年。
20##年，我国生物技术作物种植面积达380万hm2，在全球生物技术作物种植面积超过100万hm2的8个国家中排名第6。前三位分别是美国（6 250万hm2）、阿根廷（2 100万hm2）和巴西（1 580万hm2）。中国种植的生物技术作物包括棉花、番茄、杨树、牵牛花、抗病毒木瓜和甜椒。
2．生物农药
生物农药是指直接利用生物产生的生物活性物质或生物活体作为农药，如以虫治虫，以及人工合成的与天然化合物结构相同的农药。
生物农药具有生产原料来源广泛、对非靶标生物安全、毒副作用小、对环境兼容性好等特点，已成为全球农药产业发展的新趋势。
我国生物农药主要品种有Bt杀虫剂、农用抗生素、植物源农药、病毒类农药、真菌类农药、植物生长调节类农药，大宗产品仍以井冈霉素和Bt为主。在20##年原国家发展计划委员会高技术产业化示范工程项目中，天然植物源杀虫剂菊酯、年产6 000 t“武大绿洲”系列生物病毒杀虫剂、真菌生防制剂、复合微生物活菌制剂和年产5 000 t的寡聚糖生物农药5个生物农药项目获得批准。20##年又批准年产3 000 t“安徽奥绿”系列生物病毒杀虫剂、年产1×104 t宁南霉素、线虫生防制剂和年产3×104 t固体发酵Bt等生物农药项目。20##年登记的生物农药活性成分品种为140种，占我国农药总有效成分品种的15％；产品411个，占注册登记农药产品的8％；制剂年产量(12～13)×104 t，约占农药总产量的12％；年产值约3亿美元，占农药总产值的10％左右；使用面积约0.3亿多公顷。目前，每年新研制成功和登记注册的生物农药品种以4％的速度递增。
3．微生物肥料
微生物肥料是人工培养某些有益的土壤微生物而制成，有根瘤菌肥、固氮菌肥、磷细菌肥和钾细菌肥等，它们是以微生物的生命活动来改善植物营养，刺激植物生长或抑制有害病菌在土中活动，提高肥料的利用率，以提高作物产量。由于其本身的生产成本低、用量少、无毒无害、不污染环境的优点，国内外都在积极研究、开发和应用。
据不完全统计，目前我国生产微生物肥料的工厂超过300家。微生物肥料的年生产总量达到400多万吨。按我国每年仅大豆、花生两种豆科作物播种面积约1 100万hm2、一般国家使用根瘤菌肥料(接种剂类型)占播种豆科根瘤菌面积30％～50％计算，每年应有330～550万hm2的面积需要应用，年使用豆科根瘤菌剂至少应为26 500～80 000t，但实际我国花生、大豆生产中菌剂应用面积不足总播种面积的0.1％，应用缺口很大。其次，我国目前化肥实际用量达1.2亿吨以上，而微生物肥料年产仅百万吨(接种剂型仅占10％左右)，年产量仅为化肥的1/300，如果微生物肥料的产量达到化肥用量的3％左右，则可大幅度减少化肥用量，取得降低农民投入、提高产品品质、减少环境污染等巨大的经济、社会和生态效益。随着优良菌种的不断选育、生产工艺进一步完善和产品质量的不断提高，微生物肥料的生产及应用将会有更大的发展。
4．食用菌
食用菌是指真菌中人类能够食用的那部分种类的统称。据统计，我国目前食用菌的生产已经由1978年的5万吨增加到20##年的1 600多万吨，年产量已经占到世界总产的70％以上，居世界首位。20##年全国食用菌总产值突破600亿元，出口创汇11.2亿美元，在国内农业产值的排序中，食用菌仅次于粮、蔬、油、棉、果，居第六位，成为农业中一项新兴产业。据中国食用菌协会统计，目前全国食用菌产值超千万元人民币的县达到500多个，亿元以上的达100多个。
5．植物组织培养技术
植物组织培养技术指在离体条件下，把植物的一小部分组织或器官，如一个茎尖、一小块叶或一小段茎，接种于玻璃容器里的培养基上，使它们重新形成植株的一种方法。
组培快繁的商业性应用始于20世纪70年代的美国兰花工业，80年代已被认为是能够带来全球经济效益的产业。全世界组培苗的年产量呈逐年快速增长的趋势，每年的产量超过数十亿株，美国Wyford国际公司、印度American Hybird Seeds种子公司等每年的产量达到数千万株。由于组培苗越来越多地被生产者所接受，导致了组培新公司的诞生就像他们繁殖的植株数量一样以指数级增长。据估计，全球植物组培苗的贸易额约占生物技术产业年交易总额的10%，约150亿美元，并以每年15%的速度递增。
四、学习本课程的任务和目标
1 本课程是中等职业学校种植专业的一门主干专业课程。其任务是：使学生具备从事农业生产所必需的农业生物技术的基本知识和基本技能，培养学生的专业技术能力和综合职业能力，增强适应职业变化的能力、继续学习的能力和创新能力。
2本课程是一门实践性很强的课程，应根据当地农业生产发展的需要，在校内或有关生产单位集中强化训练农作物或园艺植物育种技术、优良品种组培快繁技术、农业微生物分离培养技术、食用菌栽培技术等。强化学生分析问题和解决问题的能力，提高学生的全面素质和综合职业能力，增强学生毕业后的就业竞争能力和自主创业能力。
III作业
1.简述农业生物技术的内涵。
2.简述农业生物技术的应用。
第二篇：农业生物技术第3章电子教案
第3章 农业微生物技术
第一节 农业微生物概述
一、授课章节
第一节 农业微生物概述。
二、学时安排
2学时。
三、教学目标
1．掌握微生物定义、特征、分类、命名法则。
2．掌握微生物大小形态。
3．掌握微生物的结构。
4．了解微生物的生活史。
5．熟悉微生物的营养。
四、教学重点、难点分析
重点： 1．微生物的定义、命名法则。
2．微生物的结构形态。
难点：
1．微生物结构。
2．微生物命名法则。
五、教具
电化教学设备。
六、教学方法
讲授法，多媒体课件。
七、教学过程
Ⅰ导入
本次课主要讲述微生物的基础知识，包括微生物定义、命名法则、形态结构等方面的知识。
II新课
一、微生物定义、分类
1
1．定义
微生物是指大量的、极其多样的、不借助显微镜看不见的微小生物类群的总称，通常包括病毒、亚病毒（类病毒、拟病毒、朊病毒）、具原核细胞结构的真细菌、古生菌以及具真核细胞结构的真菌（酵母、霉菌、蕈菌等）、原生动物和单细胞藻类。
2．微生物的分类
★简单分类
细胞生物微真菌、单细胞藻类、原生动物 真核生物
生 物非细胞生物病毒、亚病毒 原核生物真细菌、古细菌
★六界系统
19xx年，魏塔克，六界分别是病毒界、原生生物界、原核生物界、真菌界、植物界、动物界。
★三界学说
19xx年，伍斯，细菌域、古生菌域和真核生物域。
★安斯沃思(Ainsworth,1971)系统
分为真菌门和黏菌门，而真菌门又分为鞭毛菌亚门、接合菌亚门、子囊菌亚门、担子菌亚门和半知菌亚门。
3．微生物的命名法则
采用林奈双名法，此为国际命名法规，即每一微生物的学名都依属与种而命名，即属名 + 种名 + （首次定名人）+ 现定名人 + 定名年份。
属名：拉丁文的名词或作名词的形容词，字首大写，表示微生物的主要特点。
种名：为拉丁文形容词，为微生物次要特征，字首小写。
出现在分类学文献中的学名，在上述两部分之后还应加写3项内容，即首次定名人（正体字，用括号括住）、现名定名人（正体字）和现名的定名年份。如在一般书刊中出现学名时，则不必写上后3项内容。如Escherichia coli（大肠杆菌），Escherichia是属名，第一个字母大写；coli是种名，小写；均用斜体字。
三、微生物形态与大小
1．微生物的形态
细菌个体的基本形态可分为：球状、杆状和螺旋状，分别称为球菌、杆菌和螺旋菌； 2
放线菌的菌体为单细胞原核分支的放射状丝状体，菌丝体分为基内菌丝（营养菌丝）、气生菌丝和孢子丝；酵母菌的个体类似细菌，大多数为单细胞，一般呈球形、卵形或圆柱形，有些菌体能互相连接并延长成菌丝体，称假菌丝；霉菌营养体的基本单位是菌丝，菌丝通常呈管状。低等霉菌的菌丝没有横隔膜，称无隔菌丝，整个菌丝就是一个单细胞，菌丝内有许多核；高等霉菌的菌丝有横隔膜，称有隔菌丝，横隔膜将菌丝分隔成多个细胞，每个细胞含有1至多个细胞核。菌丝也像放线菌那样分为基内菌丝和气生菌丝，在气生菌丝顶端可产生各种孢子；担子菌和霉菌一样，也形成绒毛状的菌丝体，并能进一步形成大型子实体。
2．微生物的大小
细菌中单个球菌的直径多为０.５～１μm，杆菌多为（０.５～１）μm ×５μm，螺旋菌多为（０.５～２）μm ×（１～５０）μm。
放线菌的菌丝，宽度１μm 左右，无横隔。
酵母菌比细菌大得多，宽１～５μm ，长５～３０μm。
霉菌的菌丝，粗细不一，一般宽５～10μm ，少数小至０.５μm，大到100μm。
3．微生物的菌落特征
微生物在固体培养基上，由一个菌体在一定温度下经过一定时间的培养，生长繁殖成为肉眼可见并具有一定形状的群体结构，称为菌落。菌落的形状、大小、颜色、透明度、光泽及边缘形状等特点，因菌种不同而异，因而可作为菌种鉴定的依据。
细菌的菌落多数表面光滑、湿润、半透明或不透明，大多数呈圆形，也有呈分枝状或不规则扩展状。有的有颜色，有的表面干燥有褶纹。直径一般１～４mm。菌体与培养基结合不紧，用挑针容易挑起。
放线菌在固体培养基上一般为圆形、平坦或有皱褶，边缘有辐射状菌丝，质地紧密、坚实、不能无限扩张，形成孢子后，表面呈粉末状。由于菌丝和孢子都具有色素，所以菌落表面和背面的颜色往往不同。正面是孢子丝和孢子层的颜色，不同种类具有不同而稳定的色泽；背面是营养菌丝以及它们所分泌色素的颜色。
酵母菌的菌落形状与细菌的菌落相似，但比细菌菌落大而厚，多数不透明，一般为圆形，表面光滑、粘稠、湿润呈油脂状，多数为乳白色，少数为粉红色或红色，用接种针很容易从菌落中将菌挑起。培养时间较长的菌落，表面呈皱纹状，较干燥，颜色往往变暗。
霉菌的菌落由无数分支状菌丝体组成，呈绒毛状，棉絮状或蜘蛛网状，一般比细菌菌落大几倍至几十倍。在固体培养基上，霉菌菌落一般比较疏松，有些生长快的种类，能迅速蔓延扩展；有些种类生长则有局限性。菌落最初呈白色或浅色，这是菌丝的颜色。随后从菌落 3
的中央逐渐向外扩展，在菌丝上长出各种颜色的孢子，有时菌丝也能分泌一些色素，扩散到培养基内。所以不同霉菌在培养基的正面和反面显示出不同颜色，这些特征是鉴别霉菌的重要依据。
四、微生物结构
1．原核微生物的结构
细菌的细胞一般具有细胞壁、细胞膜、细胞质及原核等基本结构。有些还具有鞭毛、荚膜、芽孢等特殊结构
2．真核微生物的结构
酵母菌细胞由细胞壁、细胞膜、原生质、细胞核和其他内含物组成。
霉菌菌丝细胞的构造同酵母菌细胞相似，菌丝隔膜的中央有极小的孔，细胞质或养料可互相沟通，细胞核也可以通过。
五、微生物生活史
1．原核微生物生活史
2．真核微生物生活史
六、微生物营养代谢
1．微生物营养物质
微生物的生长需要碳源（凡能供给微生物碳素营养的物质）、氮源（凡能供给微生物氮素营养的物质）、无机盐（包括主要元素和微量元素）、生长因子（凡是微生物生长不可缺少的微量有机物质）、能量（光能或化学能）和水六大营养要素。
2．微生物的营养类型
根据微生物所需的碳源和能源的不同，将微生物分为光能自养型、光能异养型、化能自养型、化能异养型四种营养类型。
3．微生物培养基
培养基是以人工方法按照微生物的需要，用多种物质调制而成的适合不同微生物生长繁殖或积累代谢产物需要的一种营养基质。
III 作业
1.微生物命名法则是什么？
2.简述微生物的概念和特征？
3.如何对菌落进行形态描述？
4
第二节 农业微生物分离技术
一、授课章节
第二节 农业微生物分离技术。
二、学时安排
2学时。
三、教学目标
1．了解微生物分离基本思路。
2．掌握土壤中细菌分离的方法步骤。
3．掌握植物真菌分离的方法步骤。
四、教学重点、难点分析
重点：
1．细菌分离方法、步骤。
2．真菌分离方法、步骤。
难点：
1．细菌分离步骤。
2．真菌分离步骤。
五、教具
电化教学设备。
六、教学方法
讲授法，多媒体课件。
七、教学过程
Ⅰ导入
上节回顾：上节主要讲述了微生物基础知识，主要为微生物定义、分类、命名、结构、生活史、营养等方面的内容。
本节主要讲述农业微生物的分离技术，重点讲述细菌和真菌的分离技术。 II新课
一、微生物分离概述
1．菌种分离的方法和种类
将特定的微生物个体从群体中或从混杂的微生物群体中分离出来的技术叫做分离；在 5
特定环境中只让一种来自同一祖先的微生物群体生存的技术叫做纯化。
稀释法中的稀释涂布平板法、平板划线法、稀释摇管法较为常用，而鉴别分离法以鉴别培养基分离技术较为常见；丝状真菌和放线菌分离常常采用组织分离法、孢子分离法、饵诱法等等。
2．优势菌的分离思路
一般采用以下思路：细菌和单细胞微生物可以进行稀释，从而使得每一个细胞繁殖形成单菌落，进行分离；而丝状真菌可以进行孢子稀释，进而繁殖形成单菌落，在菌落还没产生孢子前，将平板上的单菌落挑出，进而得到纯化。
3．不占优势菌的分离思路
一般采用以下思路：先进行富集培养，即从微生物混合群开始,不断增加特定种的数量比例而引向纯培养，将要分离的目的菌数量提高上去以后，进而采用优势菌分离的思路进行分离。
二、土壤中细菌的分离
1．土壤中细菌分离所需要的工具
2．土壤中细菌分离技术路线
3．土壤中细菌分离步骤
（1）查资料、定方案
通过查阅资料，确定目的菌的采样地点、季节，分离的培养基配方、分离手段、鉴别手段、纯化方法等等，最终确定整个分离方案。
（2）土壤样品采样
采集土壤样品时，按统计学观点取样（图3-18），确定取样点。选好取样地点后，用小铲子除去表土，用采集器（图3-19，3-20，3-21，3-22）取离地面5～15cm处的土约10g，盛入事先灭菌的牛皮纸袋或塑料袋中，扎好，标记，记录采样时间、地点、环境条件等，以备查考。为了使土样中微生物的数量和类型尽量少变化，宜将样品分批带回实验室，以便及时分离。
（3）土壤样品预处理
样品预处理是制备菌悬液的过程，也是土壤浸提液的制备过程。首先将样品放到事先灭菌的研钵中研碎混匀，取5g置于事先放入玻璃珠的无菌三角瓶中，加入无菌水100mL，振荡摇匀5min，3层纱布过滤，取滤液备用。
（4）稀释分离
6
首先，将制备好的菌悬液，置于60℃水浴15min，进行梯度稀释（10-1，10-2，10-3……10-10），涂布于事先制备好的NA平板（牛肉膏蛋白胨培养基）上，然后30℃下培养，24h后观察。
（5）纯化
挑取培养平板上长出的乳白色菌落，接种到试管斜面上，30℃下培养，24h后观察，如发现菌落生长不均一，重复稀释法，直至纯化至满意为止。
（6）鉴定及性能测试
根据细菌鉴定方法（以《伯杰氏细菌鉴定手册（第八版）》为准）对细菌进行鉴定，并对有意义的生产性状进行进一步地研究。
4．土壤中细菌分离操作要点
（1）梯度稀释操作时，应注意每个稀释度的样品一定要摇匀。
（2）移液管口部灭菌前，要放置棉花，用报纸包扎好，灭菌备用。棉花可以起到过滤保护的作用。
（3）从每个梯度取样时，应注意每个梯度更换一支无菌移液管，防止交叉感染。
（4）涂布平板时，涂布器在培养皿中要正转三圈，反转三圈，涂布均匀。
5．土壤中细菌分离的注意事项
（1）采集来的样品应及时进行分离，不能立刻分离的应放于4℃冰箱中保存，保存时间不得超过24h。原因是微生物区系时刻发生着变化，越早分离越能分出原生态系中的菌种，减少由于环境变化引起的杂菌滋生。
（2）土样浸提液水浴温度不可高于75℃（非芽孢菌不要水浴），时间不得少于10 min，原因是温度过高会使一些耐热性较差的芽孢死亡，水浴时间过少，非芽孢菌存活下来的较多，造成分离的困难。
三、植物上的真菌分离
1．植物上的真菌分离所需要的工具
2．植物上的真菌分离技术路线
3．植物上的真菌分离步骤
（1）查资料、定方案
通过查阅资料，了解植物病原真菌的分离方法、真菌特性、培养基配方及培养条件等，确定方案。
（2）植物采样
采样样品时的天气最好选择阴天多云的日子，选择采集典型的病部叶片，叶斑病害应取 7
病健交界处进行分离。样品应尽快送往实验室分离。
（3）植物样品预处理
采集的叶片，先用洁净的清水洗去叶片上的灰尘和杂物，晾干备用。
（4）分离
取真菌性叶斑病的新鲜病叶，用剪刀剪取病健交界处的组织(边长4～5mm)数块；将病组织放入70%酒精中浸3～5s后，将病组织在0.1%升汞(氯化汞)液中消毒1min，然后在无菌水中连续漂洗3次，除去表面残留的消毒剂；按无菌操作规程将病组织移入平板培养基表面上，一般每皿放4～5块，并用玻璃铅笔注明培养材料的编号和种类；将平板培养基倒置后放入恒温箱内，在25℃下培养3～4d后，将分离的目的菌在无菌条件下移入斜面培养基上，淘汰杂菌。
（5）纯化
待平板上长出菌丝时，用解剖刀将菌落边缘切下，移入试管斜面，25℃培养，待长好后，4℃保藏备用。
（6）菌种鉴定及性能测定
根据真菌鉴定方法（以魏景超《真菌鉴定手册》为准）对真菌进行鉴定，并对有意义的生产性状进行进一步地研究。
4．植物上的真菌分离操作要点
（1）无菌水水洗时，每次不得少于3 min，洗涤时必须不断振荡，尽量洗下残留的升汞溶液。
（2）70%酒精处理时间不得多于30S，否则，叶片组织容易变黑，分离难度增大。
（3）培养基可以选用PDA培养基（马铃薯200 g，葡萄糖20 g，琼脂17～20 g，水1 000 mL），可以在此培养基中加入1~5%的植物组织浸提液，可提高分离效果。
（4）为了防止杂菌污染，可以加入抗生素，抑制杂菌，提高分离效果。例如，青霉素、硫酸庆大霉素、氯霉素等。
5．植物上的真菌分离注意事项
（1）升汞可先配成母液。方法是：升汞20 g，加浓盐酸100 mL，使用时取5mL原液加995 mL水即成；也可用升汞1 g，盐酸2.5 mL，水1 000 mL，先将升汞溶于盐酸中，再加水稀释即成。因升汞剧毒，通常在配制好的溶液中加入红色或蓝色的颜料。
（2）分离前还要用70%酒精擦拭双手，工作过程中，应尽量少说话，呼吸要轻。 8
III作业
1.优势菌的分离思路是什么？
2.简述土壤中细菌分离技术路线？
3.简述土壤样品采样方法？
4.土壤中细菌分离的注意事项？
第三节 农业微生物保藏技术
一、授课章节
第三节 农业微生物保藏技术。
二、学时安排
2学时。
三、教学目标
1．了解菌种保藏的依据、方法。
2．掌握常见的菌种保藏方法、步骤。
3．掌握菌种复壮的步骤。
四、教学重点、难点分析
重点：
1．微生物菌种保藏方法步骤。
．微生物菌种复壮步骤。
难点：
1．菌种保藏方法。
．菌种复壮步骤。
五、教具
电化教学设备。
六、教学方法
讲授法，多媒体课件。
七、教学过程
Ⅰ导入
上节回顾：上节主要学习了微生物的分离技术，主要是细菌和真菌分离技术。
9 2 2
本节主要讲述微生物保藏的基本依据、4℃斜面菌种保藏技术、明胶颗粒保藏技术、菌种复壮技术。
II新课
一、微生物保藏依据和方式
1．微生物保藏的基本依据
菌种保藏的基本依据是根据微生物的生理生化特点，人工制造环境条件，使微生物处于代谢不活泼，生长繁殖受抑制的休眠状态，即采取低温、干燥、缺氧等条件，使菌种暂时处于休眠状态。
2．微生物常见的保藏方式
保 藏 方 法
斜面室温保藏 适 用 范 围 各类微生物（除病毒外） 保 存 有 效 时 间 细菌、酵母菌1个月，霉菌、
放线菌2~8个月
细菌、酵母菌3个月，霉菌、
放线菌6个月
低温1～数年
低温1～20年
低温1～数年
低温1～数年
1～20年 斜面冰箱（4℃）保藏 各类微生物（除病毒外） 芽孢杆菌、产孢子的霉菌、放线菌 各类微生物 产大量孢子的霉菌 各类微生物（除病毒外） 各类微生物 砂土管保藏 冷冻干燥保藏 固体曲 载体保藏法（明胶颗粒、陶瓷珠、玻璃珠、硅胶颗粒等） 液氮保藏法
二、菌种保藏技术
（一） 4℃斜面菌种保藏技术
1．技术路线
待保藏的菌种 ? 活化 ? 接种培养 ? 选优 ? 保藏 ? 定期检查
2．操作步骤
将要保藏的菌种接种于培养基上，培养（细菌30℃，真菌28℃），随时观察，待试管斜面长成，这样的操作称为活化。然后选择生长良好的菌体或菌丝，重新转接，再培养后，选择生长优良的菌种，4℃低温保藏，定期检查菌种是否污染和损坏，剔除坏的，保存好的。
3．注意事项
（1）小心操作，防止写错编号及杂菌污染。
（2）转接时避开斜面上生长的白色斑点或与正常菌落外观有异的菌落，另外由于斜面 10
上生长的培养物不同部位菌体有差异，保藏过程中菌株的遗传性因此也有差异，为了尽可能保持其遗传特性的均一性，应沿琼脂斜面培养物全面地采用菌体或孢子，从平板培养物移种时，所采取的菌体或孢子应从不少于50个菌落中取得。同时，要有相当的斜面试管数目。
（3）培养基配方很重要，一般以碳水化合物浓度偏低的贫乏培养基为好。
（4）培养物繁殖速度不宜太快，培养中不要采取快速生长发育的培养条件。
（5）移种厌氧菌时，以用毛细吸管进行移植为好，一般不用接种环接种，并注意不让气泡混入培养基中。
（6）移植间隔时间因菌种特性，培养条件及保藏温度而异，以保藏温度影响最大，4℃保藏一般为3～6个月。
（二）明胶颗粒保藏技术
1．技术路线
待保藏的菌种 ? 活化 ? 菌悬液制备 ? 明胶颗粒制备 ? 硅胶管准备 ? 保藏 ? 定期检查
2．操作步骤
(1) 活化
待保藏菌种的活化与斜面菌种保藏法一致。
(2)菌悬液制备
将活化后的菌种接种于斜面，培养，选择优良的试管菌种制备菌悬液。在试管斜面上加入无菌水，使之覆盖整个斜面，再用无菌接种环轻轻刮下菌苔，将菌苔（培养基接种线上有母细胞繁殖长成的一片密集的、具有一定形态结构特征的菌体群落。）悬浮液倒入事先灭菌的三角瓶中（内装灭菌玻璃珠），振荡打散，制备成菌悬液备用。
(3)明胶颗粒制备
将2%明胶溶液灭菌，待冷却至45℃，即不烫手背为宜。将菌悬液倒入明胶溶液，摇匀，用无菌滴管吸取溶液，滴至事先备好的无菌石蜡平板上，待凝固后形成明胶颗粒。
(4)硅胶管准备
将硅胶颗粒和玻璃棉放入培养皿在160℃下干热灭菌2～3h，取出放入无菌操作台上，打开皿盖冷却，冷却后，将硅胶颗粒用无菌镊子转入无菌试管中，大约占试管的三分之一体积，再在硅胶颗粒上面铺上无菌玻璃棉，制成硅胶管。
(5)保藏及定期检查
将明胶颗粒放入硅胶管的玻璃棉上，再将硅胶管管口用石蜡封好。4℃低温保藏。定期 11
检查保存菌种管的情况。
3．注意事项
（1）整个过程要时刻注意无菌操作，稍有不慎，就会前功尽弃。
（2）制备明胶颗粒，要特别注意不要使明胶温度太低，否则，明胶很容易凝固，造成颗粒无法制备，最好少量配兑，一旦菌液全部加入，明胶凝固后再溶化将对菌体造成损害。
(3）硅胶管保存过程中，要注意硅胶颜色变化，一旦失效，应及时更换硅胶管或重新保种。
三、菌种复壮技术
1．菌种复壮技术路线
待复壮的菌种 ? 活化 ? 菌悬液制备 ? 涂布平板 ? 菌落形态鉴别 ? 选种保藏 ?生产性状测定 ? 选优保藏。
2．菌种复壮操作步骤
(1）菌种的活化：前文已有叙述，在此不再叙述了。
(2）菌悬液的制备：与明胶颗粒保藏法中的菌悬液制备相同。
(3）涂布平板：详见第二节菌种分离中的相关内容。
(4）菌落形态鉴别和选种保藏。
根据菌落的形态进行初步筛选，选出平板中未退化的菌落，将其挑出，不得少于25个菌落，接种于试管斜面上。
★性状优良的菌种菌落具有以下特征：孢子生长有减弱趋势；菌种中度大小，有偏小趋势，但不是极小；菌落偏小，而孢子生长丰富；孢子颜色有减弱的趋势；沟纹多、密、直而规整；营养菌丝分泌色素或逐渐加深或逐渐变浅。
★性状退化的菌种菌落具有以下特征：光秃；生长严重衰退，如长的过小，孢子量过少到影响正常生长繁殖；表面结构不均匀，孢子生长不均匀，孢子颜色不均匀，菌落表面产生白色斑点、或秃斑等。需要说明的是，在这一类菌落中，亦可能杂有高产型，但因其表型表现严重不纯，不宜选用，此类菌落在传代后往往遗传分化强，不稳定，不宜选择此类不纯的菌落；生长过于旺盛，如菌落生长特别快，直径特别大，孢子量特别丰富的野生型菌落类型。
(5）生产性状测定及选优保藏：对于保存下来的菌种，进行生产性状测定，比如产量、生产周期、原料利用率等等，综合考虑，选出优秀的菌种加以保存。
3．菌种复壮操作注意事项
（1）菌种复壮工作应该是定期进行，随时观察，一旦菌种退化，尽快处理。
12
（2）菌种复壮工作一次操作失败，可以重复以上操作，直至复壮成功。
（3）复壮后的菌种应妥善保管，定期检查，保存的菌种应该存有足够的数量。 III作业
1.简述明胶颗粒保藏技术操作步骤？
2.简述菌种复壮技术路线？
3.简述4℃斜面菌种保藏的注意事项。
第四节 农业微生物培养技术
一、授课章节
第四节 农业微生物培养技术。
二、学时安排
2学时。
三、教学目标
．掌握固体培养技术。
．掌握液体培养技术。
四、教学重点、难点分析
重点：
．固体培养技术。
．液体培养技术。
难点：
1．摇瓶培养技术。
2．发酵罐液体深层培养技术。
五、教具
电化教学设备。
六、教学方法
讲授法，多媒体课件。
七、教学过程
Ⅰ导入
13 1 2 1 2
上节回顾：上节主要讲述了微生物保藏技术和菌种复壮技术。
本节主要讲述微生物培养技术，主要包括固体培养技术、液体培养技术。
II新课
一、微生物固体培养技术
（一）平板培养技术
1．技术路线
斜面菌种 ? 活化 ? 平板接种 ? 培养 ? 收获
2．操作步骤
（1）菌种活化。
（2）平板接种。
固体培养基灭菌后倒入无菌培养皿中凝固之后制成平板。细菌和单细胞微生物的平板接种常使用划线和涂布的方法，而丝状真菌和产孢微生物常用点种接种方法。
（3）培养。
细菌培养温度一般在30℃下培养，真菌一般在28℃下培养，人体微生物培养温度一般在37℃。细菌一般培养24h，真菌需要2～3d。培养仪器一般为培养箱、霉菌培养箱、光照培养箱以及厌氧的二氧化碳培养箱等等。
（4）收获。
待培养的微生物培养一定时间，菌落或菌苔丰厚，应该及时收集起来，4℃保藏，以免出现老化现象。
3．注意事项
（1）接种工具一定要灭菌彻底，防止污染，培养过程中也要注意无菌操作。
（2）细菌收获一般在生长旺盛时期，真菌一般在产生大量成熟的孢子之后再收集。
（3）接种后的接种工具应及时消毒后存放，接种的工作台和无菌室也应进行消毒，保持洁净。放置培养箱的培养室也应定期消毒，防止污染。
（二）固体基料培养技术
1．技术路线
斜面菌种 ? 活化 ? 基料接种 ? 培养 ? 收获
2．操作步骤
（1）菌种活化。
（2）基料接种。
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基料指为培养微生物而配制的特定固体基质。例如，麸皮、锯末、马铃薯块、玉米粒等。基料接种时先将基料加热（100℃，30min）灭菌消毒，再接入10%基料量的菌种。
（3）培养及收获。
固体基料发酵的温度控制以基料表层温度为准，细菌一般为30℃，真菌为28℃。工业生产中往往为了避免杂菌污染，常选育耐高温菌种，培养温度常在40℃左右。培养一定时间后，及时收获。
3．注意事项
（1）固体培养多是粗放性培养方式，但也应注意环境卫生，定期对培养室进行消毒处理。
（2）基料接种培养得到的培养物，可作为生产用种子，进一步扩接生产。
二、微生物液体培养技术
（一）摇瓶培养技术
1．技术路线
斜面菌种?活化?摇瓶接种?振荡培养?收获
2. 操作步骤
（1）菌种活化：菌种的活化与斜面菌种保藏法一致。
（2）摇瓶接种: 一般500 mL三角瓶，装液体培养基100 mL，接种量一般为10%。
（3）振荡培养及收获 细菌一般在30℃，380～480 r/min振荡，培养24～48 h；真菌为28℃，200～300 r/min振荡，培养48～72 h，就可以收获了。
3. 注意事项
（1）细菌和单细胞微生物的菌悬液浓度要求必须大于106以上，最好108。
（2）产孢微生物的孢子液浓度要求必须大于106以上，最好108。
（3）对于以菌丝为主的种子，取生长旺盛的种子，按1：10体积分数进行接种。
（4）培养时一定注意防止杂菌污染，保证培养环境洁净。
（二）发酵罐液体深层培养技术
1. 技术路线
斜面菌种 ? 活化 ? 摇瓶种子培养 ? 发酵罐接种 ? 发酵与控制 ? 放罐 ? 收获
2. 操作步骤
（1）菌种活化：菌种的活化与斜面菌种保藏法一致。
（2）摇瓶接种培养：同摇瓶培养技术。
15
（3）发酵罐接种：发酵罐接种一般在火环保护下接种，接种量一般为10%，种子要求处于对数期或快速生长期。
（4）发酵与控制：在发酵过程中，要进行控温、控pH、控通气量、控转速、中间补料及消泡等操作，及时检测生物量、残糖量、粗蛋白含量等指标。
（5）放罐与收获：通过各种指标测定，综合判断发酵终点，收获发酵产物或进一步提取分离。
3. 注意事项
（1）接种时，应注意保持罐压在0.05MPa，停止搅拌，接种要快、准、稳。
（2）整个培养过程，都要维持发酵罐的罐内正压，一般为0.05 MPa。
（3）培养过程要注意防止染菌，及时取样检查和测定各项指标，保证发酵正常进行。
（4）发酵与控制。在发酵过程中，要进行控温、控pH、控通气量、控转速、中间补料及消泡等操作，及时检测生物量、残糖量、粗蛋白含量等指标。
III作业
1.简述摇瓶培养技术路线。
2.简述发酵罐液体深层培养技术路线。
3.简述固体基料培养技术路线。
第五节 微生物应用实例
一、授课章节
第五节 微生物应用实例。
二、学时安排
2学时。
三、教学目标
1．了解微生物在农业上的应用情况。
2．熟悉微生物农药的生产工艺。
3．熟悉微生物肥料的生产工艺。
四、教学重点、难点分析
重点：
1．微生物农药的生产工艺。
2．微生物肥料的生产工艺。
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难点：
1．微生物农药生产工艺。
2．微生物肥料生产工艺。
五、教具
电化教学设备。
六、教学方法
讲授法，多媒体课件。
七、教学过程
Ⅰ导入
上节回顾：主要讲述微生物培养技术，包括固体和液体培养技术。
本节主要讲述微生物农药和微生物肥料生产工艺和参数。
II新课
一、微生物应用概况
1．微生物在植物保护方面的应用
植物上的病虫害，长久以来依靠化学药剂控制，长时间大剂量的使用农药，不仅污染了环境，还使得一些病虫产生了抗药性，造成病害越来越难防治，只有不断加大药量，造成恶性循环。生物农药是公认的“无公害农药”，一般害虫不易产生抗药性，且选择性强，不伤害天敌；微生物繁殖快，能利用农副产品甚至工业废水作生产原料，广泛生产。
2．微生物在植物营养方面的应用
有益微生物在土壤中大量生长繁殖，增加土壤含氮量，如根瘤菌能在根瘤中固定氮素并被植物吸收，加快有机质在土壤中的腐烂分解，提高磷、钾养分的利用率；供给植物生长刺激类物质，或抑制植物病原菌的活动，从而提高了土壤肥力，改善了植物的营养条件，获得增产效果，如AM真菌是一种土壤真菌，它与多种植物根系共生，其菌丝可以吸收更多的营养供给植物吸收利用，尤其磷的吸收最明显，还可增加植物的抗病虫害和抗旱能力。因此可将微生物制成肥料加以应用。
二、微生物农药生产实例
1．微生物农药概述
微生物农药是利用微生物本身及其代谢产物来防治病、虫、杂草的制剂。一般分为微生物杀虫剂、微生物除草剂和农用抗生素三大类。
目前国内外研究最多、应用最广的是苏云金芽孢杆菌和乳状芽孢杆菌。正在试验和研究 17
的尚有蜡质芽孢杆菌、梭状芽孢杆菌、黏质雷氏菌以及气杆菌等。
苏云金芽孢杆菌制剂的生产可采用液体深层培养、固体发酵和液体浅层培养三种方法。其中，液体培养为大规模工业生产法，后两种则便于在农村、镇推广应用。
2．菌体农药生产的工艺流程
保藏的菌种 ? 活化 ? 摇瓶种子培养 ? 种子罐培养 ? 主发酵罐培养 ? 压滤 ? 粉碎 ? 成品 ? 检测 ? 入仓或出售
3．菌体农药生产的工艺参数
（1）菌种特性 苏云金芽孢杆菌属于真细菌目，芽孢杆菌科，芽孢杆菌属。大小为（0.8～
1.2）μm×（2.0～5.0）μm，周生鞭毛，革兰氏染色阳性，生活过程中形成芽孢和伴孢晶体，伴孢晶体是一种毒性蛋白。菌体生长对温度的要求不严，12～40℃均能生长，最适温度为27～32℃。对营养物质的要求也不高，能利用各种氮源、碳源和无机盐。苏云金芽孢杆菌是一种好氧性细菌，培养时要求通气，适宜的pH为7.0～7.2 。苏云金芽孢杆菌的治虫作用，主要是靠它在代谢过程中产生的毒素（δ-内毒素、α-外毒素、β-外毒素和γ-外毒素）。
（2）菌种活化 将保藏的砂土管菌种，接种于试管斜面上，30～32℃下，培养24 h。
（3）摇瓶种子培养 将活化后的试管斜面，制成菌悬液，按10%的接种量接入摇瓶（三角瓶）中，300 r/min，培养6～8 h。
（4）种子罐培养 将摇瓶种子接入种子罐，接种量为10%，控制通风比1∶1.1（即1体积液体培养基通1.1体积无菌空气）、搅拌转速400 r/min、温度30～32℃、初始pH7.0～
7.5，培养6～8h。在培养过程中及时消泡。
种子培养基配方：花生饼粉２％、蚕蛹粉0.5％、磷酸二氢钾0.04％、硫酸镁0.04％、植物油0.15 ％。
（5）主发酵罐培养 将种子罐中的种子接入主发酵罐中，接种量为10%，控制通风比1∶
1.5，搅拌转速400 r/min，温度30～32℃，初始pH 7.0～7.5，培养18～20 h。在培养过程中及时消泡。
（6）压滤、粉碎 发酵液及时镜检，80%的菌体产生芽孢，即到了发酵终点，将发酵液加碳酸钙10％ ，明矾1％吸附菌体，搅拌均匀后，用压滤机进行压滤，吹风，将过滤物放在60℃烘房内干燥后，粉碎，包装。
（7）成品检测 苏云金芽孢杆菌制剂的质量检验，常用的检验方法为血细胞板计数法、平皿培养计数法和生物测定法。
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先将10倍悬浮液移入水浴锅内80℃ 处理15min，计数，活孢子数应在109/g 以上视为合格。
（8）入仓或销售 成品存放应注意防潮、防火，及时销售。
4．菌体农药生产的注意事项
（1）发酵培养基配方和种子培养基配方一致，可以缩短发酵周期。
（2）不同的菌株，发酵条件不同，相同菌株，培养基原料来源不同也常使得培养条件发生偏差，需要重新优化确定。
（3）发酵过程注意防止杂菌污染，特别是生产环境和车间要定期消毒，操作人员应严格按照规程操作。
三、微生物肥料生产实例
1．微生物肥料概述
微生物肥料是指一类含有活微生物的特定制品，应用于农业生产中，作物能够获得特定的肥料效应，在这种效应的产生中，制品中活的微生物起关键作用。
目前已推广应用的微生物肥料主要有根瘤菌肥料、“5406”菌肥、磷细菌肥料、沼气发酵肥料等。
根瘤菌属于真细菌目，根瘤菌科，根瘤菌属，是一类能固定空气中游离氮素的细菌，根瘤菌肥料是用人工选育出来的优良根瘤菌菌种，通过大量繁殖制成的根瘤菌菌剂。将它接种于相应的豆科作物上，可以形成大量的有效根瘤，充分发挥固氮作用，促进豆科作物增产，提高土壤氮素含量。根瘤菌肥料是我国推广最早、效果最稳定的一种高效微生物肥料。根据研究，每亩豆科植物的根瘤菌，每年固定的氮素约6～16kg ，相当于25～75kg 硫酸铵。所以根瘤菌肥料对于提高作物产量，提高土壤肥力的作用是很大的。现以紫云英根瘤菌肥料的生产为例进行介绍。
2．菌体肥料生产的工艺流程
保藏的菌种?活化?摇瓶种子培养?种子罐培养?主发酵罐培养?检测
泥炭?干燥、粉碎、灭菌?制成吸附剂?吸附菌液?拌种?成品?检测
3．菌体肥料生产的工艺参数
（1）菌种活化 将保藏的砂土管菌种，接种于试管斜面上，25～30℃，培养3～5d，乳白半透明黏质状的菌苔长丰满后即可。
斜面培养基配方Ⅰ：蔗糖１％ 、磷酸氢二钾0.05％ 、硫酸镁0.02％ 、氯化钠0.02％ 、碳酸钙0.5％ 、酵母膏0.1％ 、微量元素（0.01％ 钼酸钠加0.5％ 硼酸）混合液0.4％ 、 19
水、琼脂2％ 。
斜面培养基配方Ⅱ：黄豆芽汁100％ ，加蔗糖1％ 、碳酸钙0.5％ 、琼脂2％ （黄豆汁制法：黄豆芽250～500 g ，加水500 mL ，煮沸30～50 min，纱布过滤，加水至1 000 mL 即成）。
（2）摇瓶种子培养 每支斜面菌种可接500 mL 三角瓶（每瓶装培养液150 mL）2～3瓶，接种时，每支斜面菌种管加无菌水10 mL，使菌苔悬浮于水中，而后接入三角瓶，在25～30℃ 下摇荡培养2～3 d。菌液呈乳白色，浑浊，无臭味。镜检菌体为均匀杆状，无杂菌，生物量3 × 109 cfu/mL 以上即合格。
摇瓶培养基配方与斜面培养基配方基本一致，只是不加琼脂，加食油一至数滴消沫。
（3）种子罐培养 培养基与摇瓶种子培养基相同，并加食油少量以消沫。培养时罐温保持28～30℃，罐压控制在0.05 MPa ，通气量为1∶（0.8～1.1），搅拌速度为360 r/min ，培养２d即可，接种量为6％～7％。同时培养过程中及时消泡。
（4）主发酵罐培养 培养时罐温保持28～30℃，罐压控制在0.05MPa，通气量为1∶0.8～1.1，搅拌速度为360r/min ，培养２d即可，接种量为6％～7％。
培养基与种子罐培养基相近，以缩短发酵周期，只是要考虑成本低廉并且获得方便。
（5）发酵液检测 及时测定发酵液的生物量，当发酵液含菌量达到2×109～1×1010个/mL时，即达到了发酵终点，可以放罐。
（6）泥炭预处理 泥炭一般偏酸性，应加些熟石灰或细炉灰，使其呈中性。在缺乏泥炭的地方，用菜园肥土或塘泥，加些细炉灰，使疏松易散，也可代替泥炭。由于泥炭和肥土中都含有大量微生物，经晒干、粉碎、过筛后，尚需进行灭菌，以免拌成菌肥后，大量杂菌继续生长繁殖，抑制根瘤菌的生长和发育，不能保证菌肥的质量。泥炭或肥土的灭菌，可装瓶或装袋用笼蒸灭菌，或0.15 MPa，120℃灭菌2 h。
（7）吸附剂制备 吸附剂配方一般采用泥炭（或风化煤）70％、肥土20％、煤渣灰或烟灰10％。其优点是含有机质丰富，吸湿性大，疏松通气，有利于拌入菌体的存活。
拌菌时加水到吸附剂最大持水量的35％～50％。拌菌要在无菌室内进行，拌菌量为固体料的12％～15％，拌菌后随即扎好瓶口或袋口，在25～30℃下放置２～３d，以使菌数继续增长。
（8）成品检测及入仓 合格菌肥应湿润疏松，不结成团块，含水量在30％ 左右，pH
6.8～7.6，菌肥菌体数量为2～3×108个/g，杂菌数量应控制在3～5％ 以下，无霉菌，结瘤效能为95％。菌肥贮存的温度，不宜超过25℃ ，最好在12℃ 以下，温度太高，根瘤菌 20
死亡率提高，菌肥使用的有效期缩短。常温下存放一般不能超过半年。
4．菌体肥料生产注意事项
（1）使用方法 主要采用拌种的方法。菌剂用量视种子大小而定，一般每１/15 hm用0.1～0.25 kg。使用时要做到随拌、随播、随盖才能保证其使用效果。
（2）用杀菌剂消毒的种子，要隔2～3 d再进行拌种，以防止杀菌剂毒害根瘤菌。
（3）根瘤菌肥料使用前，应贮存在阴凉通风干燥处，勿使受热受潮，以免生霉变质。2如果长霉变臭，就不宜使用；出厂日期超过半年往往失效，也不宜使用。
III作业
1.简述菌体农药生产的工艺流程？
2.简述菌体肥料生产的工艺流程？
3.简述微生物在农业上的应用？
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