开具诊断证明、病假证明管理规范

诊断证明书是具有一定法律效力的医疗文件，休学、司法鉴定、因病退休、工伤、残疾鉴定、保险索赔等要以诊断证明书作为依据之一。因此，开具诊断证明是政策性很强的医疗工作，为进一步加强管理，特作如下管理规定：

一、临床医师要以科学、严谨、实事求是的态度，认真开具诊断证明书和病假证明书，每项诊断都应具备客观、科学的诊断依据。

二、诊断证明书必须由本院登记注册的执业医师开具，出具诊断证明书的医师对所做出的诊断和处置结果负责。

三、临床医生开具疾病诊断书和病假证明书，应字迹清楚，项目填写齐全，病休时限必须大写，不得涂改。

四、门诊医师为门诊病人开具疾病诊断证明书，必须有本院相应的检查报告，诊断明确、依据充分，并在门诊病历中做相应的记录。

五、医师为门诊病人开具的疾病诊断证明书，应盖门诊印章，为住院病人开具诊断证明书由住院收费处盖章。持章 1

人对医师开具的疾病诊断书和病假证明书要认真审核，严格把关。

六、对学术上有争议的诊断，需开诊断证明书时，应由

医务科负责组织专家会诊讨论后，慎重开出诊断证明书。

七、凡涉及司法、办案需要，应在接到公检法、交通管

理部门等执法机关的介绍信报医务科备案后，方可开具诊断证明书。

八、医师不得为非本专科病人开具疾病诊断证明书和病

假证明书；在无诊断依据或未亲自诊治病人时，临床医师不得为病人开具相关证明书；临床医师不得出具各种护理级别证明、职业病确诊证明、工伤评残、劳动能力鉴定的证明书。

九、病假证明书只证明病人因病需要休息，休息时限按

诊疗规范填写，一般情况，急诊病人因病休息不超过3天，普通门诊病人不超过1周，确因为病情需要延长病休时间的复诊后再开病假证明书并且在门诊病历中记载；住院病人原则上病休时间不超过2周，特殊病人如肝炎、骨折等可酌情延长，但不超过12周，确因为病情需要延长病休时间的复诊后再开病休证明书。

十、为本院职工开具的诊断证明书和病假证明书，必须

由医师所在科室主任签字。

十一、对医师未按规定要求出具诊断证明书和病假证明

书产生不良后果的，视情节轻重给予通报批评、每例次罚款 2

200元、取消处方权1-3个月等处罚；引发医疗纠纷的按医院《医疗纠纷防范与处理预案》有关规定处理。

医务科

二零一五十一月十日

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医疗证明管理制度

医疗证明书是作为司法鉴定、因病退休、工伤、残疾鉴定、保险索赔等重要依据之一的具有一定法律效用的医疗文件。医疗证明包括疾病证明（患者门诊诊断书、患者出院诊断书、病情介绍）和死亡证明。

（一）开具证明者的资质：出院诊断书和死亡证明必须是本院执业医师；门诊诊断书必须是本院执业医师并为中级职称以上者。

（二）医师必须以科学、严谨、求实、端正的态度，认真开具诊断证明书，其内容必须与病历、诊疗手册记载一致。

（三）诊断证明书各项内容须填写清晰、完整，签章不清、未加盖医务部公章（或门诊办公室公章）的诊断书无效。

（四）开具的诊断证明一式两份，一份交给患者或其亲属，一份附于病历内。门诊患者诊断书保存在门诊办公室。

（五）医师不得开具非本专科疾病的诊断证明书，诊断书仅限于与诊疗相关的意见，不得出具其他内容。如因诊断书开具不当引起纠纷，追究当事人责任。

（六）凡涉及公、检、法办案和交通管理部门执法需要诊断证明者，须出具相关部门介绍信和其工作人员的身份证明方可出具诊断证明，并将其介绍信和身份证明复印件存于病历内。

（七）诊断书病名一律使用现代医学病名，以现代医学检查 4

的数据为佐证，诊断病名完整，主要处理意见，如休息方式及期限应记入病案，以备查考。

（八）慢性疾病原则上每次开具诊断书建议休息时间不超过1个月，—般疾病每次开具诊断书建议休息时间不超过1周，急症建议休息时间不超过3天。住院病人出院开具诊断书建议休息时间一般不超过2个月，如需继续休息，病人应到门诊就诊后，由门诊医生根据病情开具门诊诊断书。

（九）对服毒自杀、斗殴及交通肇事等伤害情况，可根据实际病情出具诊断书、（十）开具职业疾病诊断书，由职业病医院检查确定。

（十一）肝炎病人诊断书必须由肝脾胃病科出具。

（十二）患者如不慎将诊断书丢失，应在出具诊断书后1个月内，凭单位介绍信，

经门诊办公室同意，并在核实原诊断书存根后，复印诊断书存根并加盖门诊办公室公章。

（十三）医生在出具诊断书时，认真负责，实事求是，严禁开人情诊断书，如因诊断书开具不当引起纠纷，追究当事人责任。

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第二篇：病理科制度及管理规范-二类医疗技术申报附件

第一章 病理科规章制度

一、病理科工作制度总则

1. 临床科室所取活体组织标本，应使用合适的容器盛装并及时用10%中性福尔马林溶液充分浸泡固定，写明科别、姓名、性别及年龄，连同申请单一并及时送病理科。申请单必须由临床医师逐项填写清楚，如妇科标本须填月经史；骨标本等应填写影像学所见或将影像片给病理医师参考（准确的骨病理诊断要靠临床、病理和影像学三结合），送检医师签名。

2. 临床医师且勿自行切开、留取或任意翻转送检的大标本及脏器，不得提前将病灶挖出，确保所送检材的真实性、完整性和可检查性。如双侧器官的肿物切除或两个以上部位的标本，需分容器盛装或分别标记清楚；如有特殊需要注意的病灶、切缘等，请予以明显标记，以防出现差错。要求冷冻切片者，应在术前一日与病理科联系（有“术中冷冻切片病理诊断知情同意书”签字制度的单位，要协助病理医师做好签字工作）。

3. 各临床科室送检的细胞学标本，须保证新鲜；涂片标本应立即固定后送检。盛标本的容器必须洁净，严防污染，以免影响诊断。

4. 病理科接收标本时，要严格核对申请单各项填写是否齐全，标本与申请单记录是否相符、双侧或特殊要求的标本是否能确保分开，固定液是否合适。对于微小标本，必须认真核对是否有组织及其块数，无疑问之后才能接收，编号登记，安全存放，并为送检者签收。（验收标本人员不得改动、补充应由临床医师填写的内容）。对于申请单与标本不符，双侧及特殊要求标本不能区分，重要项目漏填，标本严重自溶、腐败、干涸及标本过小不能或难以制片等严重影响病理检查和诊断准确性的情况，应予以拒收。

5. 检查标本及取材要仔细，不可错号、漏号和污染，不得遗忘丢失。必须全面描述、字迹工整，认真地填写在工作单上。如有问题或标本辨认不清时，可请送检医师前来协助解决。需保留的大标本及时保留，有价值时要及时照相。

6. 包埋、切片及染色时，必须仔细核对统一的病理编号，遵守操作规程，保证质量，严防（错号、丢失和污染等）差错。

7. 实行医师逐级阅片制度，主检医师应密切结合临床，全面分析病变，认真做出诊断（有特殊情况应与临床医师取得联系并有记录）。疑难病例要请上级医师复诊或外出会诊。

8. 需做特染、免疫组化等项目者，要填写工作单，注明染色目的及要求，并及时提交技术室或免疫室执行。

9．病理报告要及时送出，临床科室收到报告时要签字，备存查。冷冻切片一般于收到标本后30分钟左右发出报告；细胞学检查一般于12～24小时发出报告；常规活检标本3～5个工作日发出报告；特殊病例、科研内容的报告视情况决定（需要做特染、免疫组化等特殊情况需延发报告时，送达临床“迟发报告通知单”）。

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10．冷冻切片的剩余标本，应做石蜡切片，以便核实冷冻切片诊断。冷冻切片和石蜡切片一并存档。

11．外检标本报告发出后保留2周，存留标本需注明病理号、诊断及病变说明。

12. 要求查阅病理报告者，应由本室人员代查，不得自行翻阅。借用标本、切片及档案资料，须经本科同意。院外借用切片需按本科规定，办理借用手续。蜡块概不外借（特殊情况需经上级领导批准）。

13. 严格药品及试剂的管理。药品试剂瓶标签要醒目。称取染料、试剂后，及时登记使用量、使用日期及使用人。易燃、易爆、剧毒药品由专人保管。

14. 要详知各种仪器的操作方法，严守操作规程。

15. 活检及细胞学的申请单、病理切片、蜡块、照片、电脑内业务资料等均应及时进行分类、整理、编目归档保存；活检、细胞学等文字资料分别整理、定期装订，并由专人保管，长期保存。

二、术中快速冷冻病理诊断工作制度

手术中快速冷冻切片病理诊断（以下简称“冷冻”）是将手术切下的病变组织在冷冻切片机中迅速冷冻后制成切片，进行病理诊断。一般在30分钟左右得出诊断意见，为临床手术提供参考。冷冻是一种高技术、高难度、高风险的病理项目。其主要作用：⑴确定送检标本组织是否有病变存在；⑵确定病变或肿瘤的性质；⑶确定手术切缘有否肿瘤；⑷确定送检组织有否癌浸润或转移等。但由于取材局限、标本冰晶及时间短等问题，冷冻切片质量不能达到常规石蜡切片的精确度，诊断准确率受到影响。可以出现以下情况： ⑴只能做良、恶性鉴别，为临床提供一个参考性意见；（2）诊断困难，允许发延迟报告或等待石蜡切片诊断，发出最终报告；（3）冷冻诊断与常规石蜡诊断不符时，以石蜡切片报告为准。二级医院要求冷冻诊断的准确率≥90%。为减少和防止医疗差错和纠纷，有利于此项工作的规范化开展，特制定该制度。

1. “冷冻”预约规定：需做术中快速冷冻病理诊断时，各手术科室提前1～2天详细填写冷冻申请单送病理科。要求尽可能填全各项内容（病理医师根据所填内容了解病情，必要时应下病房查病人、看病历或请病人来病理科接受查体），并注明做冷冻的具体时间（年、月、日、时），以便病理科做好准备；除填临床诊断外，请提出要解决的问题，如确定“病变性质”、“切缘有否浸润”、“淋巴结有否转移”等。送冷冻标本时应同时送交“术中病人情况所见通知单”。一般不提倡急诊“冷冻”申请。如确需急诊冷冻时，要及时与病理科主任联系，说明情况。病理科尽量创造条件，满足临床需要。

2. 实行“手术中快速冷冻病理诊断知情同意书”签字制度。术前由病理及临床医师，在病理科共同向病人和其家属谈话，交代冷冻有关事项，征得其理解、同意并签字。“知情同意书”存于病理科。

3. 冷冻病理诊断一般30分钟左右发报告，遇特殊情况时间可以适当延长。实行主治医师以上双签字发报告。

4. 遇到冷冻病理诊断中的交界性病变及“灰色病变”难以确诊时，首先在科内讨论，如意见仍难以统一，不能勉强发报告。要及时向手术医师通报情况，或允许延缓出报告， 2

必要时待常规石蜡切片后再诊断。临床医师和/或病理医师要向患者及家属讲明情况，取得理解并记录于病历中。

5. 建立冷冻报告登记及随诊制度：冷冻切片剩余组织，一律做石蜡切片对照。对与最后诊断不符的报告要组织相关医师讨论和随诊，以利提高诊断水平。

三、病理科活检制度

1. 取材前标本验收者要与取材医师核查标本与申请单，每日统一取材。

2. 病理取材要标准化、规范。肉眼检查标本（巨检）和切取组织块（取材）必须由病理医师进行。并对巨检、测量和取材内容详细描述。记录人员应根据申请单内容，向医师报告临床情况、手术所见、标本情况及临床医师要求，并应详尽、准确、字迹清楚地记录病理医师的口头描述。

3. 细小标本要用伊红点染并用软薄纸妥善包裹。

4. 每例标本取材前后，应用流水彻底清洗取材台面和所有器械、物品，严防污染和防止细小检材被流水冲走。

5. 所有病例在取材前应留下大体摄影资料。一般标本在报告发出后2周可以（按病理标本处理规定）处理掉。

6. 制片过程严防错号，切片质量应薄、完整、染色清晰。

7. 认真填写和打印病理报告单，经核对后再发出报告，严防错、白字，报告要做到及时准确。

四、病理科细胞学检查制度

1. 细胞学检查材料较多者，可使用肿瘤（或脱落）细胞检查申请单，并应单独编号。

2. 收集的检查材料及时送检，胸腹水及时离心、涂片、固定。

3. 注意采集检查材料和制片的方法，提高阳性率。

4. 涂片在固定、染色中切忌污染或错号。

5. 观片时应注意全片所见，切忌片面性。

6. 报告时，尽量做出肯定性判断，查见癌细胞时，尽量提示分类，但不能勉强。

六、病理科档案资料管理制度

病理资料是国家财产，属医院所有，病理科管理。主要用途为：作为日常工作需要查阅、核实的资料，掌握病人的病情变化，为临床和病人提供更准确的信息；作为培养年轻病理医师、进修生和研究生等的学习资料；作为工作人员课题资料等。病理科对资料实行专人负责，规范化、制度化管理，有严格的借阅手续和使用规定，请认真遵守，严格执行。

（一）、病理科资料管理规定：

1. 病理科文字资料要保存完好，防止人为污染和混乱，杜绝丢失。平时注意按病理编号排序，活检及细胞申请单按400张，分袋保存，定期分别整理、装订成册，便于长期保管使用。提倡编制索引。活检可及时分别编制索引卡，便于查阅。

2. 装订成册的文字档案资料，按顺序上架存放，专人保管，严禁损坏和丢失，长期处于利于工作和再利用状态。切片、蜡块由技术室负责人员妥善保管，按序号存放，严禁损坏（严禁被耗子咬损档案蜡块）和丢失（不允许个人长期保存档案切片和蜡块）。出现 3

问题及时向科主任反映，并查找原因，适当解决。严重时追查责任或按医院文件规定处理。

3. 病理科文字档案资料包括活检申请单、冷冻申请单和细胞申请单；活检登记本、冷冻登记本和细胞登记本等允许科内及院内职工借阅 ，但需要经管理人员办理借阅手续，在病理科工作室内查阅。原则上不允许外借，不许整页复印（可以摘录）。有医学鉴定和司法公证用途者，需经院领导批准，另行处理。

4. 病理科日常切片和档案切片可以外借，但必须履行借用手续；蜡块原则上一律不许外借，有重要用者尤其是有医疗纠纷倾向病例的蜡块和切片，必须经院、科领导批准，方可借用。

6. 病理蜡块再切或课题使用，原则上要在病理科中，经本科技术人员切片。要珍惜蜡块中的组织，每次将使用量降至最少（将蜡块与切片刀调平后再切，防止修光、切净其中组织），保持蜡块再利用率，保证档案资源可持续利用。

（二）、病理科档案资料借阅、使用手续及注意事项：

1. 病理科的日常文字资料，本科人员在工作中使用后，立即放回原处，按顺序归位；工作中使用档案资料要经管理者知道；其他情况下使用部分资料，要经管理人员办理借阅签字手续，并短期内（限期）归还。

2. 病理科工作人员使用日常切片后，要及时按顺序放回原处；复习、利用档案中部分切片要经管理人员知道，用后及时按顺序全部归还。

3. 外界借用日常或档案病理切片，由上级医师重新审查切片的诊断，并经切片管理人员开据借片字据、借片人签字、交押金后方可借出。借片人要按期归还所借切片并在还片时提供所去会诊单位的诊断意见；损坏了切片押金不退。

4. 病理科工作中使用后的蜡块，要及时处理、按顺序归档保存。使用蜡块做课题研究，要经科主任批准。挑选蜡块时要有标记，并且登记在案，使用后如数归位并撤出其中标记，要保护蜡块并保持其次序。除经批准的科内人员课题，可免费使用蜡块外；其他人员要有科研经费支持，有偿使用病理蜡块；并避免蜡块中组织用完，留有再利用余地。

七、病理科查对及每日工作流程交接班制度

1. 接收标本时，查对申请单位、患者姓名、性别、住院号、标本与申请单连号、标本数量标记、固定液情况及申请医师姓名。

2. 取材结束后病理医师应向技术组当面交付组织块，并点清块数，记录在交接工作单上，技术员签收。有要求特殊处理的标本（如脱钙、糖原染色等）应作文字记载，以便加以特殊处理。3. 组织包埋完成后，必须当即清点蜡块数量，以防组织块在脱水、包埋过程中遗失。

4. 制片时，查对编号、标本种类、切片数量和质量。

5. 切片完成后技术人员签名，交付诊断医师时，双方必须按照记录当面清点，医师在交接工作单上签收。

6. 诊断时查对编号、标本种类、临床诊断、既往病理诊断等。有问题要及时与技术人员或临床医师联系。

7. 发报告时查对记录单与报告单是否相符，并与申请单核对。

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8. 医师在诊断完成后，将切片及申请单交付档案室时，双方必须当面清点，并作记录，技术人员归档，技术员在交接工作单上签收。

八、病理诊断报告签发与回报制度

1. 病理医师对活检标本应认真全面的进行大体检查和显微镜检查，对其镜下所见观察清楚，病理诊断真实、准确。

2. 医师以下人员、进修及实习人员不能单独签发病理诊断报告，需由病理医师以上人员签名方可发出。

3. 诊断报告发出期限：①常规病理检查，在收到标本3～5个工作日内发出病理报告。②特殊标本检查如结核、骨性标本等根据不同情况在14日内发出报告（迟发报告，应通知临床）。③术中快速冷冻诊断，手术医师应于术前1～2天通知病理科（并签属“知情同意书”），以便病理医师作必要的准备。采用冷冻切片法，一般在30分钟左右做出诊断；用快速石蜡法在50分钟内发出报告。④细胞学检查，一般在12～24小时发出报告。⑥接收会诊病例视情况而定，一般在30分钟～1小时发出报告，需要工作一般在12～24小时发出报告。

九、病理诊断及疑难病例会诊和报告签字制度

临床病理诊断的正确与否及其确切程度，关系到患者的疾病能否及时地获得正确诊治。为严谨、规范地做好病理诊断、疑难病例会诊及签发报告工作，特制定该项制度。

（一）、病理与临床沟通，疑难病例会诊

1. 要经常与有关临床医师进行临床-病理会诊与沟通，了解临床医师的诊断思考和病人情况，将临床医师提供的信息备注于病理申请单中，并向临床医师通报病理诊断的疑难情况、初步拟诊以及延期签发报告的原因。

2. 必要时病理科医师应会见患者和其家属等，了解病情，说明病理诊断的疑难情况和延期签发报告的原因等。

3. 遇有疑难病例，在辅以其他病理技术检查措施，如深切或连续切片，做相关特染和免疫组化，再观察大体标本和补充取材等情况下，仍出现病理医师不能明确诊断或者两个以上的病理医师意见不一致时，可以提出病理会诊。对与最后诊断不符的活检报告，要组织相关医师讨论，接受经验教训，以利提高诊断医师素质和诊断符合率。

3. 加强签发疑难病例报告前的病理会诊。签发报告前应进行科内集体讨论，必要时可经外院专家会诊，或主动介绍、协助患者或家属携带病理切片到外院、外地有关病理专家处会诊，以利提高疑难病变诊断水平、防范诊断失误。

（二）、病理报告形式与签发规定

1. 病理报告一般分四类：Ⅰ类：部位、名称、性质明确和基本明确的病理诊断。Ⅱ类：不能完全肯定名称、性质的病例，尚无足够根据确定某种疾病或增生性质是良性、交界性或恶性的模糊性病变，可以冠以“符合为…”、“考虑为…”、“倾向为…”、“提示为…”、“可能为…”、“疑为…”、“不排除（除外）…”之类的名词做病理诊断，提供给临床参考。Ⅲ类：检材、切片所显示的病变不足以做出Ⅰ类或Ⅱ类诊断，只能进行病理描述性诊断。Ⅳ类：标本过于细小、破碎、固定不当、自溶、严重受挤压（变形）、被烧灼、干涸等， 5

无法做出病理诊断。

2. 经科内讨论及会诊后仍属疑难病例者，可将各位会诊专家的意见列于病理报告中。必要时对病理诊断或相关问题提出“再取活检”、“密切随访”和“做某些其他检查”等建议。

3. 对疑难病例实行三级医师检诊制度。初、中级病理医师根据镜下观察，结合大体标本所见、辅助性检查结果、相关的临床基本资料和科内、外会诊意见，做出初步病理诊断交上级医师复诊、审查后可由初诊医师签发报告。对疑难、分歧病例和冷冻后病例的病理报告，要实行主检医师和上级医师双签字。所有病理报告均可标明制片者和特染者姓名。

4. 实行病理诊断随访制度。尤其对疑难病例和诊断不确切的病例更应加强随访，以利诊断水平的提高、资料的科学性和可靠性。

十、病理科免疫组化室工作制度

1．按免疫组化和特染工作单要求，及时制片，一般要在1～2日出结果。

2．严格按照免疫组化标准的操作方法认真制片，要求修复的抗体不能省略该程序，确保制片质量。制片时应做到四核对(对蜡块的号码、标记的项目、抗体的种类和浓度进行核对)。

3．实验室的各种仪器设备，由专人保管和使用，未经保管人允许或主任批准禁止他人使用，精密贵重仪器由专人负责，操作按程序，不得违章操作。

4．各种免疫试剂应由专人负责保管，并有购买批号、品名、类别、数量、耗用、库存的数量账目及过期日期。

5．认真做好免疫室文字资料的记录、登记工作，加强各种资料的保管，防止资料丢失。统计报表及时。

6．DAB为强致癌物，其废液的处理，应存放于指定容器中，不得随意倾弃！

7．保持室内整齐清洁，防止火、水、电、窃等事故发生。

十一、病理科仪器设备的使用保养制度

1. 显微镜：放置于干燥、较少灰尘的房间，勿暴露在日光中；电光源显微镜使用完毕后先将亮度打到最小，然后关闭电源；目镜上的灰尘，应该先用吸耳球吹净，再用镜头纸由内向外擦拭；物镜应用镜头纸擦拭，如镜头粘到树胶，需先用镜头纸蘸上少许二甲苯擦拭，再用镜头纸立即将二甲苯擦干。每次用完后需用罩子盖好。定期清洁。

2. 切片机：切片时用力均匀，每次用完后将机器清扫干净，然后按说明书要求用松节油等擦拭，需要加油的地方加上润滑油。

3. 自动脱水机：设定好程序，检查液体瓶（缸）是否放稳，浸蜡用石蜡可过滤，每次用完后必须擦拭干净。

4. 温箱：定时检查水位、设定温度和电源安全。

5. 冷冻切片机（恒冷式）：为保证压缩机正常工作，不应经常开关，以24小时恒温(-15℃～-20℃)为佳。夜间应设定自动除霜，并定期停机清洗，以保证冷冻切片机工作室内清洁和压缩机正常制冷。

6. 其他仪器设备，同样要按其使用说明书中的使用保养要求使用保养。

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十二、病理科安全防范制度

（一）医疗安全防范

1. 医疗安全人人有责，安全意识牢记在每一个职工心中，安全措施贯穿到每一个工作岗位。

2. 严格执行岗位责任制，按工作流程完成自己的任务，认真填写每一个岗位工作流程表，下游岗位负责检查上游工作质量与安全，最后检查最终工作质量和整个工作流程安全。

3. 严格执行各种工作制度，技术工作要精益求精。

4. 严格窗口、取材、包埋、切片；看片和诊断工作岗位核对及审查制度，严防技术、诊断差错、事故发生。

5. 严格执行三级医师诊断、双签字制度，室内和室间会诊、讨论等质控制度，严防诊断报告差错、事故发生。

6. 出现技术或诊断差错立即逐级汇报，采取积极措施纠正，将影响减少到最低限度；技术水平问题，采取学习、讨论措施，达到提高目的；技术责任差错，当事人事后检讨，采取预防措施；造成严重影响和经济损失时，除了执行医院规定外，科内酌情教育，减免奖金。

（二）实验室安全防范

1. 实验室应通风，对有害于健康的试剂要妥善管理，使用时要有防护意识。避免乱倒乱丢，处理时应采取安全措施；避免易燃、易挥发试剂及气体接触明火引起燃烧与爆炸。

2. 实验室废弃物、废弃的组织应集中存放在福尔马林固定液中，到期按上级病理废物规定程序处理。对其它废弃物可采用常规处理。

3. 实验室的重要仪器应有使用说明，注明该仪器的用电安全规定和操作程序。易燃物质应贮存于安全的房间，放于专用柜内保存，实验室应具备防火设备，如灭火器等。

4. 特殊危险品包括：许多试剂用叠氮化钠作为防腐剂。假如含叠氮化钠液体排进下水管道里，在管道内叠化物有形成金属叠化物的倾向也有爆炸的危险。联苯胺、苯、蒽、萘酚所含的复合物是致癌物，最好少用或者不用。含汞的液体（Zenker's,和B-5液）废弃液应收集在适当的容器内，如果汞排入下水中，汞与金属结合形成汞合金，汞合金形成后不容易被清除。

（三） 设备及安全防范

1. 大型设备使用、保养和保管要专人负责，落实到人头。

2. 严防设备等财产损坏、丢失。

3. 严格按院级规定使用电炉子和其他易发生失火或用电伤人的电器。

4. 严格执行院级的安全、防火等规定，采取一切措施，确保工作人员人身安全和国家财产安全。

十三、病理科各级各类人员岗位职责

（一）、病理科主任职责

1. 在院长领导下，负责本科的医疗、教学、科研及行政管理工作。

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2. 制定本科工作计划，组织实施，经常督促检查，按期总结汇报。

3. 督促本科人员认真执行各项规章制度和技术操作规程，保证检查结果准确。

4. 参加疑难病例的病理检查，组织病理讨论。

5. 参加会诊和临床病理讨论会，经常与临床科室取得联系，征求意见，改进工作。

6. 督促科内人员做好病理资料的积累和保管，搞好登记、统计工作。

7. 负责组织本科人员的业务训练和技术考核，培养研究生和年轻力量，提出升、调、奖、惩的具体意见。

8. 参加学术会议，学习国内、外先进经验，不断知识更新，开展科学研究和技术革新工作。

副主任协助主任负责一定的管理工作，主任不在科期间，副主任可代理主任工作。

（二）、病理科主治以上医师职责

1. 在科主任领导下，具体帮助和指导医师、研究生、进修医师和实习生学习、工作。

2. 着重担任重要的病理检查诊断，审查疑难的病理诊断报告，参加会诊、教学、科研工作。

3. 其他职责与病理科医师相同。

（三）、病理科医师职责

1. 在病理科主任领导和上级医师的指导下进行工作。

2. 负责活体组织取材和尸检工作，认真做出初步病理诊断报告，发现疑难问题及时请示上级医师。

3.担负一定的科研、教学任务，作好进修生、实习生的培训工作。

4. 认真执行各项规章制度和技术操作规程，严防差错事故。

5.参加临床病理讨论会，做好讨论记录。

（四）、病理科技术人员职责

1. 在病理科主任领导和医师指导下进行技术工作，协助病理诊断；参与教学和科研等工作。

2. 按操作规程进行组织脱水、包埋、切片、染色，保证制片质量。开展免疫组化和分子生物学等新技术。

3. 协助医师进行尸检技术工作；负责读片会、临床病理讨论会等业务活动前的准备工作。

4. 负责病理标本接收、查对、登记、记录；切片、蜡块等资料的整理、积累和保管工作，作好经济收入的统计工作。

5. 负责一般药品、器材、染料等的请领和保管。

主管技师以上技术人员主要职责是承担难度较大的技术工作和新技术项目，可担负一定的技术室管理工作。

进修生、实习生主要职责是协助医师工作；非编人员主要职责是协助技术员一些简单工作及科内杂务工作。

十四、病理科工作人员业务学习、培训、进修制度

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临床病理学工作范畴涉及到人体从头到脚，从表皮到内脏的各系统、各器官和各种组织，其中各种有形态变化的疾病和各种类型肿瘤的定性诊断主要依赖于病理诊断，尤其对恶性肿瘤的诊断工作，责任重大。因此，要求病理工作者要有严谨的工作作风，科学的工作态度，勤奋努力的学习精神；学习前人的经验，接受先进的技术，不断知识更新，不断改进创新，才能以丰富的知识，准确的诊断和精湛技术为病人、为临床服务。为此，年轻的病理工作者，要将在学校学到的知识运用于病理工作中，还要在实践中学习、向老同志学习、向书本学习、向网络信息学习。积极参加科室或学术会，根据工作需求到省外或国外进修。积极参加省级、国家、国际和网络的学术会议，接受国内、国外新技术、新知识。

1. 每天遇到疑难病例切片或业务难题，实行科内会诊制、查找资料，及时解决，更新知识，不断进步。

2. 每月1-2次固定时间，举行病理诊断组和技术组的业务学习、技术研讨、技术评比，提倡每天共同读片。

3.每年派人员参加省级以上病理学会组织的学术会；争取参加国家级专业学术会议，参与学术讨论，取长补短，知识更新。

4. 年轻医师和技术员，一般在工作三、五年以后要选派至少一次到上级临床病理培训基地或大型综合医院（或专科医院）进修一年。高年资医师以短期专科、专项进修和参加专题学习班为主。

5. 提倡各级病理工作者，积极撰写专业论文。提倡病理科人员搞科研、参加教学、招收进修生和研究生。教学相长，研究创新。

6．设科室图书角、订阅本专业及相关专业杂志，以了解专业学术动态，掌握专业发展方向，使本科室的工作与国内乃至国际接轨。

十五、病理科日常工作中诊断与技术人员的岗位责任分工和奖惩规定

在病理科日常工作中，优良的工作质量和高超的诊断水平，凝聚着全科技术和诊断人员的辛勤汗水。各项繁杂的工作程序也体现着每一个岗位工作者的职责。为体现病理科团结协作精神，共同保证工作质量，防范差错事故，制定该责任分工和奖惩规定。激励同志们对工作认真负责、对技术精益求精。

（一）、日常工作责任分工：

1. 确保病理检查申请单填报的病例与相关标本是同一患者。认真核查送检标本容器是否带有申请单的联号纸条并与容器牢固黏附，该纸条上的联号、姓名是否与申请单上的联号、姓名一致。如有误差，应会同送件人查明原因并纠正后方可收验，否则拒收（收验者为第一责任人）。

2. 接收送检标本时，认真检查标本是否与相关患者申请单中填写的标本内容和数量一致；检查申请单各项是否填全，尤其割取部位及送检标本是否标记清楚。双侧器官的标本必须分别标记或分容器成装。如有误差，收验人应与送检人立即核实，经纠正后方可收验，否则拒收（收验者为第一责任人）。

3. 认真登记编号。每例患者申请单上的编号必须与病理登记本上的相应病例编号一致。严防在登记本上漏登、重登或跳号登记，以免造成病理号混乱。并确保该例标本的病 9

理编号在制片流程中的任何环节始终一致无误（登记者为第一责任人）。

4. 对于微小标本检材（如窥镜咬检材料，有时甚至仅为少许黏液），收验者应向送检人说明，不保证制片成功，只能试做并在申请单上注明“试制片”，同时有送检人签名同意。（收验者为第一责任人）。

5. 收验者应根据标本的大小，及时调整合适的容器、添加足够的固定液，保证标本固定良好。取材前收验者应妥善地将标本移交给取材者，严防放置标本的容器错乱、倾倒、破损等（收验者为第一责任人；取材者为第二责任人）。

6. 取材者应与收验者逐例按申请单的记载，认真核对标本的内容和数量是否一致。如有误差，应立即逆向反馈，查明原因，妥善处理。存在严重问题应向科主任汇报（收验标本者为第一责任人；取材医师核实标本者为第二责任人）。

7. 在取材操作过程中，应首先由记录者阅读申请单各项，进一步核实；如与申请单有严重不符或标本辨认困难等情况，可请有关临床医师到场协助，解决后再取材。记录者应尽可能地详细记录取材者对大体标本的语言描述和测量数据。注意体积的记录用cm3；直径记录用cm。仔细记录特殊部位取材情况并严密编号区分（用小号或亚号）。保证取材块与小纸条标记一致并包、放在一起。最后核实总块数予以记录，并签署取材者和记录者的姓名及日期。记录者应是负责包埋该批标本的技术人员（取材者和记录者均为第一责任人）。

8. 取材者在倾倒标本容器固定液、用流水冲洗取材台面时，尤其要警惕细小标本的丢失。每例取材后必须用流水冲洗取材台面、器械、工具和敷料等，确保无污染（记录者要经常提醒取材者清洗；取材者为第一责任人）。

9. 确保组织块如数、准确地连同相应的编号小条一并脱水，使用金属小盒时，要确认脱水过程中小盒始终闭合，并确保不至于混乱。如果使用分格的金属提篮，应严防翻倾；试剂液面不得高于提篮表面，以免组织块漂浮、混淆。（操作者为第一责任人）。

10. 在做组织块石蜡包埋时，不得同时打开多个小盒进行批量包埋，严防混乱；包埋细小组织块时要核实数量并确保小材料不被崩失；包埋每一个组织块后，必须彻底清除镊子等操作工具上的残留细小组织，使用金属脱水小盒，必须仔细清除盒内的组织残渣，以防污染；要确保多块小组织（窥镜咬检或刮宫材料等）密集、一致地平放于包埋蜡块的底面，以便能在同一张切片中获得全部材料的切面（包埋者为第一责任人）。

11. 切片时，必须在每一个蜡块切片后，彻底、及时清除残存在刀具、毛笔、镊子、冰块、水浴锅水面和清除水面污物用具等工具上的残留组织；捞片时，载玻片必须清洁干净，以防污染（切、捞片者为第一责任人）。

12. 染色过程中应密切注意贴服于载玻片上的组织有无飘脱、丢失，注意及时补救。染色液容器内的试剂中不得含有任何组织碎屑，要定期过滤，必要时更换新试剂；盖玻片必须清洁干净（封胶量适当、标签规整干净，可注明制片人）严防污染（操作技术人员为第一责任人）。

13. 值班医师阅片时，首先核对每例切片与申请单是否同一病人。标本检材的部位和侧别是否确切，双侧器官必须分清是那一侧，确定病变在那一侧。核实取材部位、块数和 10

碎小组织的块数是否相符。镜下组织形态与病人标本组织是否相符，有否污染和制片质量等。有问题时，值班医师有责任逆向反馈，追查原因，核实情况，争取补救，并及时向科主任汇报（值班医师不追查为第一责任人）。

14. 执行“手术中快速冷冻病理诊断工作制度”和“病理诊断和疑难病例会诊及报告签字制度”，防范诊断缺陷，避免诊断失误（复诊的上级医师为第一责任人；初诊医师为第二责任人）。

（二）奖惩规定：

1. 对工作严格、认真，岗位工作质量优秀，成绩突出者；对挽救差错事故有功和在报告发出前发现上级医师在报告中的原则性诊断错误者，或初诊医师坚持自己的诊断意见，被证实是正确的，而避免了一次误诊者，给予一次性20～100元的奖金奖励。功绩更大者按医院的“奖惩条例”，推荐其争取医院奖励。

2. 对出现严重差错，尤其无法弥补者，如成批标本造成严重质量问题，标本左右不能分清、错号、污染或诊断错误不能挽救等。如第二责任人未发现或未反馈给第一责任人和科主任，每次扣奖金20～40元；扣第一责任人奖金40元。对因差错事故造成医疗纠纷者，每次扣第二责任人奖金50元；扣第一责任人奖金100元。责任更严重者按医院“奖惩条例”另外接受处罚。

第二章 病理科工作程序规范化及质量控制细则

一、送检标本的签收及质量控制

病理检查申请单是临床科室向病理科送达的特殊形式的会诊单，是病理医师作出病理诊断必备的临床文字资料，是具有法律意义的文书档案。临床医师应认真逐项填写申请单内的有关各项，签名要清楚。病理科登记人员在接收标本时，为进行第一次核实，必须仔细检查送检标本和申请单上所填写的内容，合格后才可签收；并按标本的类型进行分类编号，登记。活检类标本包括：外科手术切除标本、内窥镜标本（胃黏膜，肠黏膜，支气管黏膜和子宫颈钳取的组织等）、穿刺标本（肝穿标本和肾穿标本等）。细胞学类标本包括：细针穿刺涂片、胸腹水等体液标本、痰、宫颈刮片等。为了查找方便在细胞学标本编号前冠以“C”字母（Cytology）；活检组织标本和细胞学标本按年份编排，如C20120001。编号后按登记本所列项目进行登记，将标本按顺序放在规定的地方，以备检查，不得遗失。病理申请单凡有下列情况之一者，应及时责其更正或退回，并记录在案，按要求呈报医务科。

1. 标本是否放入容器内。有否存在主要病灶被事先挖取或一个标本被分送两个单位（不允许本院标本无故送往外院或随便丢弃）。

2. 容器中是否有杂物。容器上是否贴有标签。

3. 固定液量是否充足。有否标本严重自溶、干涸、腐败或被错误地使用非固定液浸泡。

4. 固定液用10%中性福尔马林溶液，（10%中性福尔马林溶液由病理科配制，各临床 11

科领用即可）。

5. 申请单是否清洁。填写是否完整，有否重要项目空缺或填写的病史及临床检查过于简单。

6. 申请单填写内容是否与标本相符，字迹是否工整。

7. 核实无误后，进行编号、微机录入基本信息。

8. 大标本，可在不影响主要病灶的情况下测量、描述并剖开固定，并适当添加固定液，继续固定。

二、组织取材程序及质量控制

各种脏器有其独特的大体结构，各种疾病又有其各自的特点。即使同一种疾病，在不同的病例亦可有不同的发病部位、肉眼形态及发展阶段。因此，在肉眼检查各种脏器的各种病变时，既要有规范的常规检查方法，又要有按照不同情况决定检查方法的灵活性。 总的原则如下：

标本的大体检查及取材应按编号顺序进行，检查前应阅读申请单上各项主要内容，注意临床医生有无特殊要求。然后取出全部标本进行核对，发现问题及时解决，必要时请临床医师前来辨认标本，确认无误后再进行检查、取材（有色标本瓶应仔细查看，防止小块标本遗留在瓶内）。

肉眼检查的一般原则可概括为看、触、切、取。详细描写标本大小、形状，表面和切面的颜色、硬度、病变部位、大小、形状、特点和周围组织的关系等。先描写主要病变、后描写次要病变。必要时绘图说明。剖检标本时，应注意暴露标本的最大面积，以便全面检查，并应保留其特点，以备作为教学和科研之用。

具体要求如下：

1. 大体标本取材，应有2人参加。记录者（一般为技术人员）应详细记录取材者的口头描述，负责宣读申请单。尤其要告诉取材者标本的件数、临床的特殊要求，并对取材者放置的小号码进行监督。取材者应在听宣读时，对标本容器上的编号、姓名及标本数量作第二次核实，如发现问题，待与临床医师联系、认定后再取材。

2. 小件标本应每块均取材制做切片，可能时每块保存一部分，以备重复检查之用；若标本太小，如窥镜咬检标本，应全部取材，点染伊红并用软纸包裹，以防遗失。

3. 肿瘤尤其是恶性肿瘤标本，除了在肿瘤部位取组织块之外，还要在被手术切除的断端及病变边缘（肿瘤与周围组织交界处）等部位取组织块进行检查。局部淋巴结必须逐个进行切片检查，以便明确肿瘤侵犯范围和转移率的情况。

4. 组织块取材厚度 以不超过3mm为宜，且要平整，并须注明其形状、数目、切取部位（如左、右、上、下等），如有特殊情况，应向技术人员交代清楚，或共同处理。

5. 在标本取材时，每一例标本取好之后，剩余的标本，应放回原送检容器中妥善保存，直到发出病理报告之后2周无问题再行处理。

6. 每一例标本取好之后都应附上标本来源号，不同号码的标本，必须分别放于不同的脱水盒中，记录块数，特点及制片时注意事项，要认真与申请单核对，防止张冠李戴，然后放入脱水机中脱水。用特殊固定液固定的标本，制片时需特别处理时应向技术人员交 12

代清楚。骨组织和需钙化的组织应进行脱钙处理。

7. 有下列情况之一者，应编写小序号号码并与相应的组织块放在一起，切勿放错：①一位病员被送一件以上的标本。②申请单中注明有特殊标记的标本。③一个大标本多处取材。④根治术标本的基部及切缘，找出或送检的淋巴结。⑤补充取材。

8. 每件标本取材后，应用流水冲洗，纱布擦试取材台及用具，必须清理干净后再取下一例标本，防止标本间的组织碎屑污染，造成误诊。取材结束后，病理医师应向技术人员当面交付组织块；技术人员点清块数，取材者和记录者应分别在记录单的适当位置签名。技术人员检查病理医师为技术室所提供的材料是否合格：组织块数的确认、标本大小、厚度、脱钙情况、特殊固定等，清点后接收——交接班。

9. 所用的器械用戊二醛消毒溶液浸泡消毒，工作台面和取材板，用0.2～0.4%过氧乙酸溶液擦拭消毒，此外可用紫外线对取材室进行空气和物体表面消毒。室内用紫外线消毒时应清洁、干燥，温度不低于20℃，相对湿度不超过50%，一般照射20～30分钟。

三、组织处理、包埋程序及质量控制

组织固定、脱水、透明、浸蜡直至包埋，是制作优质切片的关键过程。该过程也称为组织处理。一旦组织处理有欠缺，往往导致无法挽回的后果。

固定后的组织通常经过一系列的梯度乙醇脱水，也可使用乙醇和福尔马林混合液，或使用其它脱水剂。大多数脱水剂不能与石蜡直接相溶，所以脱水后必须再经过透明剂作用，才能对组织进行浸蜡。最后用石蜡包埋组织块。

透明剂作用于组织的过程，称为组织透明。最常用的透明剂是二甲苯。组织经过二甲苯透明后，浸泡在熔化的石蜡中，组织浸蜡一般要通过2～3个蜡缸，最终以石蜡替换出组织中的透明剂。石蜡的熔点一般为56～58℃，浸蜡的温度通常比蜡的熔点高2℃左右。

上述组织处理过程一般由脱水机自动处理。组织在脱水机中按照预先设置的时间和温度程序自动完成。

组织处理的质量控制：

1. 组织的处理时间，视组织的性质和组织块的大小而有所不同。致密的组织、富含脂肪或纤维组织，处理所需的时间要比结构细腻、细胞成分多的组织长。最好能根据组织的性质和大小分类，分批进行处理，以便于掌握时间，保证质量。

2. 较细小的组织，例如内窥镜钳取标本，穿刺标本，应与较大的组织块分别进行处理。小组织滤纸包裹或者装入专用的网状脱水盒内，以免遗失。

3. 组织处理所用的各种试剂，可根据工作量的大小，试剂消耗情况定时更换新液。一般情况下一月更换一次。在实际工作应用中其效果以保证常规切片的质量为原则。科室有相对固定的脱水及浸蜡程序，如有工作人员需要对固定的脱水、浸蜡时间程序改动，先提交申请，申明改动的理由及改进原理，经科主任批准后，可以开始批量试验。在新程序不成熟以前，不准日常工作应用！待批量结果实验以后，经全科工作人员对此进行评估，决定应用与否。如违背此规定，擅自改动者，为第一责任人，出现差错者应受相应的处分。

工作中自动脱水机使用时的注意事项：

1. 按脱水、透明、浸蜡顺序设置程序及时间。

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2. 保持各试剂缸内的试剂液面有足够的高度，以使组织全部侵入液体内。

3. 按设计好的组织处理时间表，调定时间控制装置。

4. 调定浸蜡缸温度，一般要高出所用石蜡熔点温度2℃左右。

5. 当完成最后一道程序后，应及时取出标本进行包埋（必要时随手关机）。

组织包埋程序

1. 包埋剂及其使用范围：用于组织包埋的材料有石蜡、碳蜡、火棉胶和各种塑料等。石蜡是最常用的组织包埋剂。石蜡包埋是一种常规包埋法，组织从脱水机中取出后仍在脱水盒内，必须人工将组织从脱水盒中取出来，然后放进包埋框里排列整齐，调整好方位，再灌满熔化的石蜡。

2. 包埋步骤：

（1）包埋时的用蜡需预先熔化，充分沉淀后使用。

（2）将熔蜡注入蜡模内，将镊子在酒精灯上加温，夹持浸好蜡的组织块，选择好包埋面，将其朝下埋入熔蜡内，用镊子轻轻按压，使组织在蜡中并紧贴蜡模底部。随即将组织块号码签嵌入熔蜡的一侧。

（3）待熔蜡表面凝固后，可投入流水中、放进冰箱冷冻室或包埋机冷台上促凝。

（4）待蜡完全凝固后脱模，并把蜡块四周适当修切。组织周围应留有1~2mm的蜡边。提倡使用石蜡包埋机，质量更好！

3. 包埋面的选择：

（1）一般情况下以组织最大面为包埋面。

（2）管状结构的组织以横切面为包埋面。

（3）皮肤组织或有表层上皮的组织，包埋面应垂直于上皮表面。

（4）带有病变特点的组织，或者对包埋面有特别要求的组织应按预先标记的包埋。 组织处理、包埋程序的质量控制：

1. 取材后对固定不充分的组织，应补充固定（固定时间：大标本固定时间不得少于18小时；小标本不得少于6小时。固定液必须定时更换（标本固定时间过长者，应流水冲洗）；应将大、小标本分开固定、脱水。

2. 固定、脱水温度不得高于37℃。

3. 试剂必须定时更换。

4. 包埋用石蜡必须定期过滤，蜡温应控制在62℃左右。

5. 包埋时应严格分块包埋，并同时包入相应的小号，切勿包错。不得将来历不明的碎组织块任意包入，以防污染。

6. 组织包埋完成后必须进行清点蜡块数量，以防组织块在脱水、包埋过程中遗失。

四、 组织切片程序及质量控制

石蜡切片程序：

组织包埋后必须切成薄片，再贴到载玻片上。需使用的设备：切片机、切片刀、水浴锅或捞烤片机等。切片机多轮转式石蜡切片机。切片刀为一次性的刀片。组织切片是一门精细的技术，需要花费一定的时间练习，才能熟练掌握这门技术。

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石蜡切片质量控制：

1. 切片前首先装好切片刀，把刀牢牢固定，否则，切片中就会发生许多人为现象。（最常见的人为现象是波纹，厚薄不均等）。

2. 蜡块装到切片机的蜡块夹上，夹持要平稳牢固。调整好蜡块的方位，不能偏斜，刀刃与蜡块的上、下缘平行。切片刀与蜡块的平面之间应保持一定的角度，以免刀刃面将组织刮坏。

3. 修蜡块时要循序渐进，力争修出最大面，又要防止小组织被修坏、修光。

4. 切片时连续转动手轮，用力要平稳、均匀。常规切片厚3～5μm。

5. 切下的蜡片相连成带状。待蜡带切至一定长度时，右手用镊子夹住蜡片末端，左手持毛笔轻轻将蜡带的另一端与切片刀拨离。

6. 将蜡片较光滑的一面朝下置于温水中（通常捞片水温在42℃左右），并用镊子帮助展开，去除皱纹后，选择完整、无划痕、厚薄均匀的蜡片，附贴到载玻片上。

7. 附贴时，务使蜡片与玻片之间无气泡。玻片一端应留有1/3的位置贴号码标签用。将蜡片附贴在另外2/3的中心位置。

8. 切片放入62℃烤箱中约30～60分钟烤片，以免发生脱片。免疫组化染色需使用打胶片（APES胶片和多聚赖氨酸胶片等）。

冷冻切片程序:

在手术过程中，外科大夫为了明确手术切除标本的性质及病变。通常送新鲜组织做冷冻切片病理检查，由病理医师在短时间内（一般30分钟左右）做出病理诊断。外科医生根据病理诊断，决定手术切除范围。冷冻切片需要一台具有冷冻功能的切片机。

冷冻切片质量控制：

1. 选取适当的新鲜组织块，放在冷冻托上，放入冷冻切片机中冻透。

2. 修块、切片。冷冻切片通常厚6～8μm并把切片贴于载玻片上。

3. 切片放入固定液中2分钟。

4. 然后快速HE染色。

5. 封片、贴标签后，送诊断室（20分钟之内完成）。

HE染色程序及注意事项：

1. 组织经过石蜡包埋切片后，因含蜡的切片无法进行染色，必须反向脱去切片上组织中的蜡，让水溶性染料渗入切片中。所以在染色前必须用二甲苯或替换剂进行彻底脱蜡，然后用乙醇洗，最后再用水洗。

2. 染色注意事项：

a) 配制染液和其他溶液时，要根据需要和染液的保存期限决定配制数量。

b) 需要保存再用的染液和试剂，必须贴上标签，注明名称、浓度、配制日期和用处等，妥善存放。经常使用的染液和试剂要经常过滤或更换新液。

c) 染色器皿须洗涤干净。必要时用酸洗液处理。将玻璃器皿浸泡于酸洗液中半天至1天，自来水冲洗数小时，再用洗涤剂刷洗，自来水冲洗数小时，蒸馏水冲洗后备用。

染色是利用染料的不同作用，使组织与染料以不同方式进行结合。常规染色是苏木精 15

和伊红染色（简称HE染色）。特殊染色是根据诊断的需要对组织中的某些成分进行非常规的染色。冷冻切片也用HE染色。少量或单个冷冻切片时手工操作比较方便。冷冻切片染染色要求在短时间（10～15分钟）内完成，在保证质量的前提下越快越好。

切片质量控制：

1. 诊断人员在接到当日切片并验收后，检查、核实所制作的组织学切片的数量及质量，在技术室送片记录本或工作流程单上签字。如发现切片数与取材数不符，应及时与技术人员联系，进行核查。对当天质量不好的切片做记录，指明技术上存在的缺陷，并于当天交技术室。

2. 技术室收到切片质量记录，要求在24小时内答复，并立即纠正原不足之处。另外，科内质量管理小组按分工，每月按时间顺序复查切片一次，查出问题要采取适当措施于以纠正，并注意落实情况。

3. 切片是技术含量很高的步骤，同一蜡块，用同一台切片机，同一把刀，不同的操作者会切出不同质量的片子。所以要求：切片刀必须锋利；切片厚度3～5μm，切片完整，无污染，无皱褶，无刀痕。组织片应贴附在标签外，剩余玻片的中间。

4. 胃镜、纤维支气管镜、穿刺等小活检组织切片须作连续性切片，数量不得少于6张（6～20张）。

5. 切片、捞片时应严格分块完成，切忌在水面上残留上一块的碎片，以杜绝污染。

6. 贴（裱）片时，必须注意蜡块编号与载玻片上的编号完全一致，杜绝错误。

7. 切好的白片要进行烤片化蜡。烤片温度应在60～62℃左右，时间不能少于20分钟。

8. 染色必须按程序操作，染色试剂必须及时过虑或更换。HE染色适中，核、浆分化对比清晰，避免过红或过蓝（注意防止苏木素渣子和伊红碎片出现）。

9. 切片封固前必须经酒精充分脱水，二甲苯透明，湿封。不得用温箱烤干或电吹风吹得过分干燥，再封片。

10. 盖玻片使用前必须清洗。（真空包装除外）。封片时不得有气泡，不得有树胶外溢。

11. 标签贴于玻片一侧，编号字迹必须清楚、整齐，且不易褪色，有条件者尽量采用打印（即不干胶标签）。

12. 染好切片后贴标签时，编号要与玻片编号一致，杜绝错误。

13. 制片工作一般应在12～24小时内完成。切片完成后交付医师时，必须按照记录当面清点（实行交接班签字手续 ）。

镜下观察切片质量控制：

1. 切片内有明显污染组织，应与技术人员联系，并共同检查、处理。

2. 切片内容与送检组织不符，应分别与技术人员和取材者联系，必要时要与送检科室联系。

3. 切片或染色质量差，应与技术人员联系，提醒改进工作，必要时重新制片。

4. 为充分观察病变需做深切、连续切、特染、免疫组化等，应在申请单备注栏或工作流程单上写出意见、项目并签名，交付技术室有关人员。

5. 实行初、中、高三级医师阅片把关责任制，逐级复查，避免差错及误、漏诊。 16

五、 病理细胞学检查质量控制

1. 细胞学检查是病理诊断最简便的方法。采取人体体表、体腔及深部脏器组织的脱落物、分泌物、表面附着物或穿刺物进行涂片、染色，观察其中的细胞形态，查找癌细胞并做出病理诊断，统称细胞学检查。

2. 痰查癌细胞：须采用深部新鲜痰。病人晨起，弃去第一口痰，漱口后留取深部咳出的痰，放在不易干燥、表浅容器中送检。一般要连续送3天，确定阳性或阴性。胸腹水、尿等，取材后应立即送检，量不得少于10ml。子宫颈刮片、穿刺涂片和支气管刷片等，要涂匀地涂于载玻片一端，占2/3的面积，但不可反复涂搓，以防细胞变形，影响诊断。片涂好后，须立即固定（可用95%的酒精固定）或即刻送病理科，否则影响染色及诊断。

3. 病理科接到痰标本要立即涂片，挑选含血丝处或灰白点状处，要多涂一些，增加信息量，一般涂两张片，涂好立即固定；体液标本要立即高速、定时离心，用浮膜和沉渣涂片，涂2～4张片，凉到无液体流动时，即可固定，涂片太干影响染色及诊断；临床已经涂好的片，要立即补充固定。细胞学涂片，可每半天集中染一次，即12～24小时出报告。

细胞学病理诊断准确率低于活检和冷冻诊断准确率，一般在80～95%之间（由于细胞学诊断准确率低和误诊率相对较高，因此一般不作为恶性肿瘤手术方案的依据）。细胞涂片检出的阳性率，取决于送检标本的内容、标本类型以及选材、染色和看片等多方面的因素。肺门的（中心型）肺癌，痰检出的阳性率可达85%，而周围型肺癌，痰检出的阳性率只有30～50%；食管癌拉网阳性检出率90%；子宫颈癌刮片阳性检出率可达95%以上等。细胞病理有10%～30%的阴性率，即漏诊率；1%～3%的假阳性率，即误诊率。所以要求病理工作者看细胞学涂片，一要全面，二要仔细，三要经过一定的培训。在不能独立确定诊断时，要请上级医师复诊，也可在科内讨论。

六、资料归档质量控制

1. 医师在诊断工作结束后，资料交付档案室或技术室时，必须当面清点，并作记录及签名。

2. 所有送检申请单及玻片资料（细胞学检查、冰冻切片、常规切片、会诊切片等）均必须进行登记，及时清点，分类、归档。

3. 文字资料按年份和顺序装订成册入柜。

4. 如用计算机管理的，必须有资料备份（以光盘刻录或硬盘储存为佳）。

5. 切片必须晾干或烘干后，才能归档。归档切片应按顺序排列。

6. 蜡块必须在切面封上蜡后才能入柜。

7. 归档蜡块应按序排列，编号标签应朝上，以利查找。

8. 各种档案柜外面应写明年份和编号，以利查找。

七、试剂配制及更换质量控制

1. 更换、配制试剂必须详细登记。

2. 各种染料试剂应选用化学纯以上的级别。

3. 配好的试剂应盛于磨口瓶内，避光试剂必须用棕色瓶，需冷藏试剂应放置于冰箱 17

内备用。

4. 瓶签上应标明试剂名称，浓度和配制时间。

5. 各类试剂应进行定期更换，更换的时间应根据标本的多少进行量化。

6. 废弃试剂建议由专业公司回收。目前应排入具有污水处理功能的下水道，不得直接排入雨水管中。

八、病理科日常诊断工作及程序:

病理报告单的设计

1. 患者姓名、性别、年龄/出生年 月 日、民族、科别、住院号、床号，随访通讯地址、固定电话和联系人，经治医师签名。

2. 报告单右上角显著位置注明病理编号和既往病理编号。

3. 送检标本类别、取材部位、临床诊断应设在报告单上部。

4. 中部是病理诊断。

5. 本科室的名称、地址、电话号码等注明在报告单下方（可注明：接到报告后如有问题，请在2日内与病理报告医师联系）。

病理报告单的填写

1. 报告单应包括大体描写，大体描写应注明特殊病变的组织分布。

2. 添加大体及组织学拍照、摄像，采用计算机病理图像分析系统打印彩色多媒体图文报告。

3. 当收到切片、蜡块或组织来自其他病理科的会诊时，应注明切片、蜡块的数目及委托医院的名称。

显微镜下诊断描述

1. 诊断医师认为恰当时，应做镜下形态记录。但并不是每份报告都必须有镜下描述。

2. 对所有肿瘤进行分型，分级，并注明采用的分级标准名称、肿瘤浸润深度、血管、神经是否受侵、淋巴结转移、肿瘤大小、位置、类型及切缘的情况等。

石蜡切片诊断

1. 诊断过程一般由两位以上医师承担，先由初诊医师做出初步诊断，后由复诊医师确诊，疑难病理再经上级医师复查，实行三级医师检诊和双签字制度。

2. 报告中表明取材的组织（器官）部位、方法。

3. 病理诊断应醒目。

4. 在病理学报告中，适当时可引用文献。

冷冻切片诊断

1. 冷冻切片病理诊断是高技术、高风险、高难度的一个项目，它是临床病理实践中最重要、最难的一项工作。

2. 它需要病理医师具有丰富的经验及临床和病理学知识。

3. 但有时送检的冷冻标本因证据不足，病理医师不能做出诊断，当出现这种情况时，病理医师可以坦然地陈述这一事实。

4. 如遇到病变处于交界性或称“灰色病变”时，不能做出确切诊断，不要勉强，允许延 18

缓报告，等待石蜡切片再确诊。

5. 对于冷冻切片，病理医师应该特别慎重。有条件的单位，最好由两位以上高年资医师担任该项诊断工作，必要时请上级医师或外院专家会诊。

6. 各器官的冷冻切片适应症和局限性各有不同，确实诊断不清时，须请外科医师关闭切口，等待石蜡切片结果。千万不能勉强诊断，以免发生事故。

7. 冷冻切片诊断有三个重要的目的:

（1）证明某种病变的存在和其性质（尤其对是否为恶性肿瘤的确定）。

（2）手术断端、边缘的状况及有否癌浸润或转移。

（3）确定切除的标本内是否含有能够做出诊断的组织，或确定是否含某种组织等。 病理诊断报告的其他注意事项

1. 在病理报告时，尽可能将特殊检查结果（免疫组化、特殊染色、电镜、受体及数据等）合并到一个报告中。

2. 科内会诊可记录到病理报告中。

3. 当有外院医师参与会诊时，请其签字并签署会诊意见。

4. 如果诊断医师和复诊医师认为对病人有益，可以在病理报告中提出建议进行其他检查或外出会诊。

5. 病理报告应包括标本收到日期和最后报告日期。

九、病理诊断报告质量控制

1. 病理诊断报告是经病理科各级人员共同努力，按工作流程对送检标本作出的最后结论，是病理医师签署的重要医学证明文件，必须十分认真，书写字迹应清楚，尤其关键性字如；癌、瘤、阴性、阳性等，不得潦草或杜撰简化字。微机打印的图文报告，也应杜绝错白字。报告文字不得涂改。报告发出前，应由初诊、复诊医师分别签字（不可以盖章代替签字）。

2. 病理工作人员一律不得应有关人员要求出具假的诊断报告或已签名的空白报告单。原报告单如果遗失，经病理科负责人同意后方可以注明“副本”、“补发”字样形式补发。

3. 通常情况下常规病理诊断报告应在接到标本之日起3～5工作日发出（节假日除外）。组织较小，又急于治疗的病例，如内窥镜咬检、宫内膜诊刮标本等情况，可以做快速石蜡切片，提早出诊断报告。凡因补取材、深切、特染、做免疫组化、脱钙、延长固定（如结核病标本等）或会诊而不能如期发出报告时，应口头通知临床科室或发出“迟发病理诊断通知单”，说明迟发原因。

4. 病理诊断报告应由病理科人员送达相应科室或护理站，收到人应签字；门诊标本可送交门诊部或相应科室门诊，收到人签字。注明“自取”的报告，由送检人到病理科取。

5. 病理诊断报告发出前，应及时将诊断结果登记在登记本上。

第三章 免疫组织化学

一、免疫组织化学技术

免疫组织化学（简称：免疫组化）技术是近些年发展起来的一门新技术。它是在抗原 19

抗体特异性反应存在的前提条件下，用免疫学的方法进行组织化学检测。即借助于被标记一种可见物质（酶、荧光素或金属）的手段，检测另一种物质（抗原/抗体，主要是用标记抗体来查找抗原）在组织细胞内存在的部位。标记物与组织内特异性抗原或抗体反应，经细胞化学染色后，于光镜或电子显微镜下观察、分析。近20年来，随着新方法的日新月异，标记物层出不穷，免疫组化技术在国内外得到了广泛的普及，应用范围逐渐扩大，技术环节也日趋成熟、简练，用于临床病理，对病理学的发展起到了极大的推动作用。成为当今形态学研究领域中不可或缺的手段。同时也能为临床病理诊断、肿瘤性质的判定、鉴别诊断、预后的估测等提供重要依据，已成为临床病理诊断中常规检查方法之一。

免疫组化注意事项：

1. 组织标本的良好固定是免疫组化获得理想的染色效果和正确判断结果的重要环节。因为如果抗原物质在组织细胞间弥散、丢失或失去免疫活性，无论采取何种染色都是徒劳的。在这方面，应统一组织固定程序。首先，固定液的配制要统一，要求使用“中性福尔马林”。标本及时固定，固定时间亦要充分，但一般不超过24小时。大标本要注意得到及时和充足固定液的浸透固定，必要时测量后切开固定，或取成小块合适的病变组织后再固定。这对普通病理形态结构的显示可能也有好处，更是建立具有可重复性的标准的免疫组化程序至关重要的一步。

2. 切片时需注意的问题 （见本细则第二章）。

3. 载玻片的处理：

抗原修复过程中，由于高温、高压、辐射等诸多因素的影响，极易造成脱片。为保证试验的正常进行，可选用APES或PoLy-L-Lysine等几种试剂，对己清洗的载玻片进行处理。

4. 常用酶消化：

胰蛋白酶: 一般使用浓度为0.05%～0.1%，消化时间为37℃、10～40分钟，主要用于细胞内抗原的显示。

胃蛋白酶: 一般使用浓度为0.4%，消化时间为37℃、30～180 分钟，主要用于细胞间质抗原的显示，如： Laminin（层粘蛋白），CollagenⅣ(Ⅳ型胶原)等。

5. 抗原修复：

可根据实验室的具体条件，选用微波炉抗原修复、高压锅抗原修复或水浴高温抗原修复（以高压锅修复效果最佳）。抗原热修复可选用各种缓冲液，如TBS、PBS、重金属盐溶液等，但实验证明，以0.01mol 枸橼酸盐缓冲液 (PH6.0 )和lmMEDTA抗原修复液 (PH8.0)效果最好。

高压锅抗原修复操作方法:

切片脱蜡至水。将1500m1～3000m1的抗原修复液（工作液）注入不锈钢压力锅中加热至沸腾。切片置于金属架上，放入锅内，使切片位于液面以下，盖锅压阀，当压力锅开始慢慢喷气时 (约加热5～6分钟后)，计时1～2分钟，然后将压力锅端开，远离热源，冷水冲至室温后，取下气阀，打开锅盖，取出切片，蒸馏水洗后，PBS洗2分钟×3次，下接免疫组化染色步骤。

20

微波炉抗原修复操作方法:

切片脱蜡至水后，将切片放入盛有抗原修复液（工作液）的容器中，置微波炉内加热使容器内液体温度保持在 92℃～98℃之间并持续 10～15分钟 （注意:无论是使用医用或家用微波炉，请根据具体机型酌情设置条件，务必满足以上步骤中对温度和时间的要求）。取出容器，室温冷却20~30分钟 (注意:不可将切片从缓冲液中取出冷却，以便使蛋白能够恢复原有的空间构型)。PBS洗，下接免疫组化染色步骤。

电炉煮沸抗原修复操作方法:

切片脱蜡至水后，放入盛有抗原修复液 (工作液)的容器中，并将此容器置于盛有一定数量自来水的大器皿中，电炉上加热煮沸， 从小容器的温度到达92℃~98℃起开始计时15～20分钟，然后端离电炉，室温冷却20～30分钟，蒸馏水冲洗，PBS 洗，下接兔疫组化染色步骤。

二、常用免疫组化染色方法

SP法免疫组化染色

1. 原理：链霉素抗生物素蛋白（SA）是从链霉素中分离出的蛋白质，穿透组织的能力比ABC、PAP复合物大，反应速度快，它含有四个亚基，每个亚基都有与生物素（Biotin）连接的部位，且二者间有极强的亲和力，SA的等电位接近于6.5，近中性，而卵白素（Avidin）为10，因此，SA几乎不与组织中的内源性凝集样物质发生非特异性结合，使用链霉素抗生物素蛋白-过氧化物酶放大系统，即可产生低背景、高放大效果。S-P采用生物素标记的第二抗体与链霉素抗生物素蛋白连接的过氧化物酶及基质素混合液来测定细胞和组织中的抗原。

2. 基本染色方法：

（1）石蜡切片脱蜡至水。

（2）3%H202室温孵育5～10分钟，以消除内源性过氧化物酶的活性。

（3）蒸馏水冲洗，PBS浸泡5分钟，(如需采用抗原修复，可在此步后进行)。

（4）5～10%正常山羊血清（PBS稀释）封闭，室温孵育10分钟。倾去血清，勿洗，滴加适当比例稀释的一抗或一抗工作液，37℃孵育1～2小时或4℃过夜。

（5）PBS冲洗，5分钟×3次。

（6）滴加适当比例稀释的生物素标记二抗（1%BSA-PBS稀释），37℃孵育10～30分钟; 或滴加第二代生物素标记二抗工作液，37℃或室温孵育10～30分钟。

（7）PBS冲洗，5分钟×3次。

（8）滴加适当比例稀释的辣根酶标记链霉卵白素(PBS稀释)，37℃孵育 10～30分钟；或第二代辣根酶标记链霉卵白素工作液，37℃或室温孵育10～30分钟。

（9）PBS冲洗，5分钟×3次。

（10）显色剂显色（DAB或AEC）。

（11）自来水充分冲洗，复染，封片。

（附，冰冻切片免疫组化染色步骤： 冰冻切片4~8um，室温放置30分钟后，入4℃丙酮固定10分钟，PBS洗，5分钟×3次。用3%过氧化氢孵育5～10分钟，消除内源性 21

过氧化物酶的活性。PBS洗，5分钟×2次。下接石蜡切片免疫组化染色操作步骤）。

免疫组化的方法很多，新方法层出不穷，如Envision二步法，要不断更新，与时俱进。虽然这些方法各有其特色，但总的来说，只要应用恰当均可获得较为满意的结果。方法的选择并不是影响免疫组化结果的主要因素。问题在于一个单位应常规地、固定地使用一种方法，不宜交替使用不同的方法或经常更换方法。一旦选定一种方法，应务必使其标准化，力图使一抗、二抗、标记试剂和底物的浓度、孵育时间和浓度、缓冲液的使用程序化、规范化。

三、免疫组化技术的实用意义

病理诊断常用的仍然是常规石蜡切片HE染色。而免疫组化技术仅仅是一种辅助手段。在免疫组化检测项目的选择方面，病理医师一要结合临床医师的要求，二要满足诊断与鉴别的需要，采取积极、慎重、合理和节约的原则，选择免疫组化项目。不能盲目滥用，以免造成不必要的混乱和加重患者的经济负担。这就要求病理医师对所采用的项目有清楚的了解，明确各项染色结果阳性或阴性对病理诊断有何意义。例如：乳腺癌ER、PR和C-erbB-2检查，对判断肿瘤性质不起决定性作用，但对临床治疗有重要指导意义，应积极开展。实践证明，逐级选择染色项目是行之有效的好方法。即根据日常活检工作中抗体的使用频率及在诊断中的作用，将其分为一线抗体、二线抗体和三线抗体。其中一线抗体是必备的，包括Kertin、Vimentin、LCA、S-100等。但一线抗体仅仅可将肿瘤粗略分类；二线抗体是一线抗体的补充，可将肿瘤更精确地进行分类。如：SMA、Myo、NF、EMA、MBP、GFAP及恶性淋巴瘤免疫功能分类的单克隆抗体等。三线抗体则用于指导临床治疗、病因检测和评估预后。如：ER、PR、C-erbB-2、P53、PCNA及耐药基因等（为满足临床的需要，二、三线抗体也可成为一线抗体）。这样，在免疫组化项目检测中，才能有针对性地、合理地使用这类先进手段。

四、免疫组化试剂的标准化

试剂的标准化，首先要求使用正规免疫试剂公司提供的标准化试剂，并附有详细的试剂说明书，包括：抗体的来源、免疫球蛋白的亚类、单抗或多抗、使用的稀释度、使用流程和注意事项、洗涤时缓冲液的适宜离子浓度和PH值等。即使厂家提供了相应的资料，在使用时亦不能一成不变地生搬硬套。因为厂家提供的标本固定和组织处理等程序可能与应用者实验室的程序不完全相同。

五、免疫组化常用溶液的配制

l、PBS磷酸盐缓冲液（PH7.4）配制：

NaCL 8g

KCL 0.2g

Na2HPO4 1.44g

KH2PO4 0.24g

将上述各种试剂溶于800ml水中，用HCL(1N)或NaOH(1N)将pH值调至7.4，加水至1000ml即可。

22

2. TBS:

Tris缓冲液配方:(0.5M pH7.6)

Tris(三羟甲基氨基甲烷) 12.1g

NaCl 17.5g

浓HCL 约7ml

双蒸水 加至2000ml

Tris缓冲液配制方法:

先以少量双蒸水（300~500ml）溶解Tris，加入7mlHCL后，用HCl（IN）或NaOH（IN）将pH调至7.6，最后双蒸水加至2000ml。此液为储备液，4℃冰箱中保存。

TBS配方:

Tris-HCI缓冲液 （0.5M pH7.6） 100mnl

NaCI 8.5~9g(0.l5mol/)

双蒸水 加至1000ml

TBS配制方法:

先以少量双蒸水溶解NaCl，再加入Tris-HCl缓冲液，最后加双蒸水至1000ml，充分摇匀。

3. 枸椽酸盐缓冲液（Citrate buffer）:

储存液:

0.lM枸橡酸溶液:称取21.0lg柯橡酸（C6H8O7.H2O）溶于1000ml蒸馏水中。

0.lM枸橡酸钠溶液:称取 29.41g枸橡酸钠C6H5Na3O7.2H2O)溶于1000ml蒸馏水中， 工作液:

取9ml A液和4Iml B液加入450ml蒸馏水中，溶液pH值

应为6.0±0.1

4. 胰酶（TrypsIn）:

胰蛋白酶消化液:

取0.05g或0.1g胰蛋白酶加入到100ml0.05%或0.1% PH7.8的无水氯化钙水溶液中，溶解即可。

5.胃酶（Pepsin）——0.4％胃蛋白酶：

胃蛋白酶400mg溶于100ml的0.1N HCL中即可。

6. DAB(3，3-二氨基联苯胺):

6mg DAB溶于l0ml 0.05mol/L TBS（0.05M pH7.6）,再加入0.1ml浓度为3%的H2O2，过滤掉沉淀物，即可。

7. AEC:

4mg AEC溶于1ml二甲基甲酰胺中，加入14ml浓度为0.1M的醋酸缓冲液(PH5.2)，然后加入0.15m1 3%H2O2，过滤掉沉淀物。

六、免疫组化结果的判断

首先应设立阳性和阴性对照，其次，阳性信号的存在部位必须与抗原分布相一致。如： 23

T细胞系恶性淋巴瘤组织中，存在着CD20标记阳性的细胞，这是因为瘤组织中散在分布着正常的反应性B细胞系免疫细胞。只有肿瘤细胞阳性才能明确肿瘤的组织来源。需注意的是任何一种特异性标记物并非绝对特异，且敏感性也有一定限度。肿瘤的分化程度和恶变导致的表型改变均影响标记物的表达。多数抗原在组织中的分布是不规则的，即使在成团阳性细胞中，表现也可为强弱不一，甚至其间含有散在或成团的阴性细胞，这些都是正常的。因此，在结果判断有困难或几种免疫组化显示矛盾结论时，应重复染色，不可勉强下结论。染色结束后，应先观察对照组的结果。如阳性对照呈强阳性，阴性对照呈阴性，背景无非特异性染色时，表明本次实验的全部试剂和全过程技术操作准确无误，待检组织中的阳性细胞就是可信的正确结果。

关于阳性的判断标准，目前国际上存在两种以上报告方式，一种是根据阳性细胞的百分比来分级；一种是根据阳性细胞的染色深度来分级；还有将两者结合起来分级的。这需要根据检测项目来区别对待。一般DAB显色阳性应为棕黄色、棕色或棕褐色。而黄色的浅淡背景不应视为阳性。当然，结果的判断还要考虑到固定液、固定方法、抗体的特性、效价、免疫组化方法的敏感性等因素。其他的结果既要与普通病理组织学相结合，又要防止各种主观因素和各取所需的思维影响。

七、免疫组化结果中常见问题的处理

当免疫组化染色没有出现预期结果时，应系统地查找原因，而每一次只能排除一种原因。

对照标本和目标标本均无着色

1. 确认是否漏加了某种试剂，包括一抗、二抗、三抗及底物等。

2. 确认所有的试剂是否按正确的顺序加入，是否孵育了足够的时间。

3. 对照抗体的标签确认是否使用了正确的抗体，以及所用的检测系统是否和一抗匹配，这一点是非常重要的。比如，如果一抗是兔来源的抗体，二抗一定用抗兔的二抗来匹配；或一抗是小鼠的IgM一抗，二抗必须是山羊/兔抗小鼠的IgM（不是IgG）二抗。

4. 检查抗体所使用的稀释度及稀释溶液。

5. 检查抗体的有效和保存条件，尤其是标记了酶或荧光素的抗体，现在大多数试剂公司的抗休均要求在4～8℃条件下保存，应避免反复冻融，试剂保存时一定要避免与挥发性有机溶剂同放一室，以免降低抗体的效价。

6. 查标本的储存条件，最好用巳知阳性的标本来同时做阳性对照。

7. 检查色原/底物溶液，最简单的检测方法是将一滴标记有酶的抗体加入到制备好的底物溶液中，如果底物发生预期的颜色变化，则可排除底物的因素。需要注意的是，有些底物在制成工作液后应在一定时间内用完，否则会失效。

8. 检查冲洗液是否和反应试剂匹配，溶液的pH值很重要，与过氧化物酶底物匹配的溶液中不应含有叠氮钠。

9. 检查复染剂和封片剂是否和所用的色原匹配。

弱阳性

如果阴性对照没有染色而阳性对照标本弱阳性，除了考虑上述因素外还应考虑: 24

1. 标本的固定方式，不当的固定方式或固定时温度过高，都会影响到所检测的抗原的数量和质量。

2. 不适当的抗原修复方式，由于石蜡切片在制作的过程中固定剂对抗原的封闭作用，必须用抗原热修复或酶消化或两种同时使用的抗原双暴露法，至于使用哪一种方法，应参照生产厂家的说明，同时结合标本的具体情况而定。

3. 抗体的稀释度是否过高或者孵育的温度，时间是否正确。一般试剂生产厂家都会对试剂给出一定的浓度使用范围，但是由于使用者的标本来自各种组织，处理过程也不尽相同，所以应参照使用范围，对所使用的一抗进行梯度测试，找出最佳的使用浓度。

4. 切片上遗留了过多的冲洗液，当抗体加至切片上时，等于人为地对抗体进行了进一步的稀释。

5. 孵育时切片是否水平放置，否则会导致抗体流失。如果阴性对照没有反应，阳性对照反应良好，而标本弱阳性，则可能是由于阳性对照不是同一种组织、或固定方式不同等原因所致。

6. 除抗体浓度过低，孵育时间过短，试剂超过有效使用期，缓冲液未吸干，造成试剂被稀释，防止切片干燥外，还有复染或衬染太深，室温太低，低于15℃，组织经固定和包埋等处理后抗原丢失严重；虽然环境温度4～20℃，但过度血清蛋白封闭等原因也可影响结果。

7. 染色阴性有操作步骤错误，组织中无抗原，一抗与二抗种属连接错误和试剂失效等原因。

非特异性染色

1. 是否有效地去除了内源性酶和内源性生物素。应注意的是，并不是每一种组织均需要进行此步骤，但对于内源性酶或内源性生物素丰富的组织，如肝脏、肾脏等，需考虑此原因。处埋的方法为:

灭活碱性磷酸酶: 最常用的方法是将左旋咪唑(24mg/ml)加入底物液中，并保持pH值在7.6～8.2，即能除去大部分内源性碱性磷酸酶，对于仍能干扰染色的酸性磷酸酶，可用50mmol/L的酒石酸抑制。

饱和处理内源性生物素: 消除内源性生物素的方法是事先滴加亲和素，以饱和内源性生物素，使之不再有剩余的结合位点。具体方法是在ABC法或SP法染色前将切片浸于25ug/ml亲和素溶液中处理15分钟，PBS清洗15分钟后即可染色。

2. 是否选择使用了正确的封闭血清。电荷吸附所造成的非特异性背景染色消除方法是以二抗动物的非免疫血清，用PBS稀释为3%～10%溶液孵育切片，以封闭吸附位点。有时其它无关蛋白，如牛血清白蛋白也常应用。另外，取材时避开出血、坏死区亦极重要。最近有些国内的实验室应用5%脱脂奶粉替代血清进行抗原封闭，效果也不错。

3. 所选择的抗体是否符合试验要求。因抗原不纯、标本片中含有与靶抗原相似的抗原决定簇等原因造成的非特异件染色，只能通过采用高纯度、高效价的抗体、或针对更具特异性抗原决定簇的单克隆抗体来解决。

4. 一抗的使用浓度是否过高。

25

5. 清洗是否充分。应严格操作规程。因在缓冲液中含有一定量的盐，这亦有利于减低背景着色，通常0.05mol/Tris-HCl, 0.l5mol/NaCl巳适用于多数染色方法，溶液内加入吐温-20效果更佳。特殊标记时，试剂公司一般都提供缓冲液的配方。

6. DAB的使用是否正确。DAB的孵育时间和配制方式可以产生某些背景颜色，使用浓缩型DAB试剂盒时，请严格按照说明书标明的滴加顺序操作，注意校正蒸馏水的PH值，以确保实验结果的正确性；粉剂DAB溶解时，常有一些不容性颗粒，这些颗粒须经过滤除去，否则可能沉积于切片组织上，产生斑点状着色。另外，DAB保存不妥产生氧化物亦可沉淀于切片上，因此需将DAB保存于闭光干燥处，现用现配，临用前加H2O2。孵育时间过长也会造成背景染色。

7. 标本染色过程中是否曾经干涸，否则会造成边缘部的非特异性染色。

8. 检查二抗与标本的内源性组织蛋白是否有交叉反应。

9. 另外还有操作过程中冲洗不充分，组织切片折叠，组织中含过氧化物酶未阻断，组织抗原弥散，切片黏附剂过厚，血清蛋白封闭不充分，在室温1小时中超过37℃ 降至室温20～28℃或4℃过夜孵育温度过高等原因。

注意： 1.阳性对照 请注意阳性对照组织上的阳性率。2.冰冻切片免疫组化 只能用丙酮固定。3.热修复 10mM枸橼酸缓冲液PH6.0。4.抗原双暴露 酶消化＋抗原热修复。

5.EDTA 1mM EDTA修复液 PH8.0。

八、免疫组化报告

免疫组化报告内容应包括组织固定方法、一抗的标号和种类、免疫组化方法、是否用了附加抗原修复措施和染色结果。不应简单地列出各项结果的阳/阴性。另外，应注意免疫组化报告不应与病理组织学诊断报告分离，而应与特殊染色、组织化学染色报告一样，成为最后病理诊断报告有机的组成部分（可合并到病理诊断报告中）。

九、免疫组化工作程序

1. 初诊医师根据常规HE切片诊断中遇到的问题，提出免疫组化的抗体标记类型，交上级医师核准。

2. 针对诊断难点，及免疫组化标记的抗体种类，并填写免疫组化工作单，交免疫组化技术室。

3. 免疫组化室染好切片后，经质控检查合格（即染色程序无误、对照染色可靠）交给初诊医师。

4. 初诊医师根据免疫组化染色结果，提出初步的诊断，交上级医师复查。

5. 上级医师复查后，发出最后报告，并附上免疫组化结果。

6. 据临床医师提出的免疫组化申请，完成各项检查。

7. 报告发出后，将切片送回免疫组化室归档。

十、免疫组化技术常规

1. 抗体的合理保存：各类抗体有其各自的保存条件，一定要按其说明保存。对每一种新购进的抗体要进行效价测定，并确定最佳稀释度。稀释抗体时，所用的器皿要洁净，防止影响抗体效价。此外，自己稀释的抗体要在短时间内用完。（最好一周内用完，最长 26

不宜超过两周：用抗体稀释液，稀释一抗，可保存3个月至一年）

2. 染色前准备

（1）填写申请单：常规外检中需做免疫组化检查的病例，首先由医师将申请单送免疫组化室。

（2）登记：免疫组化室备专门的工作登记本，对所需染色的每一例标本进行登记，以便归档和日后查找。

（3）切片：4um厚，切片放置于60～62℃烤箱烤片2小时。

（4）染色：按常规方法染色（详见染色方法）。

（5）发片：染色后的切片送给初诊医师。

（6）归档：病理医师阅片后，及时将切片送回免疫组化室，统一归档。

十一、 免疫组织化的应用范围

在常规病理诊断中应用免疫组化主要有以下八个方面的意义：

1. 对肿瘤的组织起源进行鉴别分析和确定诊断。

2. 对肿瘤的良、恶性进行综合判断。

3. 发现微小转移灶。

4. 激素受体的检测，以指导临床治疗。

5. 激素类细胞的定性和定位。

6. 指导肿瘤分期。

7. 指导肿瘤预后的判断。

8. 免疫性疾病的辅助诊断。

第四章 病理科常见技术问题及常用特染、试剂配制

一、脱钙问题

一些组织含有钙，含钙的组织不宜直接用石蜡包埋切片。骨组织含钙最多，其它组织也可发生钙化，在组织中形成钙化区。对含钙的组织在组织脱水处理之前应先进行脱钙处理，然后再进行脱水、透明、浸蜡、包埋、切片。用于脱钙的试剂很多，在脱钙剂中没有一种是比较完美的。强酸如硝酸和盐酸可用于密皮质骨的脱钙，在短时间内可除去大量的钙。但需注意这些强酸会损坏组织形态，控制脱钙时间，尤其是骨髓组织。

二、组织切片中的人为现象

在切片染色中出现的一些人为现象可能是由于组织固定不适当，固定剂类型不合适，脱水和浸蜡不够，试剂不适当，切片刀不锋利和切片机性能较差所造成的。经常切片上出现一种细黑色沉淀物与组织无关（例如，沉淀物出现在组织的边缘，组织间隙及血管内）提示形成了福尔马林色素。福尔马林色素用偏光显微镜可以进一步证实。因为这种色素会偏振化一种白光（这种色素在偏光显微镜下看上去象天上的星星），福尔马林色素常见于含血多的组织或尸检组织中。当福尔马林缓冲液耗尽组织变酸时促进一种血红素和福尔马林复合物的形成最终形成福尔马林色素。例如，脾和淋巴结组织特别容易形成这种认为现 27

象。

组织块取得比较薄而且用充足的中性福尔马林固定（固定液与组织的比率为10:1）会减少这种人为现象的发生。组织在固定过程中，如果固定液变为深棕色或红色，应该更换新固定液固定。

组织在透明和浸蜡之前脱水不够，组织就会变软，组织在无水乙醇和二甲苯中停留时间过长，组织就会变脆，切片时会出现组织碎裂或空洞等人为现象。组织脱水时间要充分，最终乙醇脱水液的浓度应保持在100%，这在潮湿的天气很难达到100%的浓度，使用空调会减少实验室的湿度。加盖或密封与环境相对隔离对保持乙醇的浓度会有帮助。

虽然乙醇对细胞学涂片固定效果非常好，但是，乙醇容易使组织变脆。结果切片易碎出现“活动百叶窗”现象。

盖玻片下气泡多数情况是由于封固剂太稀，盖玻片下封固剂干后浓缩而形成气泡。封固剂太稠，封片方法不当也容易形成气泡（滴加封固剂后盖玻片应该从一侧轻轻放下，这样封固剂就会慢慢向另一侧散开，避免气泡的形成）。

三、组织处理中的问题

“漂浮物”是小片组织出现在不属于该例标本本身的组织切片上。漂浮物多为组织处理过程中污染而来。例如，取材时取材用具没有彻底清洗就有可能把碎组织带给下一例。因此，每取一例都要彻底清洗取材用具（取材板，刀，剪，手套等），然后再取下一例。取材之前把相同标本分开编号会有助于漂浮物的辨认。例如，有三例前列腺标本，将它们分开加到其它不同的组织标本（胃，肠，子宫）中间。采用这样的方法，如果号码换位，标签写错或者带过去碎组织，那你就会发现一个明显的错误，就会很容易的把带过去的前列腺组织确定为漂浮物。完全相同的组织很难识别出来。如果不用一次性包埋盒，你必须意识到组织有可能带到其它病例中去，问题有可能发生在几天之后，漂浮物来自没有处理干净的脱水盒。引起这样的问题是在包埋时漏掉了小块组织或组织碎片，在清洗时有没有将脱水盒处理干净。再次使用脱水盒时就有可能混入新组织中。漂浮物一般形态保存的很好，因为它们都被蜡处理过。漂浮物是可以识别的，只要能够确信病人标本和容器上的标签与申请单相符，而且病理号始终和组织一起出现。对没有标记的组织不可轻信，错误标记或没有标记的组织有时会引起法律纠纷。

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