化工新技术论文范文

时间:2024.4.21

绿色化学论文范文关于绿色化学的论文:

浅论“绿色”化学教育

摘 要:在中学阶段进行绿色化学理念的教育,是培养具有绿色意识和环保能力的高素质人才的根本途径,也是解决环境问题的根本途径。本文提出了几点在中学化学教育过程中渗透实施绿色化学教育的设想,使更多的教育工作者投入这项工作,共同努力,使中学绿色化学教育成为可能。
  关键词:绿色化学 化学教育 绿色化学教育
  
  环境与发展问题,已成了当代世界共同面临的两难选择,成了对21世纪人类最严峻的挑战,人类不得不面临新的环境问题。为了从根本上预防和治理环境污染,必须依靠近年在国际上引起极大关注的化学领域——绿色化学(Green Chemisty)。
  
  一、“绿色化学”的提出和内涵
  
  “绿色化学”这个名称最早出现在美国环保局的官方文件中,以突出化学对环境的友好。1995年,美国总统克林顿、副总统戈尔专设了“总统绿色化学挑战奖”,以推动社会各界进行化学污染预防和工业生态学研究,鼓励支持重大的创造性的科学技术突破,从根本上减少乃至杜绝化学污染源。由于上述原因,使得“绿色化学”这个名称广为传播。
  “绿色化学”是当今社会提出的一个新概念。在“绿色化学工艺”中,理想状态是反应物中原子全部转化为欲制得的产物,即原子利用率为100%(原子经济性)。原子的利用率越高,意味着生产过程中废物的排放量越少,对环境的影响也越小。
  把绿色化学融合于中学课程教材改革和课堂教学改革之中,便绿色化学成为中学化学教育的一个重要的组成部分,这是中学化学教育的崭新课题。
  
  二、“绿色化学”在中学化学中的渗透
  
  1、立足课堂,渗透绿色知识。
  化学课堂是教学的主阵地,也是向学生传授环保知识的好场所。而绿色化学要求与环境教育宗旨是高度一致的。在实施环境教育过程中,要向学生阐明绿色化学的观点、要求,使他们树立起防治污染、保证人类生存质量的责任感。化学教师要充分挖掘和利用教材中的环保知识内容,采取渗透的方式,在介绍某种物质或操作方法时自然地引入相关的环保知识,让学生增长环保知识。如讲二氧化硫时,我就向学生说明它是一种主要的大气污染物,它和氮氧化合物都是形成酸雨的主要物质,空气中二氧化硫70%来源于工业燃料,12%来源于工业燃油,其余则来源于生活燃煤等。它既直接危害人的身体健康,又可以导致水质酸化,水生动物减少或绝迹,树木、庄稼枯死,还能腐蚀建筑物和文物。最后让学生讨论:如何防止和减少SO2的污染。这样既增强了学生的环保意识,又调动了学生学习的积极性
  2、立足实验,培养绿色习惯。
  化学实验教学不仅可以使学生观察到用语言难以表达清楚的清晰的实验现象,增强直观的感性认识,而且能培养学生观察、描述、分析问题和解决问题的能力。但实验必定会涉及到有害、有毒的物质,从某种意义上讲学校中环境污染主要来源于化学实验。实验教学与绿色化学联系最为紧密,最为直接,在实验教学贯彻绿色化学思想是非常必要的。
   (1)、药品的贮存方法的规范化。如易挥发的液溴、浓硝酸、浓盐酸等用钟罩封闭贮存;对大多数有机物如苯、甲苯、丙酮、甲醛等用专柜避光保存;对剧毒品如汞、白磷等用专柜上锁保存,定期检查贮存情况。
  (2)、实验中尾气的吸收处理。如在制取硫化氢、二氧化硫、氯气、氯化氢、一氧化氮、二氧化氮、氨气、一氧化碳等气体时一定要通过演示实验讲情吸收的原因(有害气体不允许直接排放到大气中),强调尾气吸收的重要性,使学生深深认识到只要涉及气体的制备问题就应考虑尾气处理。
  (3)、规范实验操作使实验在严密的情况下进行,体验绿色化学。化学实验中,师生都要接触有害物质和无害物质,在实验中也会闻到有害和无害气体。因此,必须指导学生要严格按照实验操作的程序,有条不紊地进行各种实验。严格教育学生规范操作,正确地闻气体、取药品、取有毒性原料。实验结束后,处理化学废物和实验中产生的废气。把仪器洗涤干净放回原处,擦洗干净实验桌面,这些都要认真细致指导,使实验活动从使至终成为对学生进行环境教育的课堂。
  (4)、实验微型化。目前在常规实验中,药品用量较多不仅造成浪费,还污染环境。因此,在实验中用玻璃管制成各种可加热仪器的替代实验仪器、用点滴板等进行微型系列实验。这种方法药品用量少、反应产物少、操作安全,实验不会造成危险,对环境的污染程度较轻。同时也达到了实验的目的。
  3、立足课外,提高绿色素质
  课堂教学是对学生进行绿色教育的主阵地,但课外活动形式多种多样,内容丰富多彩,是课堂教育的很好补充。为了全面提高每个学生的绿色素质,组织学生积极参与课外社会实践活动。
  (1)、专题讲座。对教材中讲的少而对环保具有重大意义的内容,可以专题讲座的形式向学生介绍,如针对有的学生认为环境污染主要是由于工业生产造成的,与自身没有太大的关系。可举办家庭生活与环境污染讲座。
  (2)、课外实验。积极利用课外实验配合课堂教学,开展环保教育。“河水、雨水酸碱性的检测”、“模拟水体受硝酸汞、硫酸铜等污染的检测及危害”、“干电池的收回河利用”等,让学生在实验过程中既锻炼动手能力又强化了绿色意识。
  (3)、实地参观社会调查。组织学生参观本地邻近的自来水厂、污水处理站、化工厂并进行实地调查。如空气污染调查、水污染及对策调查等调查报告,并进行交流。这样不仅能培养学生理论联系实际、实事求是的科学态度,而且能使他们感知环境污染的危害性河环境保护的迫切性。
  随着世界经济的发展,一场绿色变革浪潮正席卷全球,二十一世纪将成为绿色世纪。在中学化学教学中开展绿色化教育是历史赋予我们的责任。绿色化教育有利于保护人类赖以生存的环境,实现人类社会可持续发展,中学化学必须体现绿色化学教育,要让绿色化学的思想和内容贯穿于整个教育活动之中,真正做到绿色无所不在,只有这样我们的教育才能够充满生机,绿意盎然。


第二篇:化工论文范文


报告二说明:

1.        本报告为一个学生的优秀作业 (在原作业上进行了修改,且参考文献不针对该论文,故该论文仅供学生们写作参考,不要随意复制、转贴、引用)。

2.        作业条理清晰、表达规范,即要有较好的可读、可视性。作业的内容包括中文题目、作者及单位、中文摘要、中文关键词、英文题目、英文作者及单位、英文摘要、英文关键词、前言、正文、结论或展望、参考文献、附件(从你的参考文献中选取一篇英文文献,将其摘要翻译成中文)。章节编号、字体、字号基本按照本范文(可以将本范文拷贝过去作为模板进行写作)。

3.        正文根据需要分小节写作。结论或展望要有自己的思想。

4.        参考文现注意:(1)要求使用Endnote排版参考文献的顺序和格式,其格式符合国际期刊Chemical Engineering Journal(安装免费EndNote软件――熟悉软件的使用,在其子目录Styles下拷贝进去我提供的Chem Engieering J.ens)。(2)一定要有英文文献(要求你阅读过或至少阅读过摘要,以便从中选一篇进行摘要翻译)。(3)如果是自己没有读过的文献请不要列到参考文献中(读过摘要的可以)。(4)熟悉中国作者和国外作者姓名的差别(英文中作者一般不给全名,名用大写首字,姓全写)。

5.        注意图和表的格式:图表需要有图表号,按次序标明(如果从文献拷贝的,还要标明参考文献);图表号后面是图表名(图表均需要有名);图表一定要在文章的适当地方提到(如:图1是…或如图1所示,表1给出了…)。

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电泳技术在生化分离领域的运用

ABC  

(厦门大学化学工程与生物工程系,厦门 361005)

  : 电泳技术,是指在电场作用下带电颗粒在由于所带的电荷不同以及分子大小差异而有不同的迁移行为从而彼此分离开来的一种实验技术。在生化分离领域,主要运用的电泳技术包括凝胶电泳,薄膜电泳,等电聚焦等。本文将着重介绍毛细管电泳和凝胶双向电泳的运用。

关键词: 双向凝胶电泳,毛细管电泳,生化分离

Applications of Electrophoresis in the Field of Biochemistry Separation

ABC

(Department of Chemical and Biochemical Engineering, Xiamen Univeristy, Xiamen 361005, China) 

Abstract Electrophoresis is a method basically used for separating macromolecules, such as nucleic acids or proteins, in terms of molecular sizes, electric charges, and other physical properties under applied electrical field. This paper introduces the development of the electrophoresis technique, discusses some important methods including gel electrophoresis, film electroprssis, isoelectric focusing and so on. The applications of the two-dimensional electrophoresis and the capillary electrophoresis are analyzed in detail.

Key wordsTwo-dimensional electrophoresis; capillary electrophoresis; biochemical separation

   

许多生物分子都带有电荷,但由于混合物中各种组分所带电荷性质、电荷数量以及相对分子质量的不同,在同一电场的作用下,在一定时间内各组分移动的距离不同,从而达到分离鉴定各组分的目的,这是电泳的基本原理。从19世纪开始的电泳技术研究到现今电泳技术在生化分离领域的广泛运用,先后出现了胶体电泳,滤纸电泳,凝胶电泳,和目前广受重视的毛细管电泳等多种电泳技术。作为生化分离,分析的重要手段,电泳技术在稳定性,分辨率和保持产物活性方面已取得了巨大的进步,当然还存在着电泳结果不能直接分析,必须进行染色,而不同蛋白质与染料的结合差异较大,还不能广泛应用质谱技术、高敏感检测技术直接分析双向凝胶电泳结果,实现分析自动化等问题。本文介绍了电泳技术的原理,发展和现状,并着重分析了目前广泛运用和研究的毛细管电泳以及双向凝胶电泳,展望电泳技术将不断发展,日渐完善。

1.       电泳技术的产生,发展与现状

已经有大量的相关文献对电泳技术的发展作过详细的描述[1]。

1809年俄国物理学家Рейсе首次发现电泳现象。他在湿粘土中插上带玻璃管的正负两个电极,加电压后发现正极玻璃管中原有的水层变混浊,即带负电荷的粘土颗粒向正极移动,这就是电泳现象。

1909年Michaelis首次将胶体离子在电场中的移动称为电泳。他用不同pH的溶液在U形管中测定了转化酶和过氧化氢酶的电泳移动和等电点。

1937年瑞典Uppsala大学的Tiselius对电泳仪器作了改进,创造了Tiselius电泳仪,建立了研究蛋白质的移动界面电泳方法,并首次证明了血清是由白蛋白及α、β、γ球蛋白组成的,由于Tiselius在电泳技术方面做出的开拓性贡献而获得了1948年的诺贝尔化学奖。

1948年Wieland和Fischer重新发展了以滤纸作为支持介质的电泳方法,对氨基酸的分离进行过研究。

    从本世纪50年代起,特别是1950年Durrum用纸电泳进行了各种蛋白质的分离以后,开创了利用各种固体物质(如各种滤纸、醋酸纤维素薄膜、琼脂凝胶、淀粉凝胶等)作为支持介质的区带电泳方法。

1959年Raymond和Weintraub利用人工合成的凝胶作为支持介质,创建了聚丙烯酰胺凝胶电泳,极大地提高了电泳技术的分辨率,开创了近代电泳的新时代。30多年来,聚丙

烯酰胺凝胶电泳仍是生物化学和分子生物学中对蛋白质、多肽、核酸等生物大分子使用最普遍,分辨率最高的分析鉴定技术,是检验生化物质的最高纯度:即"电泳纯"(一维电泳一条带或二维电泳一个点)的标准分析鉴定方法,至今仍被人们称为是对生物大分子进行分析鉴定的最后、最准确的手段,即"Last Check"。

    由80年代发展起来的新的毛细管电泳技术,是化学和生化分析鉴定技术的重要新发展,己受到人们的充分重视。

11 毛细管电泳的产生和发展

    毛细管电泳技术(Capillary Electrophoresis,CE)又称高效毛细管电泳(HPCE)或毛细管分离法(CESM),毛细管电泳方法虽新工艺,但历史悠久,它是在电泳技术的基础上发展的一种分离技术[2]。电泳作为一种技术出现,已有近百年的历史,但真正被视为一种在生物化学中有重要意义的技术,是由1937年A. Tiselius 首先提出。传统电泳最大的局限是难以克服由高电压引起的焦耳热,1967年Hjerten最先提出在直径为3mm的毛细管中做自由溶液的区带电泳(Capillary Zone Electro-phoresis, CZE)。但他没有完全克服传统电泳的弊端。现在所说的毛细管电泳技术(CE)是由Jorgenson和Lukacs在1981年首先提出,他们使用了75mm的毛细管柱,用荧光检测器对多种组分实现了分离。1984年Terabe将胶束引入毛细管电泳,开创了毛细管电泳的重要分支:胶束电动毛细管色谱(MEKC)。1987年Hjerten等把传统的等电聚焦过程转移到毛细管内进行。同年,Cohen发表了毛细管凝胶电泳的工作。近年来,将液相色谱的固定相引入毛细管电泳中,又发展了电色谱,扩大了电泳的应用范围。

1.2        双向凝胶电泳的产生和发展

    双向电泳由O’Farrell’s于1975年首次建立并成功地分离约1 000个E.coli蛋白,并表明蛋白质谱不是稳定的,而是随环境而变化。 目前,随着技术的飞速发展,已能分离出10 000个斑点[3]。

2.       电泳的基本原理

2. 1  电泳原理

电泳技术,是指在电场作用下,带电颗粒在由于所带的电荷不同以及分子大小差异而有不同的迁移行为从而彼此分离开来的一种实验技术。许多生物分子都带有电荷,其电荷的多少取决于分子结构及所在介质的pH值和组成。由于混合物中各种组分所带电荷性质、电荷数量以及相对分子质量的不同,在同一电场的作用下(如图1所示),各组分涌动的方向和速率也各异。因此,在一定时间内各组分移动的距离也不同,从而达到分离鉴定各组分的目的。

图1 电泳分离原理[4]

2. 2  电泳方法的分类

    按分离原理,电泳分为如下四类[5]:(1)区带电泳:电泳过程中,不同的离子成分在均一的缓冲液体中分离成独立的区带,这是当前最广泛的电泳技术。(2) 移界电泳:是最早建立的电泳,它是在U型管中进行的,由于分离效果较差,已为其他电泳技术所取代。(3) 等速电泳:必需用电泳仪,当电泳达到平衡后,各区带相分成清晰的界面,并以等速移动。(4) 等电聚焦:由于具有不同等电点的两性电解质载体在电场中,自动形成pH梯度,使被分离物移动至各自等电点的pH处聚集形成很窄的区带,且分辨率较高。

    按有无固体支持物分为自由电泳和支持物电泳[6]。前者包括(1)显微电泳(也称细胞电泳),是在显微镜下观察细胞或细菌的电泳行为;(2)移界电泳;(3)柱电泳 (在层析柱中进行,可利用密度梯度的差別,使分离的区带不再混合,如再配合pH梯度则为等电聚焦柱电泳);(4)自由流动幕电泳;(5)等速电泳。后者中支持物是多种多样的,也是目前应用最多的一种方法。其电泳过程可以是连续的或是不连续的可进行常压电泳、高压电泳、免疫电泳、等电聚焦电泳及等速电泳。根据支持物的特点又分为:1)无阻滯支持物,如滤纸、醋酸纤维薄膜、纤维素粉、淀粉、玻璃粉、凝胶颗粒等。2)高密度的凝胶,如淀粉凝胶、聚丙烯酰胺凝胶、琼脂或琼脂糖凝胶。

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3.电泳技术的应用

电泳技术主要用于分离各种有机物(如氨基酸、多肽、蛋白质、脂类、核苷酸、核酸等)和无机盐;也可用于分析某种物质纯度,还可用于分子量的测定。电泳技术与其他分离技术(如层析法)结合,可用于蛋白质结构的分析,“指纹法”就是电泳法与层析法的结合产物。用免疫原理测试电泳结果,提高了对蛋白质的鉴别能力。电泳与酶学技术结合发现了同工酶,对于酶的催化和调节功能有了深入的了解。所以电泳技术是生化分离领域中的重要研究技术。

3. 1  电泳技术的常用方法

3. 1. 1   纸电泳和醋酸纤维薄膜电泳[7]

纸电泳用于血清蛋白质分离已有相当长的历史,在实验室和临床检验中都曾经广泛应用。自从1957年Kohn首先将醋酸纤维薄膜用作电泳支持物以来,纸电泳已被醋酸纤维薄膜电泳所取代。因为后者具有比纸电泳电渗小、分离速率快、分离清晰、血清用量少以及操作简单等优点。

醋酸纤维素是纤维素的羟基乙酰化形成的纤维素醋酸酯。由该物质制成的薄膜称为醋酸纤维素薄膜。这种薄膜对蛋白质样品吸附性小,几乎能完全消除纸电泳中出现的“拖尾”现象,又因为膜的亲水性比较小,它所容纳的缓冲液也少,电泳时电流的大部分由样品传导,所以分离速度快,电泳时间短,样品用量少。 醋酸纤维素膜经过冰醋酸乙醇溶液或其它透明液处理后可使膜透明化有利于对电泳图谱的光吸收扫描测定和膜的长期保存。

3. 1. 2   琼脂糖凝胶电泳[8]

琼脂经处理去除其中的果胶成分即为琼脂糖。由于琼脂糖中硫酸根含量较琼脂为少,电渗影响减弱,因而使分离效果显著提高。例如血清脂蛋白用琼脂凝胶电泳只能分出两条区带(α-脂蛋白、β-脂蛋白),而琼脂糖凝胶电泳可将血清脂蛋白分出三条区带(α-脂蛋白、前β-脂蛋白和β-脂蛋白)。所以琼脂糖为较理想的凝胶电泳的一种材料。琼脂糖凝胶孔径较大,对一般蛋白质不起分子筛作用,但适用于分离同工酶及其亚型,大分子核酸等应用较广。由于凝胶是透明的,因此可与免疫法技术结合进行免疫电泳和对流免疫电泳。

3. 1. 3   聚丙烯酰胺凝胶电泳[9]

聚丙烯酰胺凝胶(PAGE)是一种人工合成的凝胶,具有机械强度好、弹性大、透明、化学稳定性高、无电渗作用、设备简单、样品量小(1~100ug)、分辨率高等优点,并可通过控制单体浓度或单体与交联剂的比例,聚合成不同孔径大小的凝胶,可用于蛋白质、核酸等分子大小不同的物质的分离、定性和定量分析,还可结合解离剂十二烷基硫酸钠(SDS),以测定蛋白质亚基的相对分子质量,是目前分离分子的最好方法。其分离是以物质的物理差异,分子大小和净电荷为基础的,即分离除了利用物质所带电位的差别外,还具有分子筛的特殊作用,这种性质为分开电泳率很相近的大分子提供了简单有效的方法,例如用它进行血清蛋白质分离时,可以分离出几十个区带,分辨率很高,其它电泳方法则通常只能分离出5~6条区带。除此之外,多肽SDS- PA GE 和含尿素的多肽SDS- PA GE都是很好的分离小分子质量多肽(5~20 ku) 的电泳方法。

3. 1. 4   等电聚焦电泳技术(IEF)[10]

等电聚焦是60年代中期问世的一种利用有pH梯度的介质分离等电点不同的蛋白质的电泳技术。由于其分辨率可达0.01pH单位,因此特别适合于分离分子量相近而等电点不同的蛋白质组分。

    在等电聚焦的电泳中,具有pH梯度的介质其分布是从阳极到阴极,pH值逐渐增大。如前所述,蛋白质分子具有两性解离及等电点的特征,这样在碱性区域蛋白质分子带负电荷向阳极移动,直至某一pH位点时失去电荷而停止移动,此处介质的pH恰好等于聚焦蛋白质分子的等电点(pl)。同理,位于酸性区域的蛋白质分子带正电荷向阴极移动,直到它们的等电点上聚焦为止。可见在该方法中,等电点是蛋白质组分的特性量度,将等电点不同的蛋白质混合物加入有pH梯度的凝胶介质中,在电场内经过一定时间后,各组分将分别聚焦在各自等电点相应的pH位置上,形成分离的蛋白质区带。

3. 2  最新电泳技术在蛋白质分离中的运用

3. 2. 1   双向凝胶电泳技术[11]

随着后基因组时代的到来,对许多生物体的研究已经进入蛋白质组学研究阶段。蛋白质组(proteome) 是指由一个细胞或一个组织的基因组所表达的全部相应的蛋白质, 1994 年由澳大利亚学者Wilkins 和Williams 首次提出。蛋白组研究的手段主要是高通量双向电泳(2DE)进行蛋白质的分离,再由专业计算机软件进行图像分析,然后通过质谱技术及蛋白质数据信息处理技术对凝胶上的蛋白质进行分离和鉴定。其中一个关键步骤就是细胞或样品中蛋白质的分离,目前最佳的方法就是2DE。传统的单向电泳方法最多只能分析100种蛋白质样品,而一块典型的2DE胶大约能分离2000个蛋白点,最好的大约能分离10000多个蛋白点。

1975 年,O’ Farrel 首先建立了等电聚焦/ SDS - 聚丙烯酰胺双向凝胶电泳( IEF/ SDS -PAGE) 分离和分析蛋白质组分的技术[12]。这一技术应用两个不同分离原理依据蛋白质的特性进行分离。第一相依据蛋白质所带电荷量的不同,用等电点( PI) 聚焦技术分离蛋白质。在此方法中引入固定p H 梯度技术( IPG) 可以实现等电点仅有0. 01 pH 单位差别的蛋白质的分离。从而大大提高了分析的灵敏度。第二相是依据蛋白质分子量大小的差别,通过蛋白质与SDS 形成复合物后,在聚丙烯酰胺凝胶电泳中迁移速率不同达到分离蛋白质的目的。虽然O ’Farrel 于1975 年就采用蛋白双向电泳法进行蛋白质的分离及检验,但当时采用两性电解质载体(carrier ampholyte) 聚丙烯酰胺凝胶电泳法,从而限制了蛋白双向电泳的稳定性及可靠性. 随着近来技术的进步与更新,蛋白双向电泳在不同方面得到改进与完善. 尤其是固定pH梯度胶( immobilized pH gradient) 概念的出现,采用固定于塑料支撑条上的固定pH 梯度胶代替过去的两性电解质载体毛细管胶进行蛋白等电聚焦。 这大大地提高了蛋白等电聚焦的分辨率与稳定性。

根据第一向等电聚焦条件的不同,可将2 - DE 分为三种方法: 第一种方法是在丙烯酰胺胶中进行,两性电解质在外加电场作用下形成pH 梯度,该方法称为ISO- DALT。其主要缺点pH梯度不稳定,上样量低,重复性差,不利于不同实验室间进行图谱比较。如果第一向电泳使烯酰胺和固相化的两性电解质immobilines(商品名)共聚,可形成具有pH 梯度的凝胶,这种方法IPG- DALT 系统,是现在主要和常用的方法。该方法的优势表现在: 1)pH 梯度稳定, 聚焦确,精度高,梯度分辨率可以达到0. 001pH,目前在一块胶上最多可分离10300 多个点; 2) 无阴极漂移及碱性蛋白丢失的现象; 3) 蛋白上样量大,可以提高低丰度成分的分辨效果; 4) 样品中盐的干扰少,无边缘效应; 5)pH 梯度和分离结果的重复性好。第三种方法是非平衡pH 梯度电泳( nonequilibrium pH gradient electrophoresis , NEPhGE) ,主要用于碱性蛋白的分离。鉴于分辨率、重复性的限制和IPG - DAL T分离碱性蛋白的优势, NEPhGE 电泳已不是分离碱性蛋白的优选方法[12]。

  蛋白质点染色最好采用自动凝胶染色仪编制程序进行染色,它使染色各个操作步骤的时间、温度、染色盘的振荡控制有较高的可控性和重复性,进而使2DE 胶染色有较好的可比性,便于后续的2DE 胶分析。但由于自动凝胶染色盘中溶液的体积受限制,对于较厚和较大的凝胶洗涤不彻底,致使染色背景较深,这时最好采用大染色盘,保证需要比较的凝胶在同一条件下染色。染色后,使用高分辨率的扫描仪,对电泳后的湿胶直接扫描,可避免干燥保存后固缩造成的波纹对凝胶图像分析的影响。

随着超灵敏度质谱技术的发展,发现双向凝胶电泳并不能将所有蛋白质完全分离,许多斑点仍为两个或更多蛋白的混合物。此外,在其应用中仍然存在很多局限: (1) 样品上样量小,使蛋白检测的灵敏度受到限制, (2) 电泳结果须经染色处理, 不能直接分析。并且不同蛋白质与染料的结合差异较大, (3) 分子量过大( > 100000) ,过小( < 10000) 不适于此法分离检测, (4) 一些疏水性膜蛋白(常常是很多药物作用的靶点) 因不能溶于提取溶剂而不适合上样于凝胶电泳, (5) 目前,尚不能实现完全自动化处理,(6) 实验结果表明当蛋白质的拷贝数低于1000时,双向电泳技术是不能分辨出来的。为了分析低拷贝蛋白质,必须简化样品的处理步骤,减少蛋白质的流失。可应用超声组织粉碎仪,超速离心机等措施,提高蛋白质的提取量[13]。

3. 2. 2   毛细管电泳( CE) 技术

毛细管电泳是目前广泛应用的高效分离分析技术,CE 与高效液相色谱(HPLC) 一样同是液相分离技术, 很大程度上CE与HPLC 互为补充, 但无论从效率、速度、用量和成本来说, CE 都显示了它的优势。CE 没有泵输运系统, 成本相对要低, 且可通过改变操作模式和缓冲液成分, 根据不同的分子性质(如大小、电荷数、手征性、疏水性等) 对极广泛的物质进行有效分离, 相比之下, 为达到相同目的, HPLC 要用价格昂贵的柱子和溶剂。毛细管电泳的主要优点有[13]:①极高的分离性能,其每米的理论塔板数为几十万到100 万以上,远高于离子色谱。②超微量进样,其进样量为纳升级。③快速简便。毛细管区带电泳适用于小离子的测定,其峰容量是离子色谱法的10 倍,如可在30 s 内完成对样品中硝酸根和亚硝酸根的测定。毛细管电泳仪的结构及操作也比离子色谱简单。④试剂消耗少,维持费用低,对环境污染少。相对于离子色谱,其所用毛细管的价格远低于色谱柱。

EC应用于蛋白质组的研究,主要包括[14]:(1)毛细管区带电泳(CZE) ,主要依据不同蛋白质的电荷质量比差异实现分离。CZE可以实现阴阳离子的同时分离,但对中性组分无分离效果。(2)毛细管等电聚焦(C IEF) 用两性电解质在毛细管内建立pH 梯度, 使各种不同等电点的蛋白质在电场作用下迁移到等电点的位置, 形成一条非常窄的聚焦区带。可用于测定蛋白质的等电点, 分离异构体和其他方法难以分离的蛋白质。分离效果与双向凝胶电泳结果相关性良好。(3)筛板(SDS – CE) 依据SDS - 蛋白质复合物在网状骨架中迁移速率的不同实现分离。CE 对蛋白质的分离与双相凝胶电泳比较, 可以实现在线自动分析, 并可用于分子量范围不适于双相凝胶电泳的样品分析。缺点在于复杂样品的分离尚不完全。(4)毛细管电色谱(CEC)[14]是将HPLC 发展起来的众多固定相填充到毛细管中或涂敷在毛细管壁上, 使之如同色谱固定相一样参与分离。可以说CEC 是CE 与HPLC 的有机结合, 既有CE 的高柱效, 又有HPLC 的高选择性, 利用涂层还可有效减少生物大分子如蛋白分子在毛细管壁的吸附, 改善峰形, 提高选择性, 是一种很有发展前景的模式。(5)胶束电动毛细管色谱(MECC)是在电泳缓冲液中加入离子型表面活性剂!如十二烷基硫酸钠(SDS).当溶液中表面活性剂浓度超过临界胶束浓度时,表面活性剂分子之间的疏水基团聚集在一起形成胶束假固定相,通过分离对象在胶束相和水相之间的分配系数不同而实现分离。胶束电动毛细管色谱的突出优点是不仅能分析离子化合物,还能分析不带电荷的中性化合物,把电泳分离的对象从离子化合物扩展到中性化合物,从而拓宽了毛细管电泳的应用范围。(6)为了满足大批量样品的分离要求,特别是在人类基因组和蛋白组计划中的应用,毛细管阵列电泳(CAE) 的分离模式渐渐呈现出了广阔的应用发展前景和趋势。与传统聚丙烯酰胺凝胶板电泳可以进行多道平行分析相似,毛细管阵列电泳即是采用多根毛细管组成的阵列进行多道分析的一种分离模式。

随着芯片技术的发展,电泳芯片尤其引起了人们的关注,毛细管电泳的分析模式几乎都可能转移到芯片平台。Li 等[12]已经成功地将电泳芯片与质谱联用分离检测蛋白质水解产物。他们把CE 芯片与纳电喷雾质谱联用, 建立一套chip2CEPQqTOF MS 系统用来分析痕量膜蛋白。样品处理简单,只需一维电泳分离,水解成肽段后直接进样,分离时间不到1. 5 min。毛细管电动色谱芯片也已被提出,用于肽的分离。

作为DNA 测序最重要的、在蛋白质分析中也广泛应用的检测器—激光诱导荧光(LIF) 检测,发展尤其迅速。一系列新的荧光标记试剂不断研究出来,柱前标记、在柱标记及柱后标记等多种标记方法也逐步成熟。

虽然毛细管电泳有很多优点,但其缺点也是明显的。毛细管电泳法检测目标物质的原理是同一缓冲液中不同离子运动速率的差异,这是不同离子在同一缓冲液中形成不同离子区带的基础。同样,由于不同离子运动速率的差异,其形成的区带的宽度不同,单位体积缓冲液中离子的数量不同,造成了先期到达的离子区带“紧实”,峰形尖削,而后面到达的离子形成的区带不明显,单位体积缓冲液中离子的数量小,因此当这种“松散”区带经过检测窗口时需要的时间长,峰矮而胖,与基线的界限不明显,造成待测物质的检测不准确甚至困难。该技术运用于细胞和细胞组分分析领域还存在许多难点[15],如:缓冲液的选择对细胞颗粒电泳时候完整性的影响;如何保证每次细胞进样量的恒定;不同细胞中同一成分的含量不同对单细胞分析是否有影响,如何选择对照的指标等等,都值得进一步探讨。毛细管电泳今后发展方向仍是继续提高分辨率、速度和检测器的选择性。同时,增加自动进样装置和使之微机化、商品化。另外,将它与质谱仪更好地结合,可对生物分子特性作出更快、更准确的分析,以进一步拓宽毛细管电泳在生物领域的应用范围。

3.3        其它电泳技术在生化分离领域的运用

3.3.1            等速电泳法检测无机和有机阴离子[16]

    毛细管电泳法可同时分离检测多种阴离子,具有高效,快速等特点。等速电泳法也可以同时分离检测多种阴离子也有其优点;(1)区带界面有“自身校正”效应,两个区带界面清晰,因此等速电泳法有较高的分辨率;(2)对低含量样品,等速电泳法具有自富集效应,监测限较低;(3)易与其它技术联用。

3.3.2    介体电泳技术[16]

    介体电泳技术(preparative electrophoresis) 是生物纯化技术的一个革命,它将电泳分离技术的原理与膜过滤分离技术的原理的相结合,利用分子的大小和其所带电荷的性质不同,对复杂的生物溶液进行纯化、浓缩和盐析。澳大利亚著名科学家Joel Margolis ,即第一块梯度电泳胶的构思者,根据介体电泳技术原理发明了Gradiflow仪,经过10 多年的研制和改进后,于1998年开始进入市场。介体电泳技术的优越性具体体现在: ①减少了生物活性物质的降解,纯化条件温和,无强酸强碱、强电解质溶液,无高压,可在适宜的温度下操作; ②纯化费用低,操作容易,Gradiflow仪无需柱子、电泳胶,无需高压、梯度处理和冷冻室,且仪器设备的价格低廉; ③产量高,纯化时间短,纯化速度可达80 gPh; ④纯化的同时可进行浓缩和脱盐,所以适用于未经加工的原溶液; ⑤因每次更换新的分离膜片,无交叉污染; ⑥Gradiflow仪在纯化的同时可以除去病毒、细菌和内毒素等病原体。

3.3.2            单细胞凝胶电泳(SCGE) [15]

单细胞凝胶电泳(SCGE)又称彗星试验(comet assay) ,是由Ostling等于1984年首次提出,并利用该技术在中性条件下检测γ射线引起的DNA 双链断裂。1997年,Santos 等首次将SCGE 技术与DNA 荧光原位杂交技术(FISH) 结合起来,为SCGE 技术的应用开辟了新的途径。我国朱志良博士率先在国内建立了彗星2荧光原位杂交技术体系,并利用该技术体系发现人9 号染色体是苯代谢产物的靶染色体。2001 年,Nadin 等建立了SCGE 银染法,进一步提高了损伤DNA 分析的灵敏度。其原理是:包埋在琼脂糖凝胶中的细胞经裂解和解螺旋,使断裂的DNA 碎片进入凝胶,在电场作用下,带负电荷的DNA 断片向阳极迁移,形成彗星影像。由于该方法具有敏感、简便、快速、低耗等优点,广泛应用于遗传毒理、环境监测、临床、饮食以及氧化应激和细胞凋亡的研究。

4.展望

运用电泳技术解决生化分离中的各种难题,已取得重大进展,双向凝胶电泳和毛细管电泳更是近年来研究的重点, 但是要应用于实际领域,还有很多问题尚待解决。就当前进展来看,今后的研究主要集中在以下两个方面: (1) 质谱技术、高敏感检测技术直接分析双向凝胶电泳结果, 实现分析自动化。当前,各种自动化电泳分析仪(如美国Helena 公司PEP/SPIEF 全自动电泳系统,法国Sebia 公司Hydrasys 全自动电泳技术等)多采用半干技术,检测灵敏度高,特异性强,重复性好,仅需1~2h就可获得清晰结果,且胶片干后可保存,目前还在推广中。(2) 以CE、HPLC - MS - MS 技术取代传统双向凝胶电泳,实现上样、分离、分析的完全自动化。因此,随着电泳技术的不断深入研究,其在生化分离过程的运用将日臻完善。

参考文献

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[11] E. Bertakis, I. Lemonis, S. Katsoufis, E. Voutsas, R. Dohrn, K. Magoulas, D. Tassios, Measurement and thermodynamic modeling of solid-liquid-gas equilibrium of some organic compounds in the presence of CO2, Journal of Supercritical Fluids, 41 (2007) 238-245.

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[14] X. Wang, H. Chen, Y.N. Guo, Y.Z. Su, H.T. Wang, J. Li, Preparation of ibuprofen/lipid composite microparticles by supercritical fluid technique, Frontiers of chemical engineering in China, 2 (2008) 361-367.

[15] J.D. Hong, H. Chen, J. Li, H.A. Matos, E.G. de Azevedo, Calculation of solid-liquid-gas equilibrium for binary systems containing CO2, Industrial & Engineering Chemistry Research, 48 (2009) 4579-4585.

[16] J.D. Hong, D. Hua, X. Wang, H.T. Wang, J. Li, Solid-Liquid-Gas Equilibrium of the Ternaries Ibuprofen+myristic Acid+CO2 and Ibuprofen+Tripalmitin+CO2, Journal of Chemical and Engineering Data, 55 (2009) 297-302.

附:摘要翻译(要求提供:文献来源――需从你参考文献中选;英文摘要和中文翻译)

英文摘要来源于参考文献[11]:E. Bertakis, I. Lemonis, S. Katsoufis, E. Voutsas, R. Dohrn, K. Magoulas, D. Tassios, Measurement and thermodynamic modeling of solid-liquid-gas equilibrium of some organic compounds in the presence of CO2, Journal of Supercritical Fluids, 41 (2007) 238-245.

Abstract

Rapid analysis of nitrate and nitrite by capillary electrophoresis (CE) has been limited by the ions’ very similar electrophoretic mobilities. With a pKa of 3.15, the mobility of nitrite can be selectively reduced using a low pH buffer in CE. A much shorter capillary can be used and separation voltages can be increased. With this method, nitrate and nitrite are separated in just over 10 s. This is roughly 20 times faster than current separation methods. Direct UV detection at 214 nm was employed and offered sub μM detection limits. Total analysis time (pre-rinse, injection, and separation) was less than 1 min, making this method ideal for high-throughput analysis.

摘要:毛细电泳技术快速分析硝酸和亚硝酸盐受限于硝酸和亚硝酸根离子的相近的电泳迁移率。当对毛细电泳技术应用低pH值缓冲液时(pKa= 3.15),亚硝酸根离子可以选择性地降低其迁移率。这样,可以方便地使用短的毛细管并使用较高的分离电压。用该方法,硝酸和亚硝酸盐可以在约10秒可以得到分离,这比目前使用的分离方法差不多快20倍。分析时,可以直接用UV检测器于214纳米处进行检测,其检测限为亚微米。该方法总分析时间小于1min(包括预洗、注射和分离)。因此该方法是一种快速分析的理想方法。

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