实验三：影响神经冲动传导的因素观察
实验目的：
1．继续学习蟾蜍坐骨神经-腓神经标本制备方法，掌握坐骨神经标本的制备方法。
2．引导蟾蜍坐骨神经动作电位，并观察其基本波形（包括双相和单相动作电位）。
3．学习和掌握神经干动作电位传导速度测定的原理和方法。
4．设计改变细胞外液的某些因素会对动作电位在神经干上传导的速度产生何种影响？
实验原理：
蛙类的一些基本生命活动和生理功能与恒温动物相似，若将蛙的神经-肌肉标本放在任氏液中，其兴奋性在几个小时内可保持不变。若给神经或肌肉一次适宜刺激，可在神经和肌肉上产生一个动作电位，肉眼可看到肌肉收缩和舒张一次，表明神经和肌肉产生了一次兴奋。在生理学实验中常利用
如果将两个引导电极置于正常完整的神经干表面，当神经干的一端兴奋之后，兴奋波会先后通过两个引导电极(r1r1’,图5坐骨神经干包括多种类型的神经纤维成分，因此记录到的动作电位是它们电位变化的总和，因此神经干动作电位是一种复合动作电位。由于各类神经纤维的兴奋阈值各不相同，所以记录到的动作电位幅值在一定范围内可随刺激强度的变化而改变，这一点不同于单根神经纤维的动作电位。
动作电位在神经纤维上的传导有一定的速度。不同类型的神经纤维动作电位传导速度各不相同。蛙类坐骨神经干中以Aα类纤维为主，传导速度(V)大约为35～40 m/s。测-腓肠肌标本的制备，但无需保留股骨和腓肠肌。坐骨神经干要求尽可能长些。在脊椎附近将神经主干结扎，剪断。提起线头剪去神经干的所有分支和结缔组织，到达腘窝后，可继续分离出腓神经或胫神经，在靠近趾部剪断神经。将制备好的神经标本浸泡在任氏液中数分钟，待其兴奋性稳定后开始实验。
3．仪器及标本的连结
（1）用浸有任氏液的棉球擦拭神经标本屏蔽盒上的电极，标本盒内放置一块湿润的滤纸片，以防标本干燥。用滤纸片吸去标本上过多的任氏液，将其平搭在屏蔽盒的刺激电极、接地电极和引导电极上，并且使其近中端置于刺激电极上，远中，频率8～16 Hz，波宽0.1～0.2 ms，强度根据标本兴奋性而定，由小增大(一般可选2V)。示波器灵敏度0.1～0.5 V/cm，扫描速度1～2 ms/cm。外触发输入接刺激器的触发输出端。触发选择置于外触发同步。开启电子刺激器时，调节触发电平旋钮，使示波器扫描与刺激输出同步。将扫描线调至荧光屏中间。
（3）若使用计算机生物信号采集处理系统进行实验则参照图5.5-2连接仪器。两对记录电极分别连接到CH1、CH2通道，刺激电极连接到刺激输出。打开计算机，启动生物信号采集处理系统，进入“神经干动作电位”模拟实验菜单。
4．观测和测定双相值时的阈刺激。
（2）增大刺激强度的过程中，伪迹和动作电位均随之加大，但当强度加大到某一程度后(此刺激强度称为最大刺激)，动作电位就不再增大，而伪迹仍随之加大。这是区别刺激伪迹与动作电位的可靠方法之一。
（3）仔细观察双相动作电位的波形(图5.5-3)。读出最大刺激时双相动作电位上下相的振幅和整个动作电位持续时间数值。
（4）将神经干标本放置的方向倒换后，双相动作电位的波形有无变化？
（5）将两根引导电极r1,r1’的位置调换，动作电位波形有和变化？
5．观察单相动作电位
用镊子将两个引导电极r1,r1’之间的神经夹伤，或用一小块浸有3 mol/L KCl溶液的滤纸片贴在第二个引导电极(r1’)处的神经干上，再刺激时呈现的即是单相动作电位。读出最大刺激时单相动作电位的振幅值和整个动作电位持续的时间数值。
6．动作电位传导速度的测定
换一根坐骨神经，按步骤3（1）搭放在神经屏蔽盒的电极上。进入“神经干动作电位传导速度”模拟实验菜单，或在显示方式菜单中选择“比较显示方式”（则可在一个通道内显示两个通道的图形）。给予神经干最大刺激强度，可在两个通道中（或示波器的上、下线）观察到先后形成的两个双向动作电位波形。
（1）分别测量从刺激伪迹到两个动作电位起始点的时间，设上线为t1，下线为t2(或可直接测量两个动作电位起点的间隔时间)，求出t2～t1的时间差值。
（2）测量标本屏蔽盒中两对引导电极相应的电极之间的距离d(即测定r1～r2的间距)。
（3）将神经干标本置于4℃的任氏液中浸泡5 min后，再测定神经冲动的传导速度。
（4）参照上步操作可自行设计改变细胞外液的某些因素，如分别将神经干标本置于25℃的任氏液、高钾和低钠任氏液中浸泡5 min后，再测定神经冲动的传导速度。
实验结果：
1．分别计算正常的神经干和低温浸泡后的神经干上动作电位传导速度
V＝d/(t2～t1)(m/s)。
2．对全部各组的实验结果加以统计，用平均值±标准差表示。
注意事项：
1．避免蟾蜍体表毒液和血液污染标本，压挤、损伤和用力牵拉标本，不可用金属器械触碰神经干。
2．在操作过程中，应给神经和肌肉滴加任氏液，防止表面干燥，以免影响标本的兴奋性。
3．制备标本时，神经纤维应尽可能长一些，将附着于神经干上的结缔组织膜及血管清除干净，但不能损伤神经干。标本制成后须放在任氏液中浸泡数分钟,使标本兴奋性稳定,再开始实验效果会较好。
4．各仪器应妥善接地，仪器之间、标本与电极之间应接触良好。
5．经常滴加任氏液，保持神经标本湿润，但要用滤纸片吸去神经干上过多的任氏液。神经干不能与标本盒壁相接触，也不要把神经干两端折迭放置在电极上，以免影响动作电位的波形。
6．测定动作电位传导速度时，两对引导电极间的距离应尽可能大。
思考题：
1．什么叫刺激伪迹，是怎样发生的？怎样鉴别刺激伪迹和神经干动作电位？
2．神经被夹伤或经KCl溶液处理后，动作电位的第二相为何消失?
3．神经干动作电位与刺激强度有何关系？它与神经动作电位的 “全或无”特性有矛盾吗？为什么?
4．引导电极调换位置后，动作电位波形有无变化?为什么?
5．为什么不用从刺激电极的阴极到第一个引导电极的距离除以t1直接计算神经动作电位传导速度?用一对引导电极能否测定神经动作电位传导速度?
6．根据你的结果可推断蛙的坐骨神经干中的神经纤维主要属于那种类型的？
7．将神经干标本置于4℃的任氏液中浸泡后，神经冲动的传导速度有何改变?为什么?
附：
1．刺激伪迹 逐渐增大刺激强度时，在屏幕的左侧基线上第一个波即为伪迹，其波形、幅度、宽度和位置可分别由刺激器的强度、延迟和渡宽调节钮控制。它的产生机制有二，一是通过刺激电极与记录电极之间的电容偶合进入放大器，二是通过细胞膜的电缆效应偶合进入放大器。伪迹可以做为刺激时刻的标志和刺激器、示波器功能状态的标志。但伪迹太大，会使动作电位发生畸变。
2．细胞膜的电缆学说 细胞外液和细胞内液均为含电解质的液体，可以看作为两个导体引起的膜电位改变时，发现：在电源附近电位上升快，达到的最高电位也较大；离开电源越远，则不但电位上升的慢，而且最终的最高电位也较低。电位改变变慢，是膜电容引起的后果；电位依距离变小，是膜外电阻、膜电阻及膜内电阻引起的后果。
3．双极记录法 本实验使用的记录方法为双极记录法，所记录到的电位变化，为两个电极之间的相对电位，并不代表电极下的真实电位，而是其代数和。另外，本法又是一种细胞外记录的方法，测得的电位也不代表细胞内的电位，只反映了膜外电位的改变。
4．刺激的极性法则 以直流电作用于神经时，在通电、断电时均可产生兴奋，而且通电时的兴奋发生在阴极，断电时的兴奋发生在阳极，这称为极性法则。在直流电通电过程中，阴极下神经组织的兴奋性升高，称为阴极电紧张。是通电时发生兴奋的原因；阳极下的兴奋性降低，称为阳极电紧张．断电后，阴极下的兴奋性降低，称为阴极后压抑；阳极下的兴奋性升高，称为阳极后加强，是断电时发生兴奋的原因，通常所说的刺激发生在阴极下，刺激时阴极下的外向电流，指的就是通电的情况而言的。
5．记录介质 通常所说双相动作电位的波形，其记录介质是空气或油。若神经干浸在细胞外液中，则记录到的波形为三相波。因此实验时，不可在神经干上滴过多的任氏液。
实验四：蛙类离体心脏灌流及药物影响（综合设计性实验）
实验目的：
1．学习离体蛙心灌流的实验方法，了解离体器官的研究方法。
2．观察内环境理化因素相对稳定对维持心脏正常节律性活动的重要作用，了解肾上腺素、乙酰胆碱等激素、神经递质对心脏活动的调节意义。
3．观察强心甙、中草药提取物和一些临床治疗药物对离体蛙心的直接作用。
实验原理：
心脏正常的节律性活动必须在适宜的理化环境中进行，一旦适宜的环境被破坏，例如酸碱度及离子浓度的急剧改变等，心脏的活动就会受到影响。
在整体内，心脏的活动受自主神经的双重支配，交感神经兴奋时，其末梢释放去甲肾上腺素，使心肌收缩力量增强，心率加快；而迷走神经兴奋时，其末梢释放乙酰胆碱，使心肌收缩力量减弱，心率减慢。
强心甙类药物能够增强心肌收缩能力，减慢心率。动植物提取物对心脏功能的影响与其内部所含物质的成份有关。
动物与器材：
蛙或蟾蜍,蛙心套管,套管夹,支架，双凹夹,滑轮,烧杯,常用手术器械,蛙板,蛙心夹,计算机采集系统,张力传感器,滴管,培养皿,污物缸,纱布,棉线,橡皮泥,任氏液,0.65% NaCl，1%CaCl2，1%KCl，3%乳酸，2.5%NaHCO，1:5000肾上腺,1;10000乙酰胆碱,300U/ml肝素，强心药物，中草药提取物等等。
方法与步骤：
1．取一只蛙或蟾蜍,双毁髓后背位于蜡盘中,仔细识别心脏周围的大血管。在左动脉下方穿一线,于动脉圆锥处结扎,再从左右两动脉下方穿一线,并打一活结备用。左手提起主动脉上时结扎线,右手用眼科剪再结扎线下方,沿向心方向将动脉上壁剪一斜口。取一带线的蛙心夹在心室收缩时夹住心尖。选择大小适宜的蛙心套管,然后将盛有少量任氏液的斯氏蛙心套管,由开口处插入动脉圆锥.当套管进到大动脉圆锥基部时,应将套管稍稍后退,提取蛙心夹连线并使蛙心套管尖端向动脉圆锥的背部后下方及心尖方向推进,经动脉瓣插入心室腔内。此时可见套管中血液冲入套管,并使液面随心脏的波动而上下移动,表明操作成功。用滴管吸去套管中的血液,更换新鲜任氏液。稳定套管后,轻轻提起备用线,将左右动脉连同插入的套管用双结扎紧(不得漏液),再将结线固定在套管的小玻璃钩上,然后剪断结扎线上方的血管。轻轻提起套管和心脏,看清静脉窦的位置,与静脉窦下方剪断有牵连的组织,仅保留静脉窦和心脏联系,使心脏离体。用任氏液反复冲洗心室内余血,使血管内灌流液不再有残留血液,保持套管内液面高度一致,进行实验。
2．将插好的离体心脏套管固定在支架上,用蛙心夹住少许的心尖部肌肉.再将蛙心尖上的系线绕过一个滑轮与张力传感器相连。注意:勿使灌流液滴到张力传感器上,调节显示器的心脏收缩的曲线幅度适中。
3．实验观察
描计一段正常心搏曲线，注意观察心跳频率和强度以及心脏的收缩、舒张程度。
4. 实验项目设计及结果观察
（1）温度对无机离子蛙心活动的影响
A、把蛙心套管内任氏液全部换为0.65%NaCl溶液，观察心跳变化。
B、把0.65%NaCl溶液吸出，换以任氏液，加入1%CaCl2溶液1～2滴，观察心跳变化。
C、把含1%CaCl21～2滴的溶液吸出，换以任氏液，加入1%KCl溶液1～2滴，观察心跳变化。
D、把含KCl的溶液吸出，换以任氏液，加入0.01%肾上腺素溶液2～3滴，观察心跳变化。
（2）递质和激素对蛙心活动的影响
A、把含肾上腺素的溶液吸出，换以任氏液，加入0.01%乙酰胆碱溶液1～2滴，观察心跳变化。
B、把含乙酰胆碱的溶液吸出，换以任氏液，加入3%乳酸溶液1～2滴，观察心跳变化。待心跳变化明显时，立即加入2.5%NaHCO3溶液1～2滴，观察心跳逐步恢复。
（3）心血管药物对蛙心活动的影响
制备如心得安、异丙肾上腺素和毒K等化合物制剂参照以上方法依次，观察实验结果。
（4）观察自己提取的植物制剂和人民常饮用的化合物对例题蛙心的活动影响
中草药：夹竹桃叶、蟾酥、蛙皮素、烟叶、茶叶等。
有机化合物：乙醇、甲醇等。
植物药有效成分提取方法：适量的植物组织（鲜组织用量多些）加入开水冲泡冷却后备用。
（5）设计实验观察的项目数量
每个实验组必须选取以上四类项目中10个可能的影响因子组合成实验项目进行实验。
5．整理记录,并将测量的心搏曲线数据填入表
注意事项：
1．当每种化学药物作用已明显时，须立即更换新鲜任氏液3次，待心跳恢复正常后再进行下一项实验。
2．在加化学药物与调换溶液时须及时在记录上做好符号，不要凭记忆而弄错。
3．吸任氏液的吸管和吸蛙心套管内溶液的吸管要分开，不可混淆，以免影响实验结果。
4．蛙心插管内液面应保持恒定高度。
5．保持记纹鼓转速均匀一致。
6．化学药物作用不明显时，可再加滴。
思考题：
1．本实验说明心肌的那些生理特征？
2．用实验说明内环境相对恒定的意义。
3．试分析任氏液中适量离子,钙离子,钾离子对心肌的影响。
4．为何强调实验保持灌流液面的恒定?灌流量对心脏活动的有什么影响？
5．试想,活的机体在心交感神经兴奋时或迷走神经兴奋时对心脏有何影响？
附：离子和药物对离体蛙心活动的影响的解释
1．K＋对心脏活动的影响：
总体看来心肌对细胞外K＋浓度变化比较敏感；但是不同部位心肌的敏感性有所不同，心房肌最敏感，房室束－浦肯野纤维系统次之，窦房结敏感性较低。
细胞外液钾浓度增高时，对兴奋性的影响与其浓度增高的程度有关。当K＋浓度轻度或者中度升高时，细胞内外K＋的浓度梯度减小，K＋外流的力量减弱,静息电位（RP）的绝对值减小,和阈电位(TP)差值减小,细胞的兴奋性增高；当K＋的浓度大幅度的升高，RP的绝对值减小（膜内－55mv左右）时，钠通道的开放效率降低，钠通道逐渐失活，兴奋性降低或者丧失，严重时，可导致心肌停搏于舒张状态。此时，仅由Ca2＋的内流来构成动作电位，故上升支小而缓慢，使兴奋传导速度减慢，传导性降低。
当细胞外K＋的浓度升高时，细胞膜对钾的通透性增高，心室肌细胞复极过程加速，平台期缩短，不应期也缩短。
高钾对心肌收缩功能有抑制作用。因为细胞外的K＋和Ca2＋在细胞膜上有竞争性抑制；因此当膜外K＋的浓度升高时，平台期内流的Ca2＋减少，心肌细胞内的Ca2＋浓度难于升高，减小了Ca2＋的兴奋－收缩偶联作用，从而减弱了心肌收缩能力。
4期自动除极速度减慢，导致窦房结自律性降低，心率减慢。
2．Ca2＋对心脏活动的影响：
细胞外Ca2＋在心肌细胞膜上对Na＋的内流有竞争性抑制作用，称为膜屏障作用。因此，细胞外Ca2＋浓度发生变化时，与Ca2＋内流和Na＋内流相关的生物电活动都将受到影响，而对静息电位则无明显作用。
当细胞外Ca2＋的浓度升高时，对Na＋的屏障作用加大，由于这种抑制作用，触发Na＋快速内流产生0期去极化就比较困难，即出现阈电位上移，从而与静息电位的差距加大，兴奋性降低；发生兴奋后，Na＋内流的抑制则导致0期去极化速度和幅度下降，传导性下降。
Ca2＋内流是慢反应细胞0期去极化和快反应细胞动作电位2期复极的主要离子活动。细胞外的高钙促使Ca2＋内流加快，慢反应细胞0期去极化加快加强，结果是其传导性增高。快反应细胞动作电位平台期将因Ca2＋的内流加速而缩短、复极加速、不应期和动作电位时程均缩短。
细胞膜Ca2＋对通透性升高，心室肌细胞平台期Ca2＋内流增加，心肌收缩力增强增快；当细胞外的Ca2＋浓度多高时，心脏就会停搏于收缩状态，称为钙僵直。
3．去甲肾上腺素对心脏活动的影响：
去甲肾上腺素与心肌细胞膜上的β肾上腺素能受体结合，从而激活腺苷酸环化酶，使细胞内cAMP的浓度升高，进而激活蛋白激酶和细胞内蛋白质的磷酸化过程，使心肌细胞膜上的钙通道激活，动作电位平台期Ca2＋的内流增加，肌浆网释放Ca2＋也增加，心肌收缩能力增强。另外去甲肾上腺素能加强4期的内向电流If，使心率加快。
4．乙酰胆碱对心脏活动的影响：
乙酰胆碱与心肌细胞膜上的M型的胆碱能受体结合，可使腺苷酸环化酶抑制，细胞内的cAMP浓度降低，肌浆网释放Ca2＋减少，心肌的收缩力量减弱。也可以能使传导速度减慢，心率降低。
5．0.65％NaCl对心脏活动的影响：
0.65％NaCl对蛙和蟾蜍来说是等渗的溶液，完全置换任氏液后，细胞外的Ca2＋浓度、K+浓度大大降低，使心肌的收缩能力减弱，心率减慢。
6．3％乳酸对心脏活动的影响：
乳酸的PH值较低，完全置换任氏液后，细胞外H＋的浓度大大升高，H＋和Ca2＋竞争性结合肌钙蛋白的结合位点，从而抑制Ca2＋与肌钙蛋白结合，使心肌收缩力量减弱。当再加入2.5％NaHCO3后，解除了H＋对Ca2＋的抑制作用，Ca2＋又可与肌钙蛋白结合，心肌的收缩力量增加。
7．哇巴因对心脏活动的影响：
哇巴因属于强心甙类的药物，可选择性的作用于心肌。
在体实验中给与治疗量的强心甙类药物，可引起正性肌力、负性频率。
①正性肌力：强心甙能与细胞膜Na＋-K＋-ATP酶结合而抑制此酶的作用，使细胞内的Na＋浓度升高而K＋的浓度降低，细胞内Na＋增多后再通过Na＋- Ca2＋双向交换机制，使Ca2＋内流增加，心肌的收缩力量加强。
②负性频率：强心甙使心肌的收缩力量加强，增敏颈动脉窦－主动脉弓压力感受器，反射性引起减压反射，结果是迷走神经传出的冲动增加，引起负性频率、负性传导。
离体实验中，给与中毒剂量的强心甙类的药物，可引起正性肌力、正性频率。
①正性肌力：机制同上。
②正性频率：由于离体实验中不存在迷走神经的作用，所以通过此途径引起负性频率是不可能的。主要是由于中毒量的强心甙严重抑制Na＋-K＋-ATP酶，使细胞内Na＋、Ca2＋大量增加，而K＋的浓度明显减少，导致自律性升高，传导减慢、甚至引起房室传导阻滞。