原核表达步骤
原核表达先要将基因克隆到原核表达载体上，然后通过转化到JM109或BL21等菌株中，诱导表达蛋白，然后进行蛋白纯化。本实验方案的前提是，目的基因已克隆到载体，并已转进入JM109菌株中。
一．鉴定目的蛋白是否在大肠杆菌JM109或BL21中大量表达
（一）制样
1 . 挑取经过双酶切鉴定的单克隆菌落于700ul LB培养基，加入0.7ul Amp（100mg/mL），37oC200r/min摇床培养，过夜活化。
2. 以1：50比例（200ul），将活化的过夜培养物加入10mL LB液体培养基中，加入10uLAmp（100mg/ml），37oC200r/min摇床扩大培养2h-3h，期间取样监控菌液的OD值，控制菌液OD600在0.6-1.0之间，以使大肠杆菌处于最适合表达外源蛋白的生长状态。(一般3h时，菌液浓度及达到标准，但是不同的基因对菌的影响不同，所以第一次实验时需要确定这个最佳时间)
3. 从10ml扩大培养物中取3ml菌液作为不加IPTG的空白对照（CK），其余7ml菌液加入7ul IPTG（储存浓度为0.5mol/l），使IPTG终浓度达到0.5mmol/l。以200r/min的转速，37oC摇床培养3h。
4. 以5000r/min离心2min收集菌体，倾倒上清，每个离心管收集3ml培养物。
5. 加入1ml dH2O，将管底沉淀用振荡器打散以充分洗涤，8000r/min离心2min，倾倒上清。
6. 重复步骤5。将离心管中的水倒干净。
（二）菌落SDS-PAGE
1. 在收集的菌体中加入200ul 1×SDS PAGE loading buffer(可根据沉淀的量增加或减少loading buffer的量，一般200ul比较合适)。用漩涡器剧烈震荡，确保将管底沉淀震散。
2. 将样品于100℃恒温加热器上开盖加热10min（Marker也要加热）。样品凉后，12000r/min离心3min，取每管的上清点样。上样量一般30ul—40ul，marker 20ul。
（三）SDS-PAGE分析
1. 根据目的片段的大小，制作不同浓度的分离胶
分离胶（两块）配方
按表中所列顺序从上到下加试剂，加完TEMED后，轻轻摇匀液体，一块胶加7ml溶液。加完后， 用1mLddH2O封住分离胶液面，在室温（37℃）凝结30min，至分离胶与水之间出现一条清亮的分界线，倾倒水层，用滤纸条将残余的水吸干。
2.制作浓缩胶
浓缩胶（两块）配方
胶配好后混匀，灌胶2ml，插梳子时根据点样量和浓缩胶长短调整梳子插入的深度，于室温(37℃)凝胶30min。
3.胶凝好后，拔梳子，将胶放入电泳槽中，加入1×Tris-Gly电泳缓冲液没过点样孔，胶外侧缓冲液界面应完全没过电极
4.Marker点5uL，用10uL小枪点样，以防样品冲出点样孔与旁边样品混杂。
电压打到70V，保证电流在20mA-30mA之间，当样品跑入浓缩胶时可适当调高电压，但不宜多次调整电压，否则条带会跑歪。
5.当溴酚蓝电泳至胶槽底部时,一般需要2.5h，停止电泳，剥胶，将浓缩胶部分切除后，加入考马斯亮蓝染色液，40r/min染色3h，可以过夜染色。
6.用移液器回收考马斯亮蓝染色液，再用蒸馏水将浮色冲洗干净后，倒入考马斯亮蓝脱色液，40r/min脱色至胶背景透明，期间可每2h更换一次脱色夜。
根据菌落SDS-PAGE的结果，可以看到目的蛋白是否大量表达。
二．鉴定目的蛋白形成的是包涵体还是可溶性蛋白
1. 从冻存的菌液中取10ul，接种于5ml的LB培养基中，加入5ul Amp(100 mg/ml),过夜活化菌株。
2. 按照1：50的比例，从活化的菌株中，取1ml菌液接种于50ml LB培养基中，加入50ul Amp(100 mg/ml)，扩大培养3 h。
3. 扩大培养后的菌液,取出10ml，不加IPTG，作为空白对照。剩余的40ml菌液中加入40ul IPTG（0.5mol/l）,诱导蛋白表达。两者在37℃，200rpm的条件下培养3h。
4. 用50ml 离心管收集菌体，8000rpm，离心3min。注意配平。
5. 倒掉上清，加入40ml左右的dH2O洗菌体一遍，12000 rpm，离心2min。注意要将菌体充分打散。
6. 倒掉上清，用枪头将上清吸干净。根据菌体的浓度，加入适量的PBS buffer 悬浮菌体。
7. 用大功率的超声波将菌体破碎，其间超声波每工作2min，停止1min。菌体要始终保持在冰水混合物上，以保证低温，蛋白不易变性。如此反复6-10遍，直至菌液清澈。
8. 12000rpm， 离心3min，分离上清和沉淀。
9. 在沉淀中加入250ul 1×SDS Loading buffer ,取200ul 上清，加入50 ul 5×SDS Loading buffer，在恒温加热器上100℃加热10min。
10.加热后的样品冷却到室温后，12000rpm，离心2min。
11.取上清40ul 点样，按照一中的方法进行SDS-PAGE检测。点样顺序是：对照的上清，沉淀，样品的上清，沉淀。
12.根据SDS-PAGE结果，判断目的蛋白是以包涵体还是以可溶性蛋白的形式产生。如果蛋白在沉淀中大量表达，则形成包涵体，需要改变诱导表达条件，比如将扩大培养与诱导培养的温度改为25℃，并延长相应培养时间。如果蛋白在上清中表达，则形成可溶性蛋白，可继续进行下一步实验。
三．纯化目的蛋白（整个过程要尽量保持在4℃进行）
1. 大量诱导目的蛋白（一般需要2-4 L的菌量），用超声波破碎细胞，收集上清。
2. GST纯化柱的柱床保存在20%的乙醇中，使用之前，先用吸管将柱床轻轻加入到柱子中，打开柱子，流出乙醇，使柱床沉积下来。
3. 加入10ml PBS buffer,洗柱床3遍，使得柱床重新平衡。
4. 将准备好的样品加入到柱子中，每次加入5-10ml样品，使样品结合在柱子上（每次上样量不能太多，因为柱子的结合能力有限）。
5. 用PBS buffer洗柱子3遍，每次用10ml，去除柱子中非特异性结合的杂蛋白。
6. 加入5ml洗脱液（10m mol/l的还原型谷胱甘肽，用50mmol/l tris-bufferr或者PBS buffer溶解）将目的蛋白洗脱出来。用1.5ml离心管收集流出来的样品，每管接0.5ml样，一共收集6-8管(一般情况，第一管流出的是PBS，第二和第三管大部分是目的蛋白，所以OD值很大，第三至第六管的OD值慢慢降低。不要偷懒一次接太多，不然会影响后续收集蛋白。还原型谷胱甘肽很容易被氧化，如果一次没有用完，请用保鲜膜封口置于4度冰箱保存，超过2天的话请更换新的洗脱液。)
7. 用PBS buffer洗柱子1遍。
8. 用分光光度计测每一管的OD值，记录下读数，将读数大于200的样品留下(一般是第2至第4管)，冻于-20℃冰箱中。
9. 重复步骤4-8，直至所有样品均纯化完毕。
10.可以用SDS-PAGE检测纯化出来的样品浓度以及纯度。
重生柱子的方法：（柱子使用三四次之后，需要重生，即让柱子上的GST结合基团重新暴露出来）
1．用还原型谷胱甘肽洗脱液洗柱子3遍，每次加入10ml。
2. 用 PBS缓冲液洗柱子4遍，每次加入10ml。
3. 用50 mmol Tris HCl（pH 8.0）洗柱子3遍，每次加入10ml。
4．用0.5M NaCl（pH 8.0）洗柱子3遍，每次加入10ml。
5. 用100 mM醋酸钠（pH 4.5）洗柱子3遍，每次加入10ml。
6. 用0.5M NaCL洗柱子3遍，每次加入10ml。
柱子长时间不用，需要按照以下方式清洗及保存：
1. 按照重生的1-6步骤先将柱子重生一遍。
2. PBS洗柱子2遍，每次加入10ml。
3. 将柱床用吸管吸出，分别用5%，10%，15%，20%的乙醇洗2遍。
4. 用单蒸水轻轻冲洗柱子底部的膜，洗出杂蛋白。
5. 柱床保存在含20%乙醇的PA瓶中。柱子和柱床置于4度冰箱保存。
如果柱子用于纯化不同的蛋白， 只需要按照重生方法的1，2步骤操作即可，然后直接纯化另外一个蛋白。如果柱子流速很慢，可能是柱子底部的膜被杂蛋白堵住了。柱子重生之后，将柱床用吸管吸出，然后用单蒸水将柱子底部的膜轻轻冲洗，再将柱床加入到柱子中，重新上样。
如果柱子需要重生，请用完柱子的同学自觉完成这份工作，以免影响下一位同学的使用。
四．根据不同的用途浓缩蛋白
1. 若蛋白用于制作抗体
如果洗脱液用的是tris-bufferr配制的，需要用1/4的PBS buffer进行透析，然后在冷冻干燥机中冻干浓缩，因为公司最终需要将目的蛋白溶于PBS buffer中。
如果洗脱液是用PBS buffer配制的，则直接在冷冻干燥机中冻干浓缩。
GST 纯化柱手册上建议的是用tris-bufferr配制洗脱液，但用PBS buffer配制的洗脱液可以将目的蛋白洗脱下来。可自己选用。
2. 若蛋白用于活性检测
由于蛋白在tris-bufferr和PBS buffer中，均能保持活性，所以不论用哪种，都不需要透析，直接浓缩干燥即可。
第二篇：原核表达总结
原核表达之目的基因克隆
1. 了解实验课题对目的蛋白的要求，包括：目的蛋白分子量有多大，表达目的（是蛋白结
晶、药剂结合还是制备抗体，不同目的对蛋白要求不同）；是否要其可溶；是胞内表达还是分泌表达，是组成型表达还是诱导型表达；另外，还要了解蛋白表达后需要采用什么样的方式进行纯化，纯化标签有多大，蛋白纯化后是否需要将标签去除（即标签的存在是否会影响蛋白的活性）。
还要对目的蛋白进行稀有密码子（仅限于真核生物基因通过原核表达系统表达时参考，注意稀有密码子的多少，位置5位或3位，稀有密码子是否成串出现等）和可溶性网上预测等。
稀有密码子预测网址： http://molbiol.edu.ru/eng/scripts/01_11.html
原核表达蛋白可溶性预测网址： http://www.biotech.ou.edu/
综合以上，选取合适的表达载体及宿主菌（做原核表达前对各种载体及宿主菌的充分了解是必须的，建议首先应阅读《默克原核表达宝典》）。
注意：不是所有的标签都是用来纯化蛋白的，有的标签有促进蛋白溶解的作用，有的则是二硫键形成或利于表达后蛋白的检测。
一般我们最常用的是胞内诱导型表达（即蛋白翻译后是存在于细胞内，通过加诱导物的方法来控制表达水平）。
2. 搜索要表达的目的基因的序列，根据其编码区序列来设计引物；
注意：要注意在引物上加入限制性内切酶识别位点（首先应分析蛋白编码区内是否含有相同的内切酶识别位点），并通过查阅资料看两种酶（上下游引物分别加入酶切位点）是否可以在同一反应体系中起作用，并注意标签序列是在N端还是在C端，若要在C端保留标签，则需要将下游引物的终止密码子替换掉；若要在引物上引入标签序列，则引物上应加入标签序列碱基（即在上游引物或下游引物处引入His的密码子）；另外，还要注意引物不能造成蛋白的编码框发生改变；
1，2步的分析至关重要，只有在完成前两步的工作后才可以进行后续的实验操作。
3. 摇菌，进行RNA抽提（注意选取不同表现型的菌株），摇菌的时间一定不要太长，太长
的话RNA活性不高；
4. mRNA反转成cDNA（此步应在第三步完成后立即操作，RNA存放时间长易降解）；
5. 以cDNA为模板，利于设计好的引物进行PCR扩增；
6. 通过胶回收试剂盒回收目的DNA片段。
蛋白质表达载体构建步骤08.4.20（08.11.10日修改）
微管蛋白的可溶性表达及纯化（08.11.4日修改）
1. 将重组质粒（BL21-2β2或Rossatta-2β2）的表达菌37℃摇培过夜后，1：20
扩配（约需1h15m）；
2. 至OD600=0.5~0.7时（约1h15min~1h45min），在15-（0.5-24，0.8-12）；20-
（0.5-12，0.8-8）；28、25-（0.8-8）进行蛋白诱导表达，具体条件根据摇床使用情况而定；
3. 对诱导后的菌液4℃，4000g，20min，彻底去上清；离心前取2ml以备用于
总蛋白电泳分析S1；
4. 细菌沉淀用BindingBuffer （无尿素，20mM咪唑）悬浮，100ml用5～10ml
缓冲液（约当2~5ml每克菌量），视悬浮后的菌液浓度而定；
5. 反复冻融法破碎细胞：做到14步时由于时间原因不能立即继续后面的操作，
可将菌悬液放于－70℃冰箱中冷冻；也可用反复冻融的方法来破碎细胞，在－70℃冻融，在室温下溶解，反复冻融3～4次；
6. 加Lysozyme至1mg/ml （1ml加10ul），在冰上孵育30min～1h；
7. 200~300W超声破碎，2s×30次，停顿2s；若菌种较多可以增加破碎次数。
注意超声破碎时间，不可太长，否则温度升高易导致蛋白变性；而时间太短则破碎不彻底，蛋白无法释放出来；
注意：第7步可选作，若经过冻融及溶菌酶处理后的菌悬液比较澄清，则可不用超声破碎。
8. 4℃，10000rpm 20~30min，取上清；将沉淀用变性的BindingBuffer （8M
尿素）悬浮，然后室温摇动30min，取40ul进行电泳样制备S2；
9. 4℃，10000rpm 10min，对上清再离心一次，取40ul进行电泳样制备S3；
10. 上清通过0.45um的细菌过滤器，取40ul进行电泳样制备S4；
11. 用HisTrap纯化：
a) 洗柱：用5倍柱床体积（5ml）纯水洗柱，避免产生气泡。
b) 平衡：至少5ml BindingBuffer （20mM咪唑），一般10ml，流速在
1ml/min。
c) 上样：流速要慢要，控制在1ml/min，并收集流出的蛋白液，取40ul进
行电泳样制备S5；
d) 重新上样：对第一次上样流出的蛋白液再进行过柱一次，取40ul进行电
泳样制备S6；
e) 平衡：用10ml BindingBuffer （20mM咪唑），收集第一管及最后一管，
各取40ul进行电泳样制备S7，S8。
f) 洗脱：用5ml ElutionBuffer （500mM咪唑）洗脱，每1ml一管，一般第
一二管中蛋白多。
g) 平衡：用5ml的BindingBuffer （20mM咪唑）平衡柱子；
h) 封闭：用20％的乙醇封闭柱子，4℃保存。
若需进行咪唑浓度优化，则纯化步骤改为：
10.4 梯度咪唑浓度洗脱：依次用20、30、40、50、75、100、150、200、300、400、500mM的咪唑进行洗脱，每个浓度各用4ml，收集第2、3V；电泳分析后确定最佳的咪唑平衡及洗脱浓度。
12. 样品处理：吸取纯化后的蛋白液40ul，加入10ul的5×的上样缓冲液，100℃水浴5min，12,000rpm离心3min后取上清点样，每个加样孔15ul。
13. 80V电泳2h左右，取出胶用染色液染色4～5h（回收的染色液可过夜），用脱色液脱色3次，观察拍照。
附：
1. 总蛋白电泳方法：700ul，12000g离心5min，弃上清，加入50μL 1×蛋白上样缓冲液，充分悬浮，煮沸5min，12000g离心5min；
2. 构建好的载体在进行蛋白诱导表达前，应选取10个左右的单克隆进行蛋白诱导的小量试验，对诱导后的总蛋白进行电泳分析，选取表达量最大的克隆保存（甘油菌，－70℃冰箱）；
3. 从－70℃冰箱中活化菌进行蛋白诱导表达试验时，活化好的表达菌在4℃冰箱仅可存放15天左右，最多1个月，过期后必须重新划线活化。4℃冰箱保存的宿主菌每次用过后必须用封口膜封好。
4. SDS-PAGE分析的蛋白样：总蛋白样S1，沉淀中的蛋白样S2，离心后上清中的蛋白样S3，过细菌过滤器后的蛋白样S4，第一次上柱时流出的蛋白样S5，第二次上柱时流出的蛋白样S6，20mM Bingding buffer过柱后的第一管S7和最后一管蛋白样S8。