某医院检验科

作业指导书

WORK  INSTRUCTOR

标题：β-地中海贫血基因检测标准操作规程

β-地中海贫血基因检测标准操作规程

1           原理                 

采用PCR体外扩增和DNA反向点杂交相结合的DNA芯片技术：。

2           器材

2.1       试剂

2.1.1    全血基因组提取试剂：深圳亚能全血DNA快速提取试剂盒（25人份/盒）。

有效期：1年。

2.1.2               亚能β-地中海贫血基因诊断试剂盒（25人份/盒）。

主要组成：

储存条件：试剂盒Ⅰ保存在﹣18℃以下；试剂盒Ⅱ保存在2～8℃。

有效期：6个月。

2.1.3               自备试剂：     

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地中海贫血筛查技术规范

一、主要设备要求

1.       血细胞分析仪：具有性能优良的血细胞分析仪，参加省级临检中心室间质评成绩合格；

2.       血红蛋白分析仪：有凝胶蛋白电泳或高效液相色谱仪。

二、人员要求：仪器操作者要具有相应资质的检验人员：开单、结果解释人员为具有相应资质的临床医生。

三、工作流程

1.       受筛人员由医生开单，做血液细胞学检查，MCV＜82f1 或MCH＜27pg者为初筛阳性。

2.       医生给初筛阳性人员开单，做血红蛋白电泳分析。

3.       医生向受筛查人员解释筛查结果的临床意义。

4.       出现不明确的结果时，由医生建议受筛人员到上级单位筛查或做基因诊断。

四、技术规范：

1.       仪器日常运行正常，维护保养到位，耗材要与仪器配套。

2.       特别提示：做血液细胞学分析，采用静脉采血时，血液与抗凝剂混合后，要静待10分钟以后分析；末梢采血分析时，血液与稀释液混合后，要待5分钟以后再检测；做血红蛋白电泳分析操作前，要把标本中的血浆充分洗脱。结果解释时，MCH受影响因素较少，比MCV更可靠。

3.       其他操作要严格按照相应的SOP进行。

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地中海贫血筛查告知书

_____________：

因您在本次检查中发现血常规检测红细胞平均体积（MCV） 平均红细胞血红蛋白量（MCH） （MCV、MCH）低于正常值，以及您先生

_____________检测（MCH） 代出生质量，请您夫妇双方务必从即日起到汕头市妇幼保健院进行血红蛋白电泳检测。

产科门诊就诊 一楼检验科检测。

注意事项：请带齐原有病历、血常规报告单、告知书。

汕头市妇幼保健院地址：汕头市中平街15号 电话：88539361

医院：________________________

医师：_________________________ 日期：_____________________ 二楼妇

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2010.3.14. 星期日，阴，雨

周五上午，接到体检科童主任的电话，希望我帮她评价几份体检报告，被体检者是几位应聘公务员的年轻人。刚好我要去门诊楼办事，就顺便去了体检科。

童主任已经在等我了。

“是关于地中海贫血诊断的问题，有3份体检报告地中海贫血基因阳性。”

听到这儿，我心里已经有底了。地中海贫血（以下简称地贫）是一种遗传病，广东又是地贫的高发区，医生们都高度警惕，检查可疑地贫这类事情常常见到，尤其常见于产科的产前检查和常规体检中。常有人忧心忡忡地来我这儿咨询，因为医生说他或他的亲人患有地中海贫血。由于这种疾病比较专业，因此许多非专科医生（甚至血液内科医生）都容易混淆。

地贫分为 ? 地贫和 ? 地贫两大类。确诊要通过地贫基因的检查。一般地贫患儿的父母亲均为地贫基因携带者，表现为正常健康人，无贫血。如果一方没有携带此基因，其后代最多也就是基因携带；但当双方都是基因携带者，则有四分之一的几率各自将自己的地贫基因传给子女，生出一个地贫患儿，当然也有四分之一的几率各自将自己“好的那一半”传给子女，生出一个完全健康的小宝宝，还有四分之二的几率，生出基因携带者。

? 地贫的贫血一般较重，多为重度或极重度贫血，婴儿或儿童期就已经可以诊断了，需要每个月输血一次，不会等到成年期（甚至体检时）才发现。? 地贫的重症一般都胎死母亲的宫内，能活下来的较 ? 地贫好一些，多为中度贫血，也不会等到体检时才发现（除非轻型，血红蛋白90～100g/L）。

我仔细翻阅了这3个年轻人体检的有关检查结果，基本没有贫血，因红细胞溶解度增高，而检测了地贫基因。其中2位的基因型是“??/??，41-42/N”，即?地贫基因阴性，?地贫基因携带；另一位是?地贫基因阴性，?地贫基因携带。这3位年轻人均应该是正常健康人，而不是地中海贫血患者。

我们常规体检，一般只检测红细胞溶解度，而不会检测地贫基因，因为基因检查费用太高。当红细胞溶解度增高时，可酌情检查地贫基因。为什么说“酌情”呢？主要是看你的体检目的：如果你没有贫血（血红蛋白正常），主要是招工体检，不必检查基因；但如果你是婚前体检，或是准备要个小宝贝前的体检，而且籍贯又是地贫高发地区，最好查查地贫基因。

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案例一

一位25岁的广西籍孕妇在其12周孕期时到医院妇产科进行首次产前检查，这是她的首 次怀孕，她非常关注她怀的小孩患家族其他成员出现的一种遗传性血液病的风险。孕妇主诉 轻度贫血史，但是没有向她哥哥那样严重，其哥哥患有严重的贫血，需要经常输血，10岁去 世。该孕妇以往被诊断为贫血，但没有任何贫血的症状。体格检查符合12周妊娠，超声波检 查确诊为12周宫内妊娠，血液检查显示为小细胞低色素贫血（血红蛋白（HB）浓度为90g/L）, 血红蛋白电泳分析显示血红蛋白A2（HbA2）含量增高（4.0%），胎儿血红蛋白量也增高，符 合轻型β-地中海的表现。为了检查胎儿是否患有地中海贫血，孕妇进行了绒毛膜穿刺检查， 几个小时后得到诊断结果。

诊断：β-地中海贫血 CD41-42(-CTTT)缺失突变

轻度贫血

可无或有容易疲倦与头昏；中度贫血，活动或劳动后出现面色苍白、眼花、心慌和气促；重度贫血，即使在休息或卧床时也有明显的症状。其最常见的原因是缺铁性贫血，缺铁导致小细胞性贫血。

严重贫血

贫血的严重程度分类：

血红蛋白浓度 <30g/L 30～>59g/L 60～>90g/L >90g/L 贫血严重程度 极重度 重度 中度 轻度

分级 血红蛋白（g/L） 临床表现

轻度 120～91(12～9.1g/dl) 症状轻微

中度 90～61(9～6.1g/dl) 体力劳动后感到心慌、气短

重度 60～31(6～3.1g/dl) 卧床休息时也感心慌、气短

极度 <30(3.0以下g/dl) 常合并贫血性心脏病

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摘要 地中海贫血（Thalassemia），又称海洋性贫血，简称地贫，是一种先天的血液疾病，和父母的遗传有关。19xx年意大利首次报道了此病，目前该病已在全世界范围散布[1]。 患者的红血球较脆弱且容易死亡，其带氧能力亦不足，超过某种程度无法正常生活；在结婚以前健康检查可以筛选出来，是一种隐性基因遗传，患者红血球的体积较正常细胞小，且有时因血红素含量低较苍白或呈靶型（target cells)。

关键词 地中海贫血α地中海贫血β地中海贫血 症状 基因治疗 预防

引言 地中海贫血是我国南方各省影响最大发病率最高的遗传性疾病之一，其主要发病机制是由于人体基因突变或缺失导致与珠蛋白肽链合成速率的不平衡，从而引起的溶血性贫血目前，该病尚无理想的治疗方法，降低其发生率的有效方法是预防和监控预防和监控的关键是对婚孕人群进行地贫筛查，并进行基因诊断防止重症地贫胎儿出生。。

地域分布

地中海贫血(thalassemia,地贫)主要发生于热带地区, 该病高发于地中海沿岸。在我国则多见于广东、广西、海南、香港、福建、云南、贵州、四川等地区。据WHO报告，约有一亿以上的人携带地贫突变基因。

类型： 地中海贫血按照受累的氨基酸链来分类，组成珠蛋白的肽链有4种，即α、β、γ、δ链，分别由其相应的基因编码，这些基因的缺失或点突变可造成各种肽链的合成障碍，致使血红蛋白的组分改变。通常将地中海贫血分为α、β、δβ和δ等4种类型，其中以α和β地中海贫血较为常见。也可按照一个或两个基因缺损来分为轻型或重型地中海贫血。

α地中海贫血

α地中海贫血的患者会在HBA1、HBA2这两个基因发生异常。在成人造成β蛋白链过度制造，在新生儿则是γ蛋白链过多。过多的β蛋白链形成四聚物(tetramers)使红血球的携氧能力降低。

β地中海贫血

β地中海贫血的患者则是在上的HBB基因发生突变。不正常的细胞会制造过量的α蛋白链，然后结合在红血球的细胞膜上造成细胞膜损坏；若其浓度过高，则有形成有毒聚集体(aggregates)的可能。

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关于地中海贫血的诊断标准

地中海贫血的诊断主要依据临床表现、血液学改变、遗传学检查和分子生物学分析四个方面来确定，由于基因调控水平的差异，相同基因突变类型的患者不一定有相同的临床表现；临床血液学改变，除了血液学常规检查外，血红蛋白电泳检查是诊断本病的必备条件，但输血治疗后的血液学检查结果与实际结果有明显的不同；遗传学检查可确定为纯合子、杂合子以及双重杂合子等，相同基因型患者父母基因型组合不尽相同；分子生物学分析可采用聚合酶链式反应（PCR）技术、等位基因特异的寡核苷酸探针斑点杂交(ASO)和近年来日趋成熟的有重大影响的基因芯片技术等方法进行基因突变类型的分析。 关于重型与中间型β地中海贫血血红蛋白量的界限，国内外资料多以低于60g/L为重型。国内外血液学专著中都强调重型β地中海贫血患者需依赖定期输血和应用铁螯合剂治疗才能维持生命，而中间型患者可不依赖定期输血长期生存，但如文献所述，确定血红蛋白在60-70g/L间的中间型患者是否需要输血是很困难的，只能根椐具体情况而定。学者提到部分中间型偏重的患者若不定期输血，在进入青少年时期以后，血红蛋白将逐渐下降，出现肝脾肿大、心脏增大和地贫面容等表现，并需依赖定期输血，认为这些患者应重新诊断为重型β地中海贫血，进行定期输血和铁螯合剂治疗，我们在临床实践中有相同的体会。

重型β地中海贫血、中间型α和β地中海贫血经足量输血和铁螯合剂维持治疗不会出现肝脾肿大和颧骨隆起、眼距增宽、鼻梁低平等骨骼改变。中间型α和β地中海贫血Hb一般在60g/L以上，因感冒发热和药物等原因导致溶血时可有一段时间在60g/L以下。

地中海贫血中除了少部分静止型α地中海贫血基因携带者外红细胞均为小细胞低色素，主要表现为MCV、MCH和红细胞脆性降低，国内文献使用的MCV和MCH截断值差异较大，而国际上使用较广泛的是MCV<79fl和MCH<27pg。HbA2是诊断轻型β地中海贫血和基因携带者的关键，国内常用碱性电泳法检测，国外通常用高效液相色谱法检测，两种方法HbA2截断值有所不同。

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