高等生物基因表达的变化是调控细胞生命活 动的核心机制，正是由于基因的差异表达才决定 了生物体的所有生命过程。因此，研究不同类型细 胞或同一类细胞在不同发育时期或不同发育状态 下基因表达的变化，已成为当今生物学的研究热 列无关的管家基因，如Ｂ一肌动蛋白（ｐ—ａｃｔｉｎ）和 甘油一３一磷酸脱氢酶（ＧＡＰＤＨ）等，因为这些基因 的转录比较稳定，含量相对丰富。将ＲＮＡ逆转录 为ｃＤＮＡ后，使靶基因和“管家基因”在同管或异 管中一起扩增，在对扩增产物进行分析时，首先根据各样本间“管家基因”扩增条带密度是否一致， 粗略地判断各样本抽提的效率、质量和扩增效率 是否一致，然后以“管家基因”扩增产物条带的密 度作为标准，计算出靶基因扩增条带密度与其之 点之－－〔１１。半定量逆转录多聚合酶链式反应（ＲＴ— ＰＣＲ，Ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎｒｅａｅ－ ｔｉｏｎ）技术是近年来发展起来的探讨基因转录水平 的有效手段ｆ２】。与传统的Ｎｏｒｔｈｅｒｎ ｂｌｏｔ法比较，它具有灵敏、简捷、特异性高等优点，因此在检测基 因的表达水平上得到了广泛的应用。 比值，并通过观察各样本扩增产物的比值，得出靶基因的表达量的相对变化【３】。 １原理 ２反应参数 半定量ＲＴ—ＰＣＲ技术的核心即ＰＣＲ，是２０世 纪８０年代末出现的一种相对定量的技术。当人们 ２．１ ＲＮＡ的质量 在运用半定量ＲＴ—ＰＣＲ方法检测特异基因表 达量的差异时，总ＲＮＡ的质量至关重要，只有在 总ＲＮＡ未被降解的情况下，才能保证其中ｍＲＮＡ 的完整性，从而真实反映起始模板中基因表达量 的差异１４Ｊ。因此，每个ＲＮＡ样品须检查其完整性 和纯度，可以通过琼脂糖或甲醛变性电泳分析证 明总ＲＮＡ的完整性，一般在电泳图上会出现两条 欲利用该技术研究并揭示某一基因的表达产物量的改变时，利用相同量的ＲＮＡ进行反转录后，再 ＰＣＲ扩增，然后将扩增产物进行电泳判断量的差 异。为避免样本间模板质量和扩增效率的差异而 导致最终结果的差异，在ＰＣＲ反应体系中引人了 内对照系统。在一般情况下大多选用与靶基因序 收稿日期：２００７—０３—２７修订１３期：２００７—１２—１０ 作者简介：金凤媚（１９７７一），女，天津人。助理研究员，主要从事番茄分子育种研究。 万 方数据 第１期 金凤媚等：半定量ＲＴ—ＰＣＲ技术的研究及应用 带２８Ｓ和１８Ｓ，且２８Ｓ的亮度应是１８Ｓ的两倍【５】。 半定量ＲＴ—ＰＣＲ检测体系必须防止混在ＲＮＡ中 的基因组ＤＮＡ带来的假阳性，所以在抽提后一定 要用ＤＮＡ酶消解残存在样品中的ＤＮＡ。 ２．２逆转录（ＲＴ） 逆转录酶ＡＭＶ或Ｍ—ＭＬＶ能有效地逆转录 ＲＮＡ，合成模板ｃＤＮＡ，加Ｒｎａｓｉｎ（ＲＮＡ酶抑制 剂），可获得最高产量。实验证明，ｃＤＮＡ合成后残 留的完整ｍＲＮＡ模板干扰ＲＴ—ＰＣＲ，因为它与 ｃＤＮＡ竞争作为ＰＣＲ模板【６１，而ＡＭＶ和Ｍ—ＭＬＶ 反转录酶的内在ＲＮａｓｅＨ活性足以降解残存的大 多数ｍＲＮＡ模板。但使用缺乏ＲｎａｓｅＨ活性的反 转录酶时，则必须用ＲｎａｓｅＨ处理ｃＤＮＡ。 在逆转录过程中另一个需要考虑的情况是低 拷贝ＲＮＡ的反转录效率要低于高拷贝ＲＮＡ，尤 其是在反转录过程中存在大量非特异和背景 ＲＮＡ时，这种情况更为明显，因此反转录过程中 基因表达的实际情况…。２．４ Ｍ矛＋浓度对扩增效率的影响 Ｍ９２＋是影响Ｔａｑ酶扩增效率的重要因素，浓 度范围在０．５～５ ｍｍｏｌ／Ｌ，但扩增效率视序列而定。 徐春兰等【１３】的研究表明Ｍｇ：＋对细胞谷胱甘肽过氧 化物酶基因扩增的影响较大，浓度在０．５～１ｍｍｏｌ／ Ｌ时，扩增效率不理想，条带较淡，进一步应用分 析软件对电泳条带ＩＯＤ值进行分析时发现，在１．５ ｍｍｏｌ／Ｌ时扩增效率及特异性良好。而对于小 麦硫蛋白基因的检测结果，能同时稳定扩增目的 基因和内参的Ｍ９２＋浓度分别为１．７ ｍｍｏｌ／Ｌ和１．９ｍｍｏｌ／Ｌｔ叭ｏ ２．５引物的影响 ２．５．１引物问的竞争利用ＲＴ—ＰＣＲ技术对ｍＲＮＡ 进行检测时一般要在同一管中对内参照和目的基 因进行扩增。要在同一管中有效扩增出内参照和 目的基因产物，并在凝胶电泳上清晰显现，同时消 除引物对间可能的竞争，在设计引物时，除满足引 物设计的基本要求外，还应考虑
引物扩增的预期 退火温度，特异基因和内参照引物的预期退火温 度尽量相符；引物序列进行比对时，二者应无同源 性；产物长度应有一定差异，以免电泳时重叠。如 果目的基因与内参基因的扩增动态曲线表明，二 者处于线性期的循环次数相差过大，却直接同管 扩增，则两者的产物量受到竞争，扩增效率降低， 这时可选用同批异管扩增，并在不同循环次数下 分别取出二产物【９】。 ２．５．２引物的设计在选择ＰＣＲ引物时，尽量使上 游和下游引物跨越不同外显子，这样能把从ｃＤ— ＮＡ得到的扩增产物和从任何污染的包含内含子 序列的基因组ＤＮＡ得到的产物区分开（图１）。最 佳的序列引物是完全精确与ｃＤＮＡ模板互补，在 ｃＤＮＡ序列中，定位模板引物的重要理由是：（１）它 确定ＰＣＲ产物长度，应选择扩增４００—２０００ 的线性问题应该认真考虑。解决该问题的方法是每个ＰＣＲ反应进行重复，看每次重复的变化程 度，如果每次重复的结果变化很大，说明可能发生了不稳定随机现象【７１。 ２．３模板量和反应循环数 设计相对定量ＰＣＲ实验方案时必须注意预 先确定最佳模板量和ＰＣＲ反应的循环数。ＰＣＲ扩 增反应是酶促反应，遵循酶促反应定律，开始的 循环内扩增产物呈指数累积，产物与模板呈线性 关系。半定量ＲＴ—ＰＣＲ技术【８】正是利用产物与模 板量的这一线性关系，通过扩增产物来对比总 ＲＮＡ中目的基因的表达。但经过一定的循环后， ＰＣＲ产物不再呈指数累积而进入平台期，因此， 为避免平台效应的影响，合适的循环数是ＰＣＲ半定量方法的关键因素之一。循环次数因扩增目的 条带不同而不同，陈昕等【９Ｊ在建立小麦硫蛋白基 因半定量ＲＴ—ＰＣＲ检测方法时，目的基因和内参 的循环次数分别为３０和２４次。石艳丽等人【Ｊ０１在 用此方法测定链球菌透明质酸合酶ｍＲＮＡ的水 平时，实验结果目的基因和内参的循环次数分别 为３０和３５次。卢建雄等…ｌ在检测生脂基因时则 均确定为２８次。Ｋｉｍ【１２】在研究垂体瘤细胞时循环 次数为２６次。 在逆转录之前，总ＲＮＡ的定量也是实验的关 ｂｐ产 物的模板引物位点，因为小于４００ ｂｐ的扩增产 物，需要高分辨率的特殊琼脂糖凝胶区分，并且引 物和引物假象可导致模糊不清；大于２０００ ｂｐ的 产物，受酶作用性能的限制，难以有效扩增，如 ＴａｑＤＮＡ聚合酶，延伸长链则完全无效，而且易于 脱离模板【１４】。此外，引物序列与其它转录基因完全 同源时，会产生更多的伪假ＰＣＲ产物。计算机软 件程序和实践经验很便利于引物设计【ｂ】，但也必 须多次试验，才能确定最适引物。 键步骤，用等量的ＲＮＡ作为起始模板，从而保证随后的ＰＣＲ扩增条带亮度的差异，能够真实反映 万 方数据 天津农业科学 第１４卷 中的表达量的差异，结果表明茎和根的表达要高 ——１一■●————口口ｐＤ——一由一ＰｃＲ—ｎ 厂—————〕 ｃＤＮＡ产物一一ＺＩＤ一■卜—口口基因组ＤＮＡ产物 于叶片组织，这使人们能有目的的以烟草为生物反应器为人类服务。张鸿来等〔２２１用半定量ＰＣＲ方 法检测乳腺癌细胞６７一ＫＤＬＮ—Ｒ ｍＲＮＡ的应用获 日２．６其它因素的影响 ★电池 得成功，其简便、快速的特点更适合于临床应用。综上所述，我们可以看出半定量ＲＴ—ＰＣＲ是 一种粗略地估计基因表达的相对变化的方法，若 要精确地计算基因的表达量还需利用实时荧光 ＰＣＲ等技术，但多数研究的焦点并不是检测转录 水平微小的变化或确切的分子数目，而是检测其 表达水平变化是否显著。所以，半定量分析ｍＲＮＡ 水平的方法在各个研究领域都有着非常广泛的应 图ｌ区别内含子的ＲＴ—ＰＣＲ 除了对上述所提到的几种关键因素进行选择外，还要相应的调整ｄＮＴＰ、Ｔａｑ酶浓度等其它的 一些参数来提高反应的特异性及灵敏度，最大限 度的提高方法本身的可靠性。 ＲＴ—ＰＣＲ技术的应用 用，随着该技术的日趋成熟和完善，它将成为研究者的强有力的研究手段。 ３ 参考文献： ３．１对动物和植物基因表达变化的分析 在动植物表达分析中，常常用到的是实时定 量ＰＣＲ、Ｎｏｒｔｈｅｒｎ ｂｌｏｔ、基因芯片等半定量技术，但 这些方法费时费力，且需要特殊的仪器，而半定量 ＲＴ—ＰＣＲ技术操作相对简便，近年来被广泛地应 用于此类研究中〔１６－ｔ９Ｊ。 陈昕等（２００６）在研究小麦硫转运蛋白基因 的表达时建立了半
定量ＲＴ—ＰＣＲ方法。徐春兰和 汪以真（２００５）用半定量ＲＴ—ＰＣＲ法评定了不同生 长阶段猪抗菌肽ｐ卜３９基因表达差异，结果显示， 不同生长阶段猪ｐ卜３９基因表达有差异，从出生 到断奶前｜ｐ，．一３９表达量呈增加趋势，断奶时表达 【１】刘中成，赵锦，刘孟军．ｍＲＮＡ差异显示技术评述【Ｊ】．分子植物 育种，２００４，２（６）：８９５—９００． 【２】Ｃｏｔｔｒｅｚ Ｆ，Ａｕｒｉａｕｈ Ｃ，Ａｐｒｏｎ Ａ，ｅｔ ａ１．Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ＰＣＲ：ｖａｌｉｄａｔｉｏｎｏｆ ｔｈｅ ｕ眈ｏｆ ｍｕｌｔｉｓｐｅｃｉｆｉｃ ｉｎｔｅｒｎａｌ ｃｏｎｔｒｏｌ【Ｊ】．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａ ｃｉｄａ Ｒｅｓ， １９９４，２２（１）：２７１２－２７１３． 【３】Ｗａｎｇ Ａ Ｍ，Ｄｏｙｌｅ Ｍ Ｖ，Ｍａｒｋ Ｄ Ｆ．Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ ｏｆｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎｍＲＮＡ ｂｙ ｔｈｅ ｒｅａｃｔｉｏｎ〔Ｊ〕．Ｌｅｕｋｅｍｉａ，２０００，１４（２）：３１６—３２３． 〔４Ｊ林仁勇．丁剑冰，温浩，等．半定量ＲＴ—ＰＣＲ检测细胞因子表达 的研究…．新握医科大学学报，２００３，２６（５）：４２７—４２９． 【５】谷守芹．解灵君，范永山．植物组织总ＲＮＡ提取的常用方法及 优化策略〔Ｊ】．保定师范专科学校学报，２００５，１８（２）：４０—４３． 【６】Ｗｉｎｓｌｏｗ Ｓ Ｇ，Ｈｅｎｋａｒｔ Ｐ Ａ．Ｐｏｌｙｉｎｏｓｉｎｌｅ ａｃｉｄ粕ａ ｃａｒｒｉｅｒ ｉｎ ｔｈｅｍｉｃｒｏｓｃａｌｅ ｐｕｒｉｆｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｏｔａｌ ３２５ｌ一３２５３． ＲＮＡｔＪ〕．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ，１９９１，１９： 量下降，断奶后随日龄增加ｐｒ一３９表达量再逐渐增加。因此，在断奶期通过添加某些养分，促进 ＿ｐ卜了９基因的表达，对于提高仔猪的抗病能力具 有重要意义。石艳丽等用半定量ＲＴ—ＰＣＲ法测定 链球菌透明质酸合酶ｍＲＮＡ的水平，这对于深入 探讨透明质酸发酵有重要意义。 ３．２在医学上的应用 半定量ＲＴ—ＰＣＲ技术自建立以来，在医学领 〔７】Ｂｕｓｔｉｎ Ｓ Ａ，Ｎｏｌａｎ Ｔ．Ｐｉｔｆａｌｌｓ ｏｆ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｒｅａｌ—ｔｉｍｅ／＿：ｅｖｅｌ”ｓｅｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ【Ｊ】．Ｊ Ｂｉｏｍｏｌ Ｔｅｅｈ，２００４，１５ （３）：１５５－１６６． 【８】Ｍａｙ Ｊ，Ｃｏｓｔａ Ｍ，Ｏｊｅｄａ Ｓ Ｒ．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌｇｅｎｅｓ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｉｔｓ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｏｆｉｎ ｔｈｅ ｔｈｅ ｅｎｃｏｄｉｎｇ ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ａｌｐｈａ ａｎｄ ｂｙ ｐｏｔｈａｌａｍｕｓ ｏｆ ｆｅｍａｌｅ ｒｈｅｓｕｓ ｍａｃａｑｕｅｓ〔Ｊ〕．Ｎｅｕｒｏｅｎｄｏｃｒｉｎｏ．１９９４，６０ （１）：３４６． 【９】陈昕，王保莉，曲东，等．小麦硫转运蛋白基因半定量ＲＴ—ＰＣＲ 检测方法的建立【Ｊ】．西北植物学报。２００６，２６（２）：０３０９—０３１３． 【ｌＯ】石艳丽，郭学平．王凤山，等．半定量ＲＴ—ＰＣＲ法测定链球菌 透明质酸合成酶ｍＲＮＡ的水平【Ｊ】食品与药品，２００５，７（２）：２２— ? 域得到了广泛的应用与发展。周林福等四对荧光定量ＰＣＲ与半定量ＰＣＲ检测ＨＢＶ ＤＮＡ做了对 比分析，结果证明，临床基因检测实验室可用半定 ２４． 【１１１卢建雄．臧荣鑫，潘和平．半定量ＲＴ—ＰＣＲ法检测原代培养脂 肪细胞生脂基因ｍＲＮＡ转录表达【Ｊ】．中兽医医药杂志，２００５， （６）：１６—１８． 【１２】Ｋｉｍ Ｓ Ｗ，Ｈａｒｎｅｙ Ｊ Ｗ，Ｌ丑ｒｓｅｎ Ｐ Ｒ．Ｓｔｕｄｉｅｓ ｏｆ ｔｈｅ ｈｏｒｍｏｎａｌｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ａｃｉｄｉｎ ｔｙｐｅ ｒｅｇ－ 量ＰＣＲ法替代荧光定量ＰＣＲ法检测血清ＨＢＶＤＮＡ的载量，这为临床基因检测实验室提供了方 法学选择依据。Ｇａｏ等【２ｌ唰用该方法确定了人类重组的骨格形成素基因ＢＭ Ｐ一２在烟草不同组织 ２５－ｉｏｄｏｔｈｙｒｏｎｉｎｅ ｄｅｉｏｄｉｎａｓｅｃｅｌｌｓ ｍｅｓｓｅｎｇｅｒ ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｉｃｔｒａｎｓｃｒｉｐ— ｐｉｔｕｉｔａｒｙ ｔｕｍｏｒ ｕｓｉｎｇ ｓｅｍｉｑｕａｎｔｉｔａｆｉｖｅ ｒｅｖｅｌｍ 万 方数据 第１期 金凤媚等：半定量Ｒ
Ｔ—ＰＣＲ技术的研究及应用 ｔｉｏｎ－ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ４８９５—４９０５． ｒｅａｃｔｉｏｎ【Ｊ】．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ，１９９８，１２９（１２）： （１）：６９—７８． 【１８】Ｋｕｄｄｕｓ Ｒ Ｈ，Ｌｅｅ Ｔ Ｈ，Ｖａｌｄｉｖｅａ Ｌ Ａ．Ａ ｓｅｍｉ－ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ＰＣＲｔｅｃｈｎｉｑｕｅ ｆｏｒ ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ ｅｈｉｍｅｒｉｓｍｉｎ 【１３】徐春兰，汪以真．半定量ＲＴ—ＰＣＲ法分析猪肌肉组织细胞谷 胱甘肽过氧化物酶ｍＲＮＡ表达水平【Ｊ】．中国兽药杂志，２００５，３９ （８）：３－６：２３． 【１４】蔡马．研究基因转录的ＲＴ—ＰＣＲ技术【Ｊ】．生物学杂志． ２００２，１９（６）：３１—３４． 【１５】Ｐａｌｌａｎｓｃｈ Ｌ，Ｂｅｓｗｉｃｋ Ｈ，Ｔａｌｉａｎ Ｊ，ｅｔ ａ１．Ｕｓｅ ｏｆ∞ＲＮＡ ｆｏｌｄｉｎｇａｌｇｏｒｉｔｈｍｔｏ ｈａｍｓｔｅｒ－ｔｏ—Ｅ吡ｂｏｎｅ ｍａｌＴｏｗ ｘｅｎｏｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ〔Ｊ〕．Ｊ ｌｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ，２００４．２８５（１）：２４５－２５１． 【１９】ＦｅｌｌｅｎｒＭ Ｄ，Ｄｕｒａｎｄ Ｋ，Ｃｏｒｒｅａ Ｍ．Ａ ｓｅｍｉ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ＰＣＲａｐ－ ｍｅｔｈｏｄ（ＳＱ－ＰＣＲ）ｔｏ ｎｌｅａｓｕｒｅ Ｅｐｓｔｅｉｎ－Ｂａｒｒ ｖｉｒｕｓ（ＥＢＶ）ｌｏａｄ：ｉｔｓｐｌｉｅａｔｉｏｎ ６３４，６３６．ｉｎ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ ｐａｔｉｅｎｔｓ【Ｊ】Ｂｉｏｔｅｅｈｎｉｑｕｅｓ，１９９７，２２（１）：６３０— ｃｈｏｏｓｅ ｌｅｇｉｏｎｓ ｆｏｒ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｂｙ ｔｈｅ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ 【２０】周林福，陈离伟，姜云水，等．荧光定量ＰＣＲ与半定量ＰＣＲ检 测ＨＢＶ ＤＮＡ的对比分析【Ｊ１．中国病理生理杂志，２００５，２１（５）：８３７—８４８． ｒｅａｃｔｉｏｎ〔Ｊ〕．Ａｎａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９９０，１８５（１）：５７－６２． 【１６１ Ｍａｔｈｉａｓ Ｃ．Ｍａｒｔｉｎｅ Ｂ。Ａｎｎｅ Ｖ Ｃ．Ａ ｓｅｍｉ—ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ＲＴ－ＰＣＲｍｅｔｈｏｄｔｏ ｒｅａｄｉｌｙ ｃｏｍｐａｒｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｌｅｖｅｌｓ ｗｉｔｈｉｎ Ｂｏｔｒｙｔｉｓ ｅｉｎｅｒｅａ 【２ｌ】Ｇａａ Ｙｕａｎ．Ｓｕｏ Ｇｕａｎｇｌｉ，Ｈａｎ Ｊｉｎ．Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ＢＭＰ－２Ｇｅｎｅｉｎ ｍｕｌｔｉｇｅｎｉｅ ｆａｍｉｌｉｅｓ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ３０３—３０９． ａｎｄ ｐｌａｎｔａ【Ｊ〕．Ｃｕｒｔ Ｇｅｎｅｔ，２００３，４３（１）： ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｔｉｓｓｕｅｓ ｏｆ ｔｏｂａｃｃｏ ｐｌａｎｔｓ【Ｊ１．Ａｃｔａ Ｇｅｎｅｔｉｅａ Ｓｉｎｉｃａ， ２００６，３３（１）：５６－６２．ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ 【１７１ Ｒｏｌｌａｎｄ Ｖ Ｇ．ＳｅｌＩｌｉ－ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆｃｕｌｔｕｒｅｄ 【２２】张鸿平，吴秉铨，张卫国，等．半定量ＰＣＲ方法的建立及其在 病理学中应用【Ｊ】．中华病理学杂志，１９９４，２３（５）：３１２—３１３． ｃｈ∞ｄｒｏｃｙｔｅｓ ｂｙ ＲＴ－ＰＣＲ【Ｊ】．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｍｅｄ，２００４，１００ 《天津农业科学》稿约《天津农业科学》是天津市农业科学院信息研究所主办的综合性学术期刊。主要报道农林、植保、土壤肥料、园艺、畜牧兽医、农产品贮藏加工、水产、花卉、生物技术等方面的基础理论、试 验报告、实用技术和专题综述类文章及农业区划、科研管理等软科学论文。适合各级农业科技 人员、农技推广人员、农业行政管理干部、农业大中专院校师生参阅。来稿注意事项 （１）文稿应为作者创作，并为首发稿。作者享有文稿的著作权，文责由作者自负。来稿请提 供作者真实姓名及联系地址、邮编、电话号码和Ｅ—ｍａｉｌ，同时注明第一作者简历（包括出生年、 性别、籍贯、学位、职称和主要从事的研究）及基金资助项目的名称和编号。 （２）来稿请提供打印稿及Ｗｏｒｄ文档，并请自留底稿。文稿务求论点明确，论据可靠，数字准确，图表清晰，内容注意保守国家机密，并附中英文文题、摘要、关键词（３—８个）以及图题、表题。 摘要内容应包括研究目的、方法、结果、结论，２００字左右。文中引用他人文献，请在文后
顺序列出，并在文中相应位置用方括号标出。 （３）本刊作为中国科技论文统计源期刊已被中国学术期刊（光盘版）、万方数据库数字化期 刊群收录并全文上网，如作者不同意收录，请在投稿时申明，否则视为同意收录。（４）依照《著作权法》规定，本刊可以对来稿作文字修改、删节，涉及内容的修改应征得作者 同意。 （５）来稿请勿一稿多投。如该稿曾在学术会议上宣读或用其他文种发表过，请在投稿时 说明。 真诚期待您的来稿！投稿地址：天津市南开区白堤路２６８号 邮编：３００１９２ 电ｔ舌矸专真：０２２—２３６７８６０ １ Ｅ—ｍａｉｌ：ｔｊｎｙｋｘ＠１ ６３．ｃＯｍ 万 方数据 半定量RT-PCR技术的研究及应用作者： 作者单位： 刊名： 英文刊名： 年，卷(期)： 被引用次数： 金凤媚， 薛俊， 郏艳红， 刘仲齐， JIN Feng-mei， XUE Jun， JIA Yan-hong， LIU Zhong-qi 天津市农业生物技术研究中心,天津,300192 天津农业科学 TIANJIN AGRICULTURAL SCIENCES 2008，14(1) 2次 参考文献(22条) 1.刘中成.赵锦.刘孟军 mRNA差异显示技术评述[期刊论文]-分子植物育种 2004(06) 2.Cottrez F.Auriault C.Apron A Quantitative PCR:validation of the use of multispecific internal control 1994(01) 3.Wang A M.Doyle M V.Mark
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21.Gao Yuan.Suo Guangli.Han Jin Expression of human BMP-2 Gene in different tissues of tobacco plants[期刊论文]-Acta Genetica Sinica 2006(01) 22.张鸿平.吴秉铨.张卫国 半定量PCR方法的建立及其在病理学中应用 1994(05) 引证文献(2条) 1.劳荃蘅.黄锡霞.田可川.徐新明.贺三刚.张廷虎.吴伟伟.刘祯 用半定量RT-PCR法检测BⅢB4基因在绵羊皮肤组织 中的mRNA表达[期刊论文]-新疆农业科学 2009(2) 2.杨红兰.张道远.马瑞.刘燕 齿肋赤藓中半
定量RT-PCR方法的探讨[期刊论文]-生物技术 2010(2)
高等生物基 因表 达的变化是调控细胞 生命 活 动 的核 心 机 制 ，正 是 由于 基 因 的差 异 表 达 才 决 定 了生 物 体 的所 有 生 命 过 程 。 因此 ， 究 不 同类 型 细 研 胞 或 同一 类 细 胞 在 不 同发 育 时 期 或 不 同 发 育 状 态 下 基 因表 达 的变 化 ，已成 为 当今 生 物 学 的 研 究 热 点 之 一 …。半 定 量 逆 转 录 多 聚 合 酶 链 式 反 应 （ Ｔ Ｒ— ＰＣＲ ， ｖ ｒ ｅ ｒ ｎ ｃ ｉ ｔｏ ｐ ｌｍｅ ａ ｅ ｈ ｉ ｒ ａ — Ｒｅ ｅ ｓ ｔａ ｓ ｒｐ ｉ ｎ ｏｙ ｒ ｓ ｃ ａｎ ｅ ｃ 列 无 关 的管 家 基 因 ，如 Ｂ 肌 动 蛋 白 （ — ｃｉ 和 一 Ｂ ａｔ ｎ） 甘 油 一 一 酸 脱 氢 酶 （ Ａ Ｄ 等 ， 为 这 些 基 因 ３磷 Ｇ Ｐ Ｈ） 因 的转 录 比较 稳 定 ， 量 相 对 丰 富 。将 Ｒ Ａ逆 转 录 含 Ｎ 为 ｃＮ Ｄ Ａ后 ， 使靶 基 因和“ 管家 基 因” 同管或异 在 管 中一 起 扩增 ， 对 扩 增 产 物 进 行 分 析 时 ， 在 首先 根 据 各样本 间“ 家基 因” 增条带 密度是 否一致 ， 管 扩 粗 略地 判 断 各样 本 抽 提 的 效 率 、质 量 和 扩 增 效 率 是 否 一 致 ， 后 以 “ 家 基 因 ”扩增 产 物 条 带 的 密 然 管 度 作 为标 准 ，计 算 出 靶 基 因扩 增 条 带 密 度 与 其 之 比值 ， 并通 过 观 察 各样 本 扩 增 产 物 的 比值 ， 出靶 得 基 因 的表 达 量 的相 对 变 化 ｌ。 ３ １２反 应 参 数 ２ １ＲＮＡ 的 质 量 ． ｔ ｎ 技 术 是 近年 来 发 展 起 来 的探 讨 基 因 转 录水 平 ｉ ） ｏ 的有效 手段【 与传统 的 Ｎ ｒ ｅ ｌ 法 比较 ， ２ Ｉ 。 ｏ ｈｒ ｂ ｔ ｔ ｎ ｏ 它 具 有灵敏 、 简捷 、 特异性 高等优点 ， 因此 在检测基 因的 表 达 水 平 上 得 到 了 广 泛 的 应 用 。 １原 半定量 Ｒ — Ｃ Ｔ Ｐ Ｒ技 术 的 核 心 即 Ｐ Ｒ， ２ Ｃ 是 ０世 纪 ８ 代 末 出现 的一 种 相 对 定 量 的技 术 。 ０年 当人 们 欲 利 用 该 技 术 研 究 并 揭 示 某 一 基 因 的 表 达 产 物 量 的改 变 时 ，利 用 相 同 量 的 Ｒ Ａ进 行 反 转 录后 ， Ｎ 再 Ｐ Ｒ扩 增 ，然 后 将 扩 增 产 物 进 行 电泳 判 断 量 的差 Ｃ 异 。 为 避 免 样 本 间模 板 质 量 和 扩 增 效 率 的差 异 而 导 致 最 终 结 果 的差 异 ， Ｐ Ｒ反 应 体 系 中 引人 了 在 Ｃ 内对 照 系统 。 在 一 般 情 况 下 大 多 选 用 与靶 基 因 序 在运 用 半 定 量 Ｒ — Ｃ 方 法 检 测 特 异 基 因 表 Ｔ ＰＲ达 量 的差 异 时 ， Ｒ Ａ 的 质 量 至 关 重 要 ， 总 Ｎ 只有 在 总 Ｒ Ａ未被降解 的情况下 ， Ｎ 才能保证 其 中 ｍ Ｎ ＲＡ 的完 整 性 ，从 而 真 实 反 映 起 始 模 板 中基 因 表 达 量 的差 异 【。 因此 ， 个 Ｒ Ａ样 品 须 检 查 其 完 整 性 引 每 Ｎ 和 纯 度 ，可 以通 过 琼 脂 糖 或 甲醛 变 性 电 泳 分 析 证 明 总 Ｒ Ａ 的完 整 性 ， 般 在 电泳 图 上 会 出 现 两 条 Ｎ 一 收 稿 日期 ：０ ７ ０ — ７修 订 日期 ：０ ７ ２ ０ ２０ —３ ２ ２ ０ —１—１ 作 者 简介 ： 金凤媚 （９ ７ ， ， １７ 一） 女 天津人 ， 理研 究员 ， 要从事 番茄 分子 育种研 究 。 助 主 第 １期 金凤媚等 ： 半定 量 Ｒ — Ｃ Ｔ Ｐ Ｒ技 术 的研 究及 应 用 带 ２Ｓ和 １Ｓ ８ ８ ，且 ２Ｓ的亮 度 应 是 １Ｓ的 两 倍 【 ８ ８ ５ ｌ 。 基 因表 达 的 实 际 情 况 【 ４ １ 。２４Ｍｇ 浓 度 对 扩 增 效 率 的 影 响 ． ２ 半定 量 Ｒ — Ｃ Ｔ Ｐ Ｒ检测 体 系必须 防止 混在 Ｒ Ａ 中 Ｎ 的基 因组 Ｄ Ａ带 来 的假 阳性 ， 以 在 抽 提 后 一 定 Ｎ 所 要用Ｄ Ａ酶 消解残存在样 品中的 Ｄ Ａ Ｎ Ｎ 。２２ 逆 转 录 （ Ｔ） ． Ｒ Ｍｇ 是 影 响 Ｔ ｑ酶 扩 增 效 率 的 重 要 因 素 ， ２ ａ 浓 度 范 围 在 ０５ ５ｍｍ ｌ 但 扩 增 效 率 视 序 列 而 定 。 ．～ ｏ／ Ｌ， 徐 春 兰 等 【的 研 究 表 明 Ｍｇ 细 胞 谷 胱 甘 肽
过 氧 ｌ ３ ｌ ２ 对化 物 酶 基 因扩 增 的 影 响 较 大 ， 度 在 ０５ １ｍ ｏ／ 浓 ．～ ｍ ｌ 逆 转 录酶 Ａ ＭＶ 或 Ｍ— Ｖ 能 有 效 地 逆 转 录 ＭＬ Ｒ Ａ，合 成 模 板 ｃ Ｎ Ｎ Ｄ Ａ，加 Ｒ ａｉ （ Ｎ 酶 抑 制 ｎｓｎ Ｒ Ａ 剂 ）可 获 得 最 高 产 量 。实 验证 明 ，Ｄ Ａ合 成 后 残 ， ｃＮ 留 的 完 整 ｍＲ Ａ模 板 干 扰 Ｒ — Ｃ Ｎ Ｔ Ｐ Ｒ， 因 为 它 与 ｃ Ｎ 竞 争 作 为 Ｐ Ｒ模 板 【， Ａ Ｄ Ａ Ｃ ６ 而 ＭＶ 和 Ｍ— Ｖ ｌ ＭＬ Ｌ时 ， 增效率 不理想 ， 带较 淡 ， 一步应 用分 扩 条 进析 软 件 对 电 泳 条 带 ＩＤ 值 进 行 分 析 时 发 现 ， Ｏ 在 １５ｍ ｌ ． ｍｏ Ｌ时 扩 增 效 率 及 特 异 性 良好 。 而 对 于 小 ／ 麦 硫 蛋 白基 因 的检 测 结 果 ，能 同 时稳 定 扩 增 目的 基 因和 内 参 的 Ｍ 浓 度 分 别 为 １７ｍｍ ｌ ． ｏ／ Ｌ和 １９ ． ｍｍｏ／ 。 ｌＬｔ ｌ 反转 录酶 的内在 Ｒ ａｅ Ｎ ｓＨ活性足 以降解残 存 的大 多数 ｍ Ｎ Ｒ Ａ模 板 。但使 用缺乏 Ｒ ａ Ｈ活性 的反 ｎｓ ｅ转 录酶 时 ， 必 须 用 Ｒ ａｅ 处 理 ｃ Ｎ 则 ｎｓＨ Ｄ Ａ。 在 逆 转 录 过 程 中另 一 个 需 要 考 虑 的情 况 是 低 拷 贝 ＲＮ 的 反 转 录 效 率 要 低 于 高 拷 贝 Ｒ Ａ。 Ａ Ｎ 尤 ２ ５ 引 物 的 影 响 ． ２５ １引 物 间 的竞 争 利 用 Ｒ — Ｃ ．． Ｔ Ｐ Ｒ技 术 对 ｍＲ Ａ Ｎ 进 行 检 测 时一 般 要 在 同一 管 中 对 内参 照 和 目的 基 因进 行 扩 增 。要 在 同一 管 中有 效 扩 增 出 内参 照 和 目的基 因产 物 ， 在 凝 胶 电泳 上 清 晰显 现 ， 时 消 并 同 除 引物 对 间 可 能 的竞 争 ， 设 计 引物 时 ， 在 除满 足 引 物 设 计 的基 本 要 求 外 ，还 应 考 虑 引 物 扩 增 的 预 期 其 是 在 反 转 录 过 程 中存 在 大 量 非 特 异 和 背 景 Ｒ Ａ时 ， 种 情 况 更 为 明 显 ， 此 反 转 录 过 程 中 Ｎ 这 因 的线性 问题应该认 真考虑 。解决该 问题 的方 法是 每 个 Ｐ Ｒ反 应 进 行 重 复 ，看 每 次 重 复 的 变 化 程 Ｃ度， 如果 每 次重 复 的结 果 变 化很 大 ， 明 可 能发 生 说了不 稳 定 随 机 现 象 【。 ７ ｌ２３模 板 量 和 反 应 循 环 数 ． 退火温度 ，特 异基因和内参照引物 的预期 退火温 度尽量 相符 ； 引物序列进行 比对时 ， 二者 应无 同源 性 ； 物长度应有一定差 异 ， 产 以免 电泳 时 重 叠 。如 果 目的基 因与 内参 基 因的扩增动 态 曲线 表 明 ， 二 者处 于线 性期的循环次数相差过大 ，却 直接 同管 扩增 ， 两 者的产物 量受 到竞争 ， 增效率 降低 ， 则 扩 这时可选用 同批异管扩增 ，并在不 同循 环次数下 分 别 取 出二 产 物 【。 ９ １ 设 计相 对定 量 Ｐ Ｒ实验 方 案 时必 须注 意 预 Ｃ先 确 定 最 佳 模 板量 和 Ｐ Ｒ反 应 的循 环 数 。 Ｃ Ｃ Ｐ Ｒ扩 增 反 应 是 酶 促 反 应 ， 循 酶 促 反 应 定 律 ， 始 的 遵 开 循 环 内扩 增 产 物 呈 指 数 累 积 ， 物 与 模 板 呈 线 性 产 关 系 。半 定 量 Ｒ — Ｃ Ｔ Ｐ Ｒ技 术 【 是 利 用 产 物 与 模 。 ｌ 正 板 量 的 这 一 线 性 关 系 ，通 过 扩 增 产 物 来 对 比 总 ＲＮ 中 目的基 因 的 表 达 。但 经 过 一 定 的 循 环 后 ， Ａ Ｐ Ｒ产 物 不 再 呈 指 数 累 积 而 进 入 平 台期 ， 因此 ， Ｃ 为避 免 平 台 效 应 的影 响 ， 适 的循 环 数 是 Ｐ Ｒ 半 合 Ｃ 定 量 方 法 的 关 键 因素 之 一 。循 环 次 数 因扩 增 目的 条 带 不 同 而 不 同 ， 昕 等 【 建 立 小 麦 硫 蛋 白 基 陈 ｌ 在 因半定量 Ｒ — Ｃ Ｔ Ｐ Ｒ检 测 方 法 时 ， 目的 基 因 和 内 参 的循环次数分别 为 ３ ０和 ２ ４次 。 石 艳 丽 等 人 １在 ． ｏ ｌ ２５２引物 的设计 在选择 Ｐ Ｒ引物时 ，尽量使上 ．． Ｃ 游 和 下 游 引 物 跨 越 不 同外 显 子 ，这 样 能 把 从 ｃ — Ｄ Ｎ Ａ得 到 的 扩 增 产 物 和 从 任 何 污 染 的 包 含 内含 子 序 列 的基 因组 Ｄ Ａ得 到 的产 物 区分 开 （ １ 。最 Ｎ 图 ） 佳 的序列 引物 是完 全精确 与 ｃ Ｎ Ｄ Ａ模 板互 补 ， 在 ｃＮ Ｄ Ａ序列 中 ， 位模板引物 的重要理 由是 ： ） 定 （ 它 １ 确 定 Ｐ Ｒ 产
物 长 度 ， 选 择 扩 增 ４ ０ ２００ｂ Ｃ 应 ０ ～ ０ ｐ产 物 的模 板 引 物 位 点 ， 因 为 小 于 ４ ０ｂ ０ ｐ的 扩 增 产 物 ， 要 高 分 辨 率 的 特 殊 琼 脂 糖 凝 胶 区分 ， 且 引 需 并 物 和 引 物假 象 可 导 致 模 糊 不 清 ；大 于 ２００ｂ ０ ｐ的 产 物 ，受 酶 作 用 性 能 的 限制 ，难 以 有 效 扩 增 ， 如 用此 方 法测 定链 球 菌透 明 质酸 合 酶 ｍ Ｎ Ｒ Ａ的水 平时， 实验结果 目的基 因和 内参 的循 环次数 分别 为 ３ ０和 ３ ５次 。卢 建 雄 等 【在 检 测 生 脂 基 因时 则 ｌ １ ｌ 均确定 为 ２ 次 。 ｉ 【在研究垂体瘤 细胞 时循 环 ８ Ｋｍ ｌ ２ ｌ次数为 ２次 。 ６ 在 逆 转 录之 前 ， Ｒ Ａ 的定 量 也 是 实 验 的 关 总 Ｎ Ｔｑ Ｎ ａＤ Ａ聚合 酶 ， 延伸长链 则完全 无效 ， 而且 易于 脱离模板【 。 外 ， ｌ此 ４ 】 引物序列 与其它转录基因完全 同源 时 ， 产 生 更 多 的 伪 假 Ｐ Ｒ产 物 。计 算 机 软 会 Ｃ 件 程序 和实践 经验很 便利 于引物 设计 Ｉ ， 也必 但 须 多次试验 ， 才能确定最适引物 。 键步骤 ， 用等量 的 Ｒ Ａ作 为起始模 板 ， 而保 证 Ｎ 从 随后 的 Ｐ Ｒ扩 增 条 带 亮 度 的 差 异 ， 够 真 实 反 映 Ｃ 能 天 津农业科 学 第１ ４卷 中 的表 达 量 的差 异 ，结 果 表 明 茎 和 根 的 表 达 要 高 ｅ ｏｎｌ ｘ — — — ｉ ｒｎ ｎｔｏ ｅ ｏｎ ｘ ２ ＿■■Ｉ ■卜———— １ ■ Ⅱ口ⅡＤ——一一 于 叶 片 组 织 ，这 使 人 们 能 有 目的 的 以 烟 草 为 生 物 反 应 器 为 人 类 服 务 。张 鸿来 等 〔１ 半 定 量 Ｐ Ｒ方 ２用 ２ Ｃ 法 检 测 乳 腺 癌 细 胞 ６ 一 Ｄ Ｌ — Ｎ 的应 用 获 ７ Ｋ Ｎ Ｒ ｍＲ Ａ Ｐ Ｒ ｃ Ｐ ｌ 厂—————〕ｃＮ Ｄ Ａ产物 ■ ￣ ｒ － －ａ ｎ 基 因组 Ｄ Ａ产物 Ｎ ■ ■卜—皿 ? 电池 日 图 １ 区别 内含子 的 Ｒ — Ｃ Ｔ ＰＲ 得成功 ， 其简便 、 快速 的特点更适合于 临床应用 。 综上所述 ，我们可 以看 出半 定量 Ｒ — Ｃ Ｔ Ｐ Ｒ是 一 种 粗 略 地 估 计 基 因 表 达 的 相 对 变 化 的方 法 ， 若 要 精 确 地 计 算 基 因 的 表 达 量 还 需 利 用 实 时 荧 光 ２６其 它 因素 的 影 响 ． 除 了对 上 述 所 提 到 的几 种 关键 因 素 进 行 选 择 外 ，还 要 相 应 的 调 整 ｄ Ｔ Ｔ ｑ酶 浓 度 等 其 它 的 Ｎ Ｐ、ａ Ｐ Ｒ等技术 ，但 多数研究 的焦点并不是检测转 录 Ｃ 水 平 微 小 的变 化 或 确 切 的分 子 数 目 ，而 是 检 测 其 表 达 水 平 变 化 是 否显 著 。 以 ， 定 量 分 析 ｍ Ｎ 所 半 Ｒ Ａ 些参数来提高反应 的特异性 及灵敏度 ，最 大限 度 的提高方法本 身的可靠性 。 一 水平 的方法在各个研究领域都 有着非常广泛 的应 用 ， 着 该 技 术 的 日趋 成 熟 和 完 善 ， 将 成 为研 究 随 它 者 的强 有 力 的研 究 手 段 。 ３Ｒ — Ｃ 技 术 的 应 用 ＴＰ Ｒ参 考 文献 ： ３ １对 动 物 和植 物 基 因表 达 变 化 的 分 析 ． 【】刘 中成 ， 锦 ， ｌ 赵 刘孟 军 ． Ｎ ｍＲ Ａ差 异显 示 技 术评 述 ． 子 植物 分育 种 ，０ ４， ６） ８ ５ ９ ０ ２０ ２（ ： ９ — ０ ． 在动 植 物 表 达 分 析 中 ，常 常 用 到 的是 实 时 定 量 Ｐ Ｒ、 ｒ ｅ ｌｔ基 因芯 片 等 半 定 量 技 术 ， Ｃ Ｎｏｔ ｒ ｂｏ、 ｈｎ 但 这些 方 法 费 时 费 力 ， 需 要 特 殊 的 仪 器 ， 半 定 量 且 而 Ｒ —Ｃ Ｔ Ｐ Ｒ技 术 操 作 相 对 简 便 ， 近 年 来 被 广 泛 地 应 用 于 此类 研 究 中〔－ １ １１。 ６９ 【】Ｃ ｔｅ Ａ ｒ ｕ Ａ ｒｎＡ，ｌ ． ｕ ｎｉ ｔ ｅＰ Ｒ： ａ
ｉａｉｎ ２ ｏｒｚＦ， ｕｉ ｈＣ， ｐｏ ｅ ｔ ａ ， Ｑ ａ ｔａｉ Ｃ ｖｌ ｔ ｔ ｖ ｄ ｏｏ ｈ ｓ ｆｍ ｈｓｅｉｃｉｔ ｎ ｏ ｔ ｌ 【１ ｕ ｌｉ ｉａ Ｒ ｓ ｆｔｅ ｕｅ ｏ ｕ ｉ ｃｆ ｎｅ ａ ｃ ｎｒ Ｊ． ｃｅｃ ｐ ｉ ｒｌ ｏ Ｎ Ａ ｃｄ ｅ ， １９ ２ （）２ １ － ７ ３ ９ ４，２ １：７ ２ ２ ｌ ． 【 】 ｎ Ｄ ｙｅＭ Ｍａｋ Ｄ Ｆ Ｑ ａｔａｉｎｏ ＮＡ ｂ ｈ ３ Ｗａ ｇＡ Ｍ， ｏｌ Ｖ， ｒ ． ｕ ｉ ｔ ｍＲ ｙｔｅ ｎ ｔｏ ｆｐ ｌｍ ｒ ｅ
ｃ ａｎｒａｔ ｎＪ． ｅ ｋ ｍ ａ ０ ０， ４２ ： １ － ２ ． ｏｙ ｅａ ｈｉ ｅｃｉ 〔〕Ｌ ｕ ｅ ｉ ，２０ １ （） ３６ ３ ３ ｓ ｏ 陈 昕 等 （ ０６） 研 究 小 麦 硫 转 运 蛋 白基 因 ２０ 在 【ｌ 仁 勇 ， ４林 丁剑 冰 ， 温浩 ， 半 定量 Ｒ — Ｃ 等． Ｔ Ｐ Ｒ检测 细胞 因子 表达 的研究 … ． 疆医 科 大学学 报 ， ０ ３ ２ （ ：２ — ２ ． 新 ２０ ， ６ ５）４ ７ ４ ９ 的表达时建立了半定量 Ｒ — Ｃ Ｔ Ｐ Ｒ方法 。徐春兰和 汪 以真 （０ ５ 用 半 定 量 Ｒ — Ｃ ２０ ） Ｔ Ｐ Ｒ法 评 定 了 不 同生 长 阶 段 猪 抗 菌 肽 ｐ一 ９基 因 表 达 差 异 ， 果 显 示 ， ｒ３ 结 不 同生 长 阶段 猪 ｐ一 ９基 因 表 达 有 差 异 ，从 出生 ｒ３ 到 断 奶 前 ｐ ９表 达 量 呈 增 加 趋 势 ，断 奶 时 表 达 卜３ 量 下 降 ，断奶 后 随 日龄 增 加 ｐ一 ９表 达 量 再 逐 渐 ｒ３ 增 加 。 因此 ，在 断奶 期 通 过 添 加 某 些 养 分 ，促 进 ｐ一 ９基 因 的表 达 ，对 于 提 高 仔 猪 的 抗 病 能 力 具 ｒ３ 【】 ５ 谷守 芹 ， 解灵 君 ， 范永 山 ． 物组 织 总 Ｒ Ａ提 取 的常 用方 法 及 植 Ｎ 优 化 策略 … ．
定量和半定量PCR技术及其临床意义
北 京 医 科 大 学 学 报 J OURNAL OF BEIJ IN G M EDICAL UN IV ERSIT Y Vol. 31 . 5 . 1999 No Oct ?469 ? 定量和半定量 PCR 技术及其临床意义张 捷 ( 北京医科大学第三医院检验科 ,北京 100083) 1 半定量和定量 PCR 及定量核酸的方法 1. 1 内对照法 床需要 ,则不必一律采用 PCR 技术 。 对于目前还没有其它诊断技术可以检测的疾病 ( 如基因 缺失 、 易位 、 ) , 需要培养时间较长或培养难度大的病原 突变 体的检测 ,则可考虑应用 PCR 方法 。 ( HIV2Ab) 的检测结果难以判断时 ,可用 PCR 技术作为确认 将已知的目的 DNA 及内对照 DNA 混合 ,加入两对引物 同时进行 PCR 扩增 ,最后将 PCR 产物转膜 ,用特异性探针杂 交 ,目的 DNA 扩增后的量通过系列稀释后与内对照的相对 量进行比较即可确定 [ 1 ] 。 1. 2 PCR 杂交法
( PCR2Hyb 法) 1. 3 分枝 DNA 法 ( b2DNA 法 1. 5 连续荧光检测 PCR 产物 手段 。 合成的引物 5′ 端连有生物素 , 所带有生物素的 PCR 产 期诊断和治疗监测的临床价值 ,已被国内外医学界所公认 。 物一端可与标有辣根过氧化物酶的亲合素结合 。另一端与 酶标板上包被的特异性探针杂交 。然后加入底物显色 ,呈色 的程度与 PCR 产物浓度呈正比 。 [2 ] 交检测试剂盒 , 也批准了 HPV 的过筛检测 , 对于 HPV 各型 的检测 ,目前尚未批准 。M TB 的靶序列是 16 SDNA 的 584 bp ,其最后带有杂交检测 。沙眼衣原体的检测试剂盒是 1993 ) 两种特异性探针与待测的 RNA 杂交 , 其中一种探针的 年通过 FDA 批准 , 目前用特殊探针进行杂交后用免疫化学 法进行检测 。但在美国通过 CAP 检查的某些教学医院实验 室也可适量检测其它项目 。 另一端与酶标板上的探针杂交 。另一种探针的另一端与分 枝 DNA 杂交 ,分枝 DNA 的另一端再与
放入的酶标记的探针 杂交 。最后放入化学发光底物 , 底物在酶的作用下 , 产生光 的强度与待测 DNA 或 RNA 浓度成正比 。此方法有放大和 定量的作用 。
1. 4 PCR2杂交定量的荧光检测 人体内存在 , 称条件致病病原体 , 所以检测这些病毒 、 支原 体、 细菌最好用定量 PCR , 复制数量要达到一定程度才考虑 标本进行细菌培养结果和 DNA 结果不一致尚难以解释时 , NA 的检测结果呈阳性 ,应考虑体内的细菌在致病 [ 4 ] 。 有临床意义 。据国外文献报道 , 在严格的实验条件下 , 一些 PCR 产物通过两个标有荧光团的探针进行杂交后 ,首先 给第一个荧光团激发光 , 使它的发射光去激发第二个荧光 团 ,荧光检测仪检测第二个荧光团发出的发射光来计算 PCR 产物 。此方法的特异性很高 。 在进行 PCR 扩增的同时 ,荧光染料 SYBPR Green Ⅰ 结合 1 刘陶文 . 定量 PCR 技术 . 国外医学临床生物化学与检验学分册 , 1998 ,19 : (1) 15 到双链 DNA 产物上 ,在一定温度下 ,连续监测荧光发射的最 高峰 ,则可计算出 PCR 产物的量 。 1. 6 ′ 5 核酸酶分析 ( 荧光定量 PCR) 探针的 5′ 端标有荧光团 ,3′ 端标有淬灭团 。荧光团与淬 灭团在一定距离内 ,淬灭团控制荧光团的发光 。此探针杂交 在待测的 DNA 上 , 然后放引物进行 PCR 扩增 , 当引物延伸 到探针的 5′ ,切断探针 5′ 端 端的荧光团 ,淬灭团失去控制荧 光团的作用 ,则荧光团发出荧光 。连续检测荧光的强度与待 测的 DNA 浓度呈正比 。 2 PCR 技术检测病原微生物的临床意义 如果原有检测技术的灵敏度和特异性基本上已达到临 2 Gilliiand G , Perrin S , Blanchard K , et al . Analysis of cytokine mR2 NA and DNA : Detection and quantitation by competitive polymerase 3 Storch GA , Ballei RS , Bailey TC , et al , Comparison of PCR and 4 Rayner M G , Zhang y , Gorry MC. Evidence of bacterial metabolic activity in culture2negative otitis media wit h effusion. J AMA , 1998 , 279 (4) :296 chain reaction1 Proc Natl Acad Sci USA , 1998 ,87 :272522729 recipients1 J Clin Microbiol , 1994 ,32
(4) :99721003 tion of cytomegalovirus in blood leukocytes from solid organ transplant PP65 antigenemia assay wit h quantitative shell viral culture for detec2 但对有临床症状病人的标本某些细菌培养结果是阴性 ,mR2 参 考 文 献 ( 本文编辑 : 景 霞 周传敬) (1998210212 收稿) 如人类免疫缺陷病毒 ( HIV ) 的抗原 ( HIV2Ag ) 或抗体 用 PCR 和杂交方法对丙型肝炎 ( HCV ) 的基因分型 、 早 美国 FDA 已批准 HIV 、 TB 、 M 沙眼衣原体的 PCR 或杂 ( 某些病毒 、如 CMV [ 3 ] 、 EBV 等 ) 支原体 、 细菌可在普通