实验   微生物接种技术

一、目的：

学习微生物工作的基本接种方法，建立纯培养技术中的“无菌”概念，掌握无菌操作技术。

二、原理：

    所谓接种就是将一定量的纯种微生物在无菌操作条件下转移到另一已灭菌，并适宜于该菌生长繁殖所需的培养基上的过程。本实验要求严格进行无菌操作，一般是在无菌操作台或在实验室内火焰旁进行。根据不同的实验目的和培养方式，可以采用不同的接种工具和接种方法。

三、实验材料：

斜面培养基、液体培养基、平板培养基、记号笔、酒精灯、接种针、消毒酒精、涂布棒等。

四、操作步骤

（一）无菌操作 

菌种分离或移接工作应在无菌环境中进行，接种室、接种箱或超净工作台是常用的接种环境。用前先清洁好卫生，再进行消毒处理。可用紫外线灯和甲醛熏蒸的双重作用，或用3%来苏尔及其他表面消毒进行喷雾。

操作者的手应先用肥皂洗净，再用酒精棉球消毒；整个操作过程都要靠近酒精灯火焰；接种工具在用前和用后必须在灯焰上灭菌；棉塞不得乱放，操作中只能夹在手上；不能有跑、跳等力度大的动作，以免引起空气大振动而增加染菌机会。

（二）接种方法

（1）斜面接种：

从已长好微生物的菌种管移接到另一斜面管的方法。此法用于好气性微生物的接种。

左手持菌种管和斜面管，使斜面向上，并尽量放平。用右手先将棉塞拧转松动，再拿接种环，用右手的小指、无名指和手掌拨下棉塞并夹紧，同时将管口在火焰上燃烧一圈，接种环灼烧灭菌后插入管内，冷却、挑菌，立即转入斜面管底部，沿斜面划曲线或直线。

图1. 斜面接种示意图

（2）液体接种：

由斜面菌接种到液体培养基（如试管或三角瓶等）中的方法。  

操作与上法基本一致，只是在将接种环送入液体培养基中时使环在液体与管壁接触的地方轻轻磨擦，使菌体分散，然后塞上棉塞，再轻轻摇动均匀，即可培养。 如果菌种是培养在液体培养基中时，一般用移液管或滴管接种。

（3）穿刺接种：

用接种针挑取菌种后，插入深层固体培养基内，（不要刺到底部），再沿原路拔出，此法用于厌气性细菌接种、检查细菌的运动能力。

（4）平板接种：

将菌种接至培养皿的方法，平板接种的目的是观察菌落形态、分离纯化菌种，活菌计数以及在平板上进行各种试验时采用的一种接种方法，可分为下面几种： 

1)斜面接平板

a.划线法：见平板划线分离法。

b.点种法：一般用于观察霉菌和酵母细胞，轻轻点在平板的表面（根霉点一点，曲霉、酵母可点3-4点）即可。 

2)平板接斜面：一般是将经平板分散培养得到的单菌落接种到斜面，以便作鉴定或扩大培养、保存之用。 

五、 思考题

1．何谓无菌操作？接种前应作哪些准备工作？

2．总结几种接种方法的要点及应注意的事项？

第二篇：实验实训九 微生物接种技术

实验实训九 微生物接种技术

一、 实验实训目的

学习微生物工作的基本接种方法，建立纯培养技术中的“无菌“概念”，掌握无菌操作技术。

二、 实验实训材料

1．菌种 葡萄球菌、大肠杆菌斜面菌种。

2．器材 牛肉膏蛋白胨琼脂培养基（斜面、液体、柱状、平板等），接种环（针），酒精灯，酒精棉球。

三、 实验实训内容及方法

（一） 常用的几种工具（实图9-1）。

（二） 无菌操作

菌种分离或移接工作应在无菌环境中进行，接种室、接种箱或超净工作台是常用的接种环境。用前先清洁好卫生，再进行消毒处理。可用紫外线灯和甲醛熏蒸的双重作用，或用3%来苏尔及其他表面消毒进行喷雾。

操作者的手应先用肥皂洗净，再用酒精棉球消毒；整个操作过程都要靠近酒精灯火焰；接种工具在用前和用后必须在灯焰上灭菌；棉塞不得乱放，操作中只能夹在手上；不能有跑、跳等力度大的动作，以免引起空气大振动而增加染菌机会。

（三）接种方法

1．斜面接种法 把各种培养条件下的菌种，接入斜面上（包括从试管斜面、培养基平板、液体纯培养物等中把菌种移接于斜面培养基上）。这是微生物学中最常用、最基本的技术之一。接种前，需在待接种试管上贴好标签，注明菌名及接种日期。接种最好在无菌室或无菌箱内进行，若无此条件，可在较清洁密闭的室内进行。室内应事先消毒，桌面要清洁，除去灰尘和杂物，用5%来苏儿溶液擦洗桌面。斜面菌种移接的基本操作方法及注意事项见实图（9-2）。

（1）点燃酒精灯，灯焰周围约1～2cm处的空间为无菌区，所以在酒精灯灯焰旁进行无菌操作法接种，可避免杂菌污染。

（2）将菌种及接种用的斜面培养基（即两支斜面试管）同时握在左手中，使中指位于两试管之间。管内斜面向上，两试管管口相互平行，两支试管处于接近水平位置，用右手的小指、无名指及手掌在火焰旁同时拔去两支试管的棉塞，并使管口在火焰上通过，以烧死试管口的杂菌。随后把管口移至火焰近旁约1-2cm处。

（3）右手拿接种环，先垂直、后水平方向把接种环放在火焰上灼烧。凡是需进入试管的杆部分均应通过火焰灼烧，下端的环心须烧红，以彻底灭菌。灼烧时，应把环放在酒精灯之外焰（氧化焰）上，因外焰温度高，易于烧红。

（4）将烧过的接种环伸入菌种管内，先使环接触斜面上端的培养基或试管壁，使接种环充分冷却，待培养基不再被接种环融化时，即可将接种环伸向斜面中部蘸取少量菌体，然后小心地将接种环从试管内抽出。注意不能让环接触管壁和管口。取出后，接种环不能通过火焰，在火焰旁抽出并迅速伸入新培养基斜面管内，在斜面下1/5处，由下至上轻轻划线。注意不要把培养基划破，也不要把菌沾在管壁上。此过程要迅速、准确完成。

（5）接种完毕，试管口必须迅速通过火焰灭菌，在火焰旁塞入棉塞。注意

不要使试管离开火焰去迎棉塞，以免进入带菌空气。操作中如不慎使棉塞着火，要迅速塞入试管内，由于缺氧火自然就会熄灭。若棉塞 外端仍然着火，也不要用嘴吹，迅速用手捏几下棉塞，即可熄灭。

（6）划线完毕，接种环要灼烧灭菌，才能放回原处，以免污染环境。放回接种环后，再进一步把试管的棉塞塞紧。置28℃下培养2-3d，进观察

2．液体接种

液体接种是一种用移液管、滴管或接种环等工具将菌液移接到培养基中的方法。吸管不同于其它接种工具，不能灼烧，可预先对其进行烘烤法灭菌。

3．穿刺接种

穿刺接种常用于保藏菌种或细菌运动性的检查。一般适用于细菌、酵母菌的接种培养。用接种针沾取少许菌种，移入装有固体或半固体培养基的试管中，自培养基中心垂直刺入到底，然后按原来的穿刺线将针慢慢拔出。

四、 实验实训报告

记录几种接种操作的结果。

五、 思考题

1．何谓无菌操作？接种前应作哪些准备工作？

2．总结几种接种方法的要点及应注意的事项？