猪肺炎支原体体外药敏试验
Medicine Sensitive Experiment on Pig Pneumonia
Mycoplasma in Vitro
院 系 ： 生命科学学院 专 业 ： 生物技术
年 级 ： 2007级
学 号 ： 12007242303
姓 名 ： 郑丽萍
指导教师 ： 谢 琴 研究员
猪肺炎支原体体外药敏试验
摘 要：本试验测定了泰妙菌素、大观霉素、泰乐菌素、庆大纯粉、盐酸多西环素、盐酸环丙沙星、丁胺卡那纯粉等7种药物对猪肺炎支原体（MHP）体外最小抑菌浓度（MIC）以及庆大纯粉、盐酸多西环素与盐酸环丙沙星、泰乐菌素联合药敏试验的FIC指数。结果表明：泰乐菌素单药抑菌浓度（MIC）为0.20μg/ml。盐酸环丙沙星和泰乐菌素及盐酸多西环素对MHP的FIC指数均为1，均表现为相加作用。而盐酸多西环素与庆大纯粉对MHP的FIC指数为2，为无关作用。从庆大纯粉与泰乐菌素对MHP的FIC为0.5，呈协同作用，表明这两种药物联合作用可以增强对MHP的防治疗效。
关键词：猪肺炎支原体；单向药敏试验；联合药敏试验；抗菌药物
Medicine Sensitive Experiment of Pig Pneumonia Mycoplasma in
Vitro
Abstract:The effects of Tylosin tartrat, Spectionmycin, Tylodin tartrate, Gentamicin sulfate, DoxcyclineHcl, CiprofloxacinHcl and Amikacin on Mycoplasma hyop-neumoniae (MHP) and the fractional inhibitory concentrations(FIC) of Gentamicin sulfate, DoxcyclineHcl respectively combined with CiprofloxacinHcl and Tylodin tartrate in vitro were reported. The results showed that the minimal inhibitory concentrations (MIC) of Tylodin tartrate sulfate was 0.20μg/ml. The fractional inhibitory concentrations(FIC) of CiprofloxacinHcl combined with Tylodin tartrate and DxcyclineHcl were 1, both showed additive effects. The FIC of DxcyclineHcl combined with Spectionmycin was 2,showed independent role. The FIC of the combination of Tylodin tartrate and Spectionmycin was 0.5, showed synergy. So the combination of the Tylodin tartrate and Spectionmycin can enhance the control effect of the MHP.
Key words: Mycoplasma hyop-neumoniae; One-way sensitivity test; joint susceptibility test; antibacterial drugs.
I
目 录
前 言 ...................................................................................................................................... 1
1 材料与方法 ............................................................................................................................ 4
1.1试验材料 .............................................................................................................................. 4
1.2仪器与试剂 .......................................................................................................................... 4
1.2.1试验仪器 .................................................................................................................... 4
1.2.2 药品与试剂 ............................................................................................................... 4
1.3 试验方法 ............................................................................................................................. 5
1.3.1猪肺炎支原体MHP的复苏和扩繁 ......................................................................... 5
1.3.2 MHP单向药物敏感性试验 ...................................................................................... 5
1.3.3 MHP联合药物敏感性试验 ...................................................................................... 5
2 结果 ........................................................................................................................................ 6
2.1 MHP单向药物敏感性试验 ................................................................................................ 6
2.2 四种药物联合药敏实验和FIC指数 ................................................................................. 6
3 讨论 ........................................................................................................................................ 7
4 结论 ........................................................................................................................................ 8
参 考 文 献 ........................................................................................................................ 9
致 谢 ...................................................................................................................................... 10
II
前 言
猪肺炎支原体(Mycoplasma hyop-neumoniae,MHP)是引起猪支原体肺炎(Mycoplasmal pneumoniae of swine,Mps,又称猪气喘病)的主要病原。该病以接触性、高度传染性、慢性、高发病率和低死亡率为特点[1],其主要危害是引起猪的生长受阻和饲料转化率大幅下降。Mps常引起猪多杀性巴氏杆菌(Pasteurella multocide)和胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumo-niae)等的继发感染而致死亡率上升。以猪肺炎支原体、胸膜肺炎放线杆菌、猪多杀性巴氏杆菌和支气管败血波氏杆菌(Bordetellabronchiseptica)等协同作用(不同国家、地区主要病原有一定差异)引起的猪呼吸道病综合症(the porcine respi-ratory disease complex)已成为现代养猪业的主要危害。猪肺炎支原体能在猪肺中长期停留,治愈比较困难,由于本病的死亡率虽然不高但是流行具有广泛性、长期性和消耗性,造成巨大的经济损失[2]。目前,国内外在猪支气管肺炎的诊断、免疫、流行病学及治疗方面进行着更加深入的研究,同时应用新技术、新方法结合细胞学、生物化学、病理学、免疫学、遗传学及分子生物学开展着广泛的研究。
(1) 猪肺炎支原体的生物学特性
与其它支原体一样,猪肺炎支原体具有高度多形性,大小不等,在液体培养物和肺触片中常呈球状，直径约0.2-0.5μm,并由小球状串连成环状,直径约0.8-20μm,偶有新月状、长链状和丝状[3]。猪肺炎支原体结构简单,无细胞壁。它仅有3种细胞器,即细胞膜、核糖体和原核细胞核。在细胞质内含有大量颗粒状、由RNA所构成的核糖体和环状双股DNA所构成的基因组。核酸中(G+C)%含量为23%-29%,比一般细菌为低,与原生动物相似,但无线粒体、高尔基体等细胞器[4]。由于它是专性需氧菌,对营养要求较一般支原体为高,这就使得其体外培养十分困难,也是人们不能对其深入研究的一个主要原因。
（2）猪肺炎支原体病的发病情况和临床表现
①对于种猪和成年猪,其临床症状不明显,秋冬季和春季多数为隐性感染,以亚临床症状为主,少数猪在冷刺激下出现声音响亮的咳嗽,夏季会因为并发肺炎而使病情严重,甚至猝死;②对于新生仔猪和小猪,多数呈亚临床症状,少数出现呼吸道症状,但病猪消瘦、生长慢、猪群个体大小不一等猪肺炎支原体病的症状很明显;③对于中猪多数是以肺炎症状为主,并发其他猪疫病的症状。临床上几乎所有猪都会出现以咳嗽特别是冷刺激下剧烈咳嗽的特征性症状。
（3）猪肺炎支原体的致病机理
近年来,人们利用新技术新方法对猪肺炎支原体开展了广泛的研究,在其致病机理的探索上进行了不懈的努力，获得了一定的成果：①猪肺炎支原体荚膜的致病性研究： TajimaM等
1
[5]用超薄切片技术观察被猪肺炎支原体感染的病猪肺部组织,发现细胞质膜外围有一层20 nm厚度的荚膜结构,并且荚膜使支原体粘附于纤毛表面,从而造成纤毛大量脱落。张启敬等（19xx年）[6]利用透射电子显微镜对猪肺炎支原体兔化弱毒株(R株)与济南强毒株(Z株)的超微结构进行了比较,发现致病力不同的R和Z株的荚膜存在着形态学差异。②猪肺炎支原体细胞膜致病性的研究： Geary和Walczak[7]发现完整的细胞和纯化的细胞膜能在猪肺成纤维细胞和MRC25人肺成纤维细胞传代,并且有明显的致病效应,从而说明猪肺炎支原体的致病因子位于细胞膜上,而不是细胞质中。由此人们开始从猪肺炎支原体膜脂、膜蛋白上寻找各种相关的致病因子,进行细胞膜致病性的研究。Cheryl Jenkins等[8]发现在猪肺炎支原体纤毛粘附因子P97的R1、R2区能够粘附酐磷脂且在猪肺炎支原体粘附于宿主的呼吸道过程中起着多种功能。
（3）猪肺炎支原体的综合防治措施
保持舍内空气新鲜,加强通风,减少尘埃,及时清除粪便,降低舍内氨气浓度[11]。断奶后10～15d 内仔猪环境温度应为28～30℃,保育阶段温度应在20℃以上,最少不低于16℃。保育、产房还要注意减少温差,同时注意防止猪群过度拥挤,使用良好的地板隔离,对猪群进行定期驱虫。尽量减少迁移,降低混群应激。避免饲料突然更换,定期消毒,彻底消毒空舍等。
疫苗预防:19xx年江苏省农科院畜牧兽医研究所金洪效等以病肺块直接种入变通的Switzer氏培养基(KM2)中,分离到MHP,多方采用,认为是分离率最高的方法。80年代初何正礼、储静华、金洪效等以病猪血清加入适当培养基,接种定量MHP,培养1-2 d,制片、染色镜检,建立了微粒凝集试验。农业部兽医药品监察所丁庆猷等作间接血球凝集试验,山西农业大学畜牧兽医系杨兴周等作凝胶双扩散试验,吉林省农科院兽医研究所张凡等、广西农学院畜牧兽医系余克伦、施万球等作酶联试验,均在不同范围内试用。叶宝宏，杨柳等[12]对MHP的免疫原理和疫苗治疗进行了研究，对其免疫原性及弱毒疫苗、灭活疫苗和基因工程疫苗等几种疫苗治疗进行了较好的阐述。金光明等[13]在20xx年运用补体结合试验（CFT）、间接血凝试验（IHA）、酶联免疫吸附试验（ELISA）、荧光抗体技术和免疫酶技术等技术研究了该病症的血清诊断方法并对其防治措施及治疗方法进行了讨论。
药物控制:药物治疗是防治猪喘气病的一个重要环节。抗生素类药物是临床上较常用的防治支原体的药物，常用的抗生素有四环素类、大环内酯类、喹诺酮类等[14]。四环素类是以四并苯(萘并苯)为母核,仅在5, 6, 7位取代基不同的一类广谱抗生素,作用机理是与核蛋白体30S亚基结合,抑制蛋自质的生物合成。喹诺酮类药物作用靶点为拓扑异构酶Ⅱ和拓扑异构酶lV，常用的有环丙沙星、恩诺沙星、诺氟沙星等。大环内醋类抗生素是一类抗菌谱广、半衰期长、生物利用度高的药物,作用机理是作用在基因23S rRNAⅡ区和V区，可与V区的核苷酸作用，
2
从而抑制细菌蛋白质的合成。泰乐菌素是近10年来对红霉素及其衍生物结构改造的研究，获得的第三代对耐药菌有效的大环内酯类抗生素。第三代大环内酯类抗生素对大环内酯敏感菌、耐药呼吸道病原体(如肺炎链球菌，酿脓链球菌，肺炎支原体等)均有很好的活性，已成为当前抗生素新药研发的重点[15]。
（4）药物敏感性试验
药物敏感性试验是通过设定不同的药物浓度梯度来检测目的菌株对药物的敏感性，用以检测药的抑菌和杀菌效果的试验方法。药物敏感性实验主要包括单向药敏实验和联合药敏试验。①单向药敏实验：主要是对药品的最小抑菌浓度和最小致死浓度的测定[17]。最小抑菌浓度（MIC）就是指某抗菌药物能抑制微生物生长的最低浓度。可利用液体或者固体培养基测定药物的最小抑菌浓度。最小致死浓度则是某药物能杀死微生物的最低浓度。最小致死浓度的测定可以和MIC同步进行。②联合药敏试验：由于诊断不明的感染和混合感染以及致病菌对抗菌药物耐药性的增加，导致抗菌药物的疗效下降。为此，临床实践中除加大抗菌药物用量和选择新的药物外，目前常采用联合使用两种或多种抗菌药物，借以缓解耐药菌株的产生或减少单一抗菌药物的毒性和耐药性，达到提高疗效的目的。两种药物同时使用时，即可以出现协同作用和累加作用，有时也可出现拮抗作用。因此，有必要进行联合药敏试验，以给临床工作者联合使用各种药物时提供参考。其常用方法有纸片法和棋盘法。
药物敏感性试验方法:药物敏感性实验的方法主要有以下两种：①稀释法：用含有被试菌株的培养基将一定浓度的抗菌药物做系列倍比稀释，培养后观察被测药物的最低抑菌浓度。②扩散法：将浸有抗菌药物的纸片贴在涂有细菌的琼脂板上，抗菌药物在琼脂内向四周扩散，其浓度呈梯度递减。因此，敏感细菌在纸片周围一定距离内生长受到限制。稀释法测得的 MIC的对数与扩散法中测得的抑菌圈直径呈直线关系。应用这两种方法相对应地测试一定量的菌株，可以得到一条代表这种关系的回归线，据此由抑菌圈的大小即可推知该药物的最低抑菌浓度。
药物敏感性实验的敏感度划分标准:药敏试验中的敏感度划分标准如下：①高度敏感，当患有某种细菌性疾病时，用某种药物常用量治疗有效，则这种细菌即对该药高度敏感，即常规用药时达到的平均血浓度超过细菌MIC的5倍以上。②中度敏感，当细菌引起的感染仅在应用高剂量抗菌药物时才有效，或者细菌处于体内抗菌药物浓缩的体液中才被抑制，则细菌对该药呈中度敏感，即常规用药时达到的平均血浓度一般相当于或略高于对细菌的 MIC。③耐药，药物对某一种细菌的MIC高于药物在血液或体液中可能达到的浓度。
近些年科学家们对MHP的研究逐步的深入，疫苗的研发也越来越多。然而，在实际的
3
生产中，猪肺炎支原体引起的病症仍然是养殖产业十分头疼的问题。首先，有些养殖者对这种病重视度不够，导致疫病的传播；其次，某些疫苗生产者生产的疫苗效力不够，没有真正达到免疫的作用，导致疫病发生并传播。因此，在抓紧和注重预防的同时药品治疗也是一个不可忽略的防治疫病的手段。本试验通过对几种药力较强的杀菌药物对MHP的抑菌效力的研究，为实际的生产防治提供一定的理论支持。由于猪肺炎支原体的生长特性在体外进行固体培养比较困难，所以本试验用的是液体培养法，进而选择稀释法进行处理。这样可以保证实验的可行性。
1 材料与方法
1.1试验材料
猪肺炎支原体由宁夏大学生物制品中心提供。
1.2仪器与试剂
1.2.1试验仪器
96孔微量反应板（12×8）购自美国COSTOR公司、DNP-9272型电热恒温培养箱（上海精宏实验设备有限公司）、DHG-9123A型电热恒温鼓风干燥箱（上海精宏实验设备有限公司）、78HW-1型恒温磁力搅拌器（杭州仪表电机有限公司）、SZ-93自动双重纯水蒸馏器（上海亚荣生化仪器厂）、高压蒸汽灭菌锅、冰箱、无菌操作间。
1.2.2 药品与试剂
供试试剂：马血清（四季青）、水解乳（南京探求生物技术有限公司）、酵母粉(上海杰隆工程股份有限公司公司)、牛心汤消化液（中国医学学院生物工程研究所）、0.05mol/L,pH7.2 PBS缓冲液、培养基甲液（16% NaCl+0.8%KCl+0.2%MgSO4?7H2O+0.2%MgCl2?6H2O）、培养基乙液（0.31% NaHPO4?12H2O+0.12% KH2PO4+2%葡萄糖）、0.2%水解乳蛋白(培养基甲液19.96ml+培养基乙液19.96ml+水乳0.8g+双蒸水359.28ml )、Hartley2培养基(0.2%水解乳蛋白200ml+酵母粉0.25g+双蒸水10ml+牛心消化液120ml)、0.4%,pH7.2酚红液。
试验供试药品见表1。
4
表1 供试药品
药品名称 太妙菌素 大观霉素 泰乐菌素 庆大纯粉 盐酸多西环素 丁胺卡那纯粉 盐酸环丙沙星
生产厂家
山西澳洲大耐生物技术有限公司 山西澳洲大耐生物技术有限公司 天津市圣世科技有限公司 浙江国邦兽药长生产 青岛科技制药有限公司 天津市圣世科技有限公司 河北远征药业有限公司
含量（%） 92% 76% 80% 99.8% 98% 96% 99.9%
批号 20091208 20090908 20091201 20100418 20091108 20091123 091103-1
1.3 试验方法
1.3.1猪肺炎支原体MHP的复苏和扩繁
将MHP接种于改良Hartley2培养基上, 37℃培养3-7d，置-20℃备用。 1.3.2 MHP单向药物敏感性试验
1.3.2.1药液配制 用0.05mol/L,pH7.2的PBS缓冲液稀释每种药物，使其浓度为100ug/ml，放置4℃ 5h备用。
1.3.2.2菌液制备 向装有100ml的改良Hartley2培养基加入5ml的菌种，再向里加入10ml无支原体新生牛血清。
1.3.2.3最小抑菌浓度的测定 参照戴自英的二倍稀释法[14]进行,取84个青霉素瓶,根据7种药物设置7组每组12瓶。于每组第1瓶加入未加菌种的培养基1ml作阴性对照,第2瓶加入104CFU/ml的菌液1.9ml和100μg/ml过滤除菌的药液0.1ml,其余孔加入1ml菌液,在2-11瓶之间作2倍系列稀释,最后将第11瓶弃去1ml,第12瓶作阳性对照,置37℃培养3-7d,观察实验结果。当阳性对照孔变黄时,记录该药物未发生颜色变化的最低药物稀释浓度,即为该药的最小抑菌浓度,24h内所有培养物不再发生颜色变化时,记录该药未发生颜色变化的最低稀释浓度,即为该药的最小杀菌浓度(MBC)。 1.3.3 MHP联合药物敏感性试验
将选取的四种药物，配制成4MIC的浓度，吸取0.2ml。分别用104CFU/ml的带菌培养基按照4 MIC、2 MIC、MIC 、1/2 MIC和1/4MIC 4个浓度梯度依次稀释。然后按棋盘法进
5
行联合药敏试验,各孔加好样后,在恒温振荡器37℃振荡3 h,再放入恒温培养箱中37℃培养。观察各个孔的颜色变化。联合药敏试验结果以部分抑菌浓度(Fractional inhibito-ry concentration,FIC)指数表示,其计算公式为:
FIC指数=甲药联合时的MIC/甲药单独时的MIC+乙药联合时的MIC/乙药单独时的MIC FIC指数≤0.5为协同作用；0.5-1为相加(累加)作用；1-2为无关作用；＞2为拮抗作用。
2 结果
2.1 MHP单向药物敏感性试验
7种抗菌药物对Y-98的MIC和MBC见表2。
由表2可以看出MHP对泰乐菌素最为敏感，对泰妙菌素、丁胺卡那纯粉和盐酸环丙沙星敏感性其次，对盐酸多西环素和庆大纯粉的敏感性稍差，大观霉素敏感性最差。
表2 MHP单向药物敏感性试验结果 MHP
药物 泰妙菌素 大观霉素 泰乐菌素 MIC /(μg/ml) 0.039 0.313 0.020 0.039
MBC /(μg/ml) 0.020 0.356 0.010 0.020
药物 盐酸多西环素 丁胺卡那纯粉 盐酸环丙沙星
MIC /(μg/ml) 0.078 0.156 0.039
MHP
MBC /(μg/ml) 0.039 0.078 0.020
2.2 四种药物联合药敏实验和FIC指数
四种药物联合药敏实验结果见表3和表4。根据实验结果，按照FIC指数计算公式，计算4种药物联合作用的FIC指数，见表5。
表3 泰乐菌素与盐酸环丙沙星、庆大纯粉对MHP株的联合药敏试验
药物浓度 /(μg/ml) 泰乐 菌 素 0.080 0.040 0.020 0.010 0.005 各个药物 单药对照
- - - - - -
盐酸环丙沙星
0.242 0.156 0.078 0.039 0.019
- - - - - -
- - - - - +
- - - - + +
- - - - + +
泰妙菌素
0.156 0.078 0.039 0.020 0.010 单药对照 - - - - - -
- - - - - -
- - - - - +
- - - - - +
- - - - + +
- - + + +
庆大纯粉
注:“+”阳性结果; “-”阴性结果。
6
由表3 可知泰乐菌素与盐酸环丙沙星联合时的MIC分别为0.039μg/ml和0.010μg/ml；泰乐菌素与庆大纯粉联合时的MIC分别为0.005μg/ml和0.010μg/ml。
表4 盐酸多西环素与盐酸环丙沙星、庆大纯粉对MHP株的联合药敏试验
药物浓度 /(μg/ml) 0.312
盐 0.156 酸多 0.078 西环 0.039 素 0.020 各个药物 0.242 - - - - - -
盐酸环丙沙星 0.156 - - - - - -
0.078 0.039 0.019 - - - - - +
- - - - - +
- - - + + +
0.156 - - - - - -
0.078 - - - - - -
庆大纯粉 0.039 - - - - - +
0.020 - - - + + +
盐酸多西环素
0.010 单药
对照 - - - + + +
注:“+”阳性结果; “-”阴性结果。
由表4 可知盐酸多西环素与盐酸环丙沙星联合时的MIC分别为0.039μg/ml和0.039μg/ml；盐酸多西环素与庆大纯粉联合时的MIC分别为0.078μg/ml和0.039μg/ml。
表5 4种抗菌药物联合药敏实验的FIC指数
庆大纯粉 盐酸多西环素
盐酸环丙沙星
1 1
泰乐菌素 0.5 2
从表5可以看出，盐酸环丙沙星和泰乐菌素及盐酸多西环素对MHP的FIC指数均为1均表现为相加作用。而盐酸多西环素与庆大纯粉对MHP的FIC指数为2，为无关作用。从庆大纯粉与泰乐菌素对MHP的FIC为0.5，呈协同作用。
3 讨论
3.1 本试验分别对氨基糖类的丁胺卡娜纯粉、大观霉素和庆大纯粉，四环素类的盐酸多西环
素，喹诺酮类的盐酸环丙沙星，大环内酯类的泰乐菌素，双萜烯类的泰妙菌素等七种药进行最小抑菌浓度的测定。得出，七种抗菌药物对MHP株的MIC(ug/ml)的分别是：泰妙菌素0.039，大观霉素0.313，泰乐菌素0.020，庆大纯粉0.039，盐酸多西环素0.078，盐酸环丙沙星0.039和丁胺卡那纯粉0.156。其中，泰乐菌素对猪肺炎支原体的最小抑制浓度达到0.020μg/ml,表现为MHP对其最为敏感。因此，泰乐菌素等大环内酯类药物可能是治疗猪肺炎的效果较好的药物，可以作为临床首选药物。此结果与周芸凤等(20xx年) [20]研究的结果基本相符。但也有一定的差异，这可能与试验方法、培养条件接种药物浓度以及药品生产厂家有关。然而，
7
根据Senterfitl[23]的研究，药物对支原体MIC的测定结果与接种物浓度有很大关系，而实验用104CFU/ml左右的浓度与临床上动物体内的支原体含量接近，符合临床实际情况，本试验采用这一浓度，保证了试验结果的有效性。加上支原体是一类缺乏细胞壁的原核微生物，对营养要求非常高，需要在特殊的液体培养基中才能生长，而且生长缓慢，常需要培养3-7d才能生长，且易污染，因此它的这些特性则可能是造成实验结果存在差异的主要因素。
3.2 在联合药物敏感性试验中，盐酸环丙沙星和泰乐菌素及盐酸多西环素对MHP的FIC指数均为1均表现为相加作用，可以作为临床应用的理论参考。庆大纯粉与泰乐菌素对MHP的FIC为0.5，呈协同作用，表明这两种药物联合作用可以增强对MHP的防治疗效。且有研究表明，庆大霉素与碱性药物联合应用时抗菌效能会增强。而泰乐菌素呈碱性。因而泰乐菌素与庆大纯粉联用呈协同作用，这也与前人的研究相符合。
3.3 目前，在猪肺炎支原体病的防治上，主要存在三个问题：第一，有些养殖者对这种病重视度不够，导致疫病的传播；第二，某些疫苗生产者生产的疫苗效力不够，没有真正达到免疫的作用，导致疫病发生并传播；第三，常规低浓度抗生素与支原体长期接触,可诱导或选择出耐药菌株,从而造成治疗失败。因此，需要尽快开发质优、价廉、高效的复方新兽药来满足临床需要，并指导临床治疗。本试验对此进行了初步探索，已经发现了一些极有潜力的有效组合，为进一步开发用于防治猪肺炎支原体病的优质新兽药提供理论基础。然而，本实验仅仅是体外抑菌实验，要确切了解这几种药物对猪肺炎的实际防治效果，还有待进一步做临床实验和研究。
4 结论
本实验得出泰乐菌素等大环内酯类药物可能是治疗猪肺炎的高敏药物，可以作为首选药物。盐酸环丙沙星和泰乐菌素及盐酸多西环素对MHP的FIC指数均为1均表现为相加作用，可用作临床应用的参考。从庆大纯粉与泰乐菌素对MHP的FIC为0.5，呈协同作用，表明这两种药物联合作用可以增强对MHP的防治疗效。这对指导临床用药有重要意义。
8
参 考 文 献
[1]吴南洋.猪肺炎支原体病的预防与控制[J].福建畜牧兽医.2008,30(1)：53-54.
[2]李桂兰,刘志宗等.猪肺炎支原体致病机理研究进展[J].南方养猪.2007,(222):04-07.
[3]李彦明，张映等.猪肺炎支原体及其生物学研究进展[J].动物医学进展.2003,（03):08-11.
[4]黄芬等.猪肺炎支原体168菌株细胞的超微结构及膜磷脂组成分析[J].中国兽药杂志.1985,(03):07-10.
[5]Easy and Reliable Double-Immunogold Labelling of Herpes Simplex Virus Type-1 Infected Cells Using Primary Monoclonal Antibodies and Studied by Cryosection Electron Microscopy[J]. The Histochemical Journal Volume 31, Number 8, 525-533.
[6]张启敬等.猪喘气病弱毒疫苗的研究应用家兔效检猪喘气病弱毒疫苗[J].中国兽药杂志.1989,(04):01-03.
[7]Screening mutations in myosin binding protein C3 gene in a cohort of patients with Hypertrophic
[9]张映等.猪肺炎支原体及其生物学研究进展[J]. 动物医学进展.2003,(03):08-11.
[10]李桂兰，刘志宗等.猪肺炎支原体致病机理研究进展[R].畜禽业.2007,(10):36-39.
[11]丁世杰,李杰等.近年来猪病流行情况及防治对策[J].吉林牧畜兽医.2005(9):18-20.
[12]叶宝宏,杨柳等.猪肺炎支原体的免疫学研究现状[R].榆林学院学报.2009,(02):10-13.
[13]金光明等.猪支原体肺炎——猪气喘病的诊断与防治[J].畜牧与饲料科学.2009,Z1-42.
[14]戴自英.临床抗菌药物学[M].北京人民卫生出版社.1985.
[15]葛涵,沈舜义等.大环内酯类抗生素研究进展[J].世界临床药物.2007(06):376-380.
[16]赵永前,刘茂军等.替米考星对猪肺炎支原体最小抑制浓度的测定试验[J].今日畜牧兽医.2007,(12):06-09.
[17]李榆梅,药学微生物基础技术 [M].北京:化学工业出版社.2004,144-151.
[18]陆承平.兽医微生物学(第3版)[M].北京:中国农业出版社.2001,360-366.
[19]Pang Y G,Jiang J Y,Wang L Z,et al.Effects of immunologicalstress on immune response in different breeds of piglets［J］.Animal Husbandry And Feed Science,2009，1（2）：28-31.
[20]周芸凤等.支原泰妙对体外鸡毒支原体的抑菌试验和鸡毒支原体病的治疗试验 [J]. 2008,(03):08-11.
[21]王茂文等.猪肺炎支原体病的特点及其防制措施[J].畜禽业.2008,(07):58-62.
[22]王鑫,吴大玮等.体外诱导肺炎支原体对喹诺酮类药物耐药机制的研究[J].山东大学学报.2010,(03):39-43.
[23]Senterfit L B.Antibiotics sensitivity testing of Mycoplsma.In:Methods in MycoplasmologyⅡ.Telly S G,Razin S.eds New York:Academic press,1983.398-401.
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致 谢
临近毕业之际,我借此机会向在这四年中给予了我帮助和指导的所有老师表示由衷的谢意,感谢他们四年来的辛勤栽培。不积跬步何以至千里,各位任课老师认真负责,在他们的悉心帮助和支持下,我能够很好的掌握和运用专业知识,并在设计中得以体现,顺利完成毕业论文。
在我的毕业论文写作期间,谢琴老师为我提供了种种专业知识上的指导和一些富于创造性的建议。生物制品中心的各位老师给我提供了各种试验条件,没有这样帮助和关怀,我不会这么顺利的完成毕业论文。在此向各位老师表示深深的感谢和崇高的敬意。
同时,在论文实验过程中,对我们给予过帮助的其它实验室的老师表示深深的感谢。还要感谢同专业的杨佳丽等同学,在毕业设计的这段时间里,你们给了我很多的帮助,提出了很多宝贵的意见,对于你们帮助和支持,在此我表示衷心地感谢。
最后，感谢宁夏大学生命科学学院对我的培养，感谢曾经教育和帮助过我的所有老师。衷心地感谢为评阅本论文而付出宝贵时间和辛勤劳动的专家和教授们！
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