一）实验原理
双缩脲（NH3CONHCONH3）是两个分子脲经180℃左右加热，放出一个分子氨后得到的产物。在强碱性溶液中，双缩脲与CuSO4形成紫色络合物，称为双缩脲反应。凡具有两个酰胺基或两个直接连接的肽键，或能过一个中间碳原子相连的肽键，这类化合物都有双缩脲反应。
紫色络合物颜色的深浅与蛋白质浓度成正比，而与蛋白质分子量及氨基酸成分无关，故可用来测定蛋白质含量。测定范围为1~10mg蛋白质。干扰这一测定的物质主要有：硫酸铵、Tris缓冲液和某些氨基酸等。
此法的优点是较快速，不同的蛋白质产生颜色的深浅相近，以及干扰物质少。主要的缺点是灵敏度差。因此双缩脲法常用于需要快速，但并不需要十分精确的蛋白质测定。
（二）试剂与器材
1.试剂：
（1）标准蛋白质溶液：用标准的结晶牛血清清蛋白（BSA）或标准酪蛋白，配制成10mg/ml的标准蛋白溶液，可用BSA浓度1mg/ml的A280为0.66来校正其纯度。如有需要，标准蛋白质还可预先用微量凯氏定氮法测定蛋白氮含量，计算出其纯度，再根据其纯度，称量配制成标准蛋白质溶液。牛血清清蛋白用H2O 或0.9%NaCl配制，酪蛋白用0．05N NaOH配制。
（2）双缩脲试剂：称以1.50克硫酸铜（CuSO4?5H2O）和6.0克酒石酸钾钠（KNaC4H4O6?4H2O），用500毫升水溶解，在搅拌下加入300毫升10% NaOH溶液，用水稀释到1升，贮存于塑料瓶中（或内壁涂以石蜡的瓶中）。此试剂可长期保存。若贮存瓶中有黑色沉淀出现，则需要重新配制。
2.器材：
可见光分光光度计、大试管15支、旋涡混合器等。
（三）操作方法
1.标准曲线的测定：取12支试管分两组，分别加入0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0毫升的标准蛋白质溶液，用水补足到1毫升，然后加入4毫升双缩脲试剂。充分摇匀后，在室温（20~25℃）下放置30分钟，于540nm处进行比色测定。用未加蛋白质溶液的第一支试管作为空白对照液。取两组测定的平均值，以蛋白质的含量为横座标，光吸收值为纵座标绘制标准曲线。
2、样品的测定：取2~3个试管，用上述同样的方法，测定未知样品的蛋白质浓度。注意样品浓度不要超过10mg/ml。
三、Folin—酚试剂法（Lowry法）
（一）实验原理
这种蛋白质测定法是最灵敏的方法之一。过去此法是应用最广泛的一种方法，由于其试剂乙的配制较为困难（现在已可以订购），近年来逐渐被考马斯亮兰法所取代。此法的显色原理与双缩脲方法是相同的，只是加入了第二种试剂，即Folin—酚试剂，以增加显色量，从而提高了检测蛋白质的灵敏度。这两种显色反应产生深兰色的原因是：?在碱性条件下，蛋白质中的肽键与铜结合生成复合物。Folin—酚试剂中的磷钼酸盐—磷钨酸盐被蛋白质中的酪氨酸和苯丙氨酸残基还原，产生深兰色（钼兰和钨兰的混合物）。在一定的条件下，兰色深度与蛋白的量成正比。
Folin—酚试剂法最早由Lowry确定了蛋白质浓度测定的基本步骤。以后在生物化学领域得到广泛的应用。这个测定法的优点是灵敏度高，比双缩脲法灵敏得多，缺点是费时间较长，要精确控制操作时间，标准曲线也不是严格的直线形式，且专一性较差，干扰物质较多。对双缩脲反应发生干扰的离子，同样容易干扰Lowry反应。而且对后者的影响还要大得多。酚类、柠檬酸、硫酸铵、Tris缓冲液、甘氨酸、糖类、甘油等均有干扰作用。浓度较低的尿素（0.5%），硫酸纳（1%），硝酸纳（1%），三氯乙酸（0.5%），乙醇（5%），乙醚（5%），丙酮（0.5%）等溶液对显色无影响，但这些物质浓度高时，必须作校正曲线。含硫酸铵的溶液，只须加浓碳酸钠—氢氧化钠溶液，即可显色测定。若样品酸度较高，显色后会色浅，则必须提高碳酸钠—氢氧化钠溶液的浓度1~2倍。
进行测定时，加F olin—酚试剂时要特别小心，因为该试剂仅在酸性pH条件下稳定，但上述还原反应只在pH=10的情况下发生，故当Folin一酚试剂加到碱性的铜—蛋白质溶液中时，必须立即混匀，以便在磷钼酸—磷钨酸试剂被破坏之前，还原反应即能发生。
此法也适用于酪氨酸和色氨酸的定量测定。
此法可检测的最低蛋白质量达5mg。通常测定范围是20~250mg。
（二）试剂与器材
1.试剂
（1）试剂甲：
（A）10克Na2CO3，2克NaOH和0.25克酒石酸钾钠（KNaC4H4O6?4H2O）。溶解于500毫升蒸馏水中。
（B）0.5克硫酸铜（CuSO4?5H2O）溶解于100毫升蒸馏水中，每次使用前，将50份（A）与1份（B）混合，即为试剂甲。
（2）试剂乙：
在2升磨口回流瓶中，加入100克钨酸钠（Na2WO4?2H2O）,25克钼酸钠（Na2MoO4?2H2O）及700毫升蒸馏水，再加50毫升85%磷酸，100毫升浓盐酸，充分混合，接上回流管，以小火回流10小时，回流结束时，加入150克硫酸锂（Li2SO4），50毫升蒸馏水及数滴液体
溴，开口继续沸腾15分钟，以便驱除过量的溴。冷却后溶液呈黄色（如仍呈绿色，须再重复滴加液体溴的步骤）。稀释至1升，过滤，滤液置于棕色试剂瓶中保存。使用时用标准NaOH滴定，酚酞作指示剂，然后适当稀释，约加水1倍，使最终的酸浓度为1N左右。
（3）标准蛋白质溶液:
精确称取结晶牛血清清蛋白或g—球蛋白，溶于蒸馏水，浓度为250 mg/ml左右。牛血清清蛋白溶于水若混浊，可改用0.9 % NaCl溶液。
2.器材
（1）可见光分光光度计（2）旋涡混合器（3）秒表（4）试管16支
（三）操作方法
1.标准曲线的测定：取16支大试管，1支作空白，3支留作未知样品，其余试管分成两组，分别加入0，0.1，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0毫升标准蛋白质溶液（浓度为250mg/ml）。用水补足到1.0毫升，然后每支试管加入5毫升试剂甲，在旋涡混合器上迅速混合，于室温（20～25℃）放置10分钟。再逐管加入0.5毫升试剂乙（Folin—酚试剂），同样立即混匀。这一步混合速度要快，否则会使显色程度减弱。然后在室温下放置30分钟，以未加蛋白质溶液的第一支试管作为空白对照，于700nm处测定各管中溶液的吸光度值。以蛋白质的量为横座标，吸光度值为纵座标，绘制出标准曲线。
注意：因Lowry反应的显色随时间不断加深，因此各项操作必须精确控制时间，即第1支试管加入5毫升试剂甲后，开始计时，1分钟后，第2支试管加入5毫升试剂甲，2分钟后加第3支试管，余此类推。全部试管加完试剂甲后若已超过10分钟，则第1支试管可立即加入0.5毫升试剂乙，1分钟后第2支试管加入0.5毫升试剂乙，2分钟后加第3支试管，余此类推。待最后一支试管加完试剂后，再放置30分钟，然后开始测定光吸收。每分钟测一个样品。
进行多试管操作时，为了防止出错，每位学生都必须在实验记录本上预先画好下面的表格。表中是每个试管要加入的量（毫升），并按由左至右，由上至下的顺序，逐管加入。最下面两排是计算出的每管中蛋白质的量（微克）和测得的吸光度值。
2.样品的测定：取1毫升样品溶液（其中约含蛋白质20~250微克），按上述方法进行操作，取1毫升蒸馏水代替样品作为空白对照。通常样品的测定也可与标准曲线的测定放在一起，同时进行。即在标准曲线测定的各试管后面，再增加3个试管。如上表中的8、9、10试管。
根据所测样品的吸光度值，在标准曲线上查出相应的蛋白质量，从而计算出样品溶液的蛋白质浓度。
注意，由于各种蛋白质含有不同量的酪氨酸和苯丙氨酸，显色的深浅往往随不同的蛋白质而变化。因而本测定法通常只适用于测定蛋白质的相对浓度（相对于标准蛋白质）。
第二篇：双缩脲法测葡萄酒中蛋白质
双 缩 脲 法 测 定 葡 萄 酒 中 的 蛋 白 质
一、 实验目的
蛋白质是引起葡萄酒 ,尤其是白葡萄酒沉淀的主要因素之一。葡萄酒中的蛋白质主要来 源有两个:一是来源于葡萄;二是来源于加胶处理的胶剂。葡萄酒在装瓶甚至制成成品酒之前,通过测定酒中蛋白质的含量,可以防患于未然。
双缩脲法较为方便、准确，能够很好满足日常检验和指导生产的需要。
二、 基本原理
蛋白质用磷钼酸沉淀 ,再用双缩脲反应显色 ,用标准线法定量。 所谓双缩脲反应是指尿素加热至180℃时 ,两分子尿素缩合放出一个分子氨而形成双缩脲。双缩脲在碱性溶液中与铜离子结合 , 生成复杂的紫红色化合物的反应。其反应式如下 :
而蛋白质中含有多个与双缩脲结构相似的键。因此 ,也能有双缩脲反应 ,形成紫红色络合物 ,在一定的范围内 ,其颜色的深浅与蛋白质含量成正比 ,可用于肽含量的比色测定。
三、 主要仪器
1. 离心机 15000r/min
2. 分光光度计 可见光范围
四、 主要试剂
1. 磷钼酸试剂 : 5 .00g磷钼酸溶于水中，加15 ml硫酸、5.00g
硫酸钠以0.25g葡萄糖 ,溶后稀释至100ml。
2. 0. 30 mg/ ml蛋白质标准溶液 : 称取0 . 3000g蛋白质 ,溶
于水中 ,稀释1000 ml 。
3. 3 .0% ( w /v )氢氧化钠溶液 :称取3 .0g氢氧化钠溶于水
中 ,稀释至100ml。
4. 2 0% ( w / v )硫酸铜溶液 :称 20g硫酸铜容于水中，稀释
至100ml 。
五、 实验步骤
1. 标准曲线的制备 :在10个100 ml的容量瓶中 ,用吸管分别吸入10 、 20 、 30 、 40 、 50 、 60 、 70 、 80 、 90 、 100 ml蛋白质标准溶液 ,用水稀释至刻度(相当于蛋白质含量30 、 60 、 90 、 120 、 150 、 180 、 210 、 240 、 270 、 300m g / L ) , 吸取20 ml稀释后的各标准溶液 ,各加 30 . 0ml磷钼酸溶液 ,放置15 -20h。 以 15000r/min速度离心15min , 滗出一层清液 ,用10 m l乙醇溶解残留物 ,混匀 ,再次离心10 m in , 滗去乙醇溶液 ,加入 0 . 50 ml 3.0%氢氧化钠溶液 , 激烈振荡1min ,放置2h 后 . 再离心10min, , 并用滤纸过滤。在波长530mm ,用10mm比色皿 , 测定每一显色后标准溶液的吸光度 ,以吸光度对标准溶液浓度作图 , 绘制标准曲线 。
2 . 测定 :取20 .0 ml试样与30 .0 m l磷钼酸混合 ,按标准曲线制
备的方法继续操作，测量吸光度。
3 . 空白试验 :如果所得蛋白沉淀的颜色较深 ,则另取一份20 . 0
ml试样 ,除不加硫酸铜和加入总量为10 . 25 ml 3 .0%氢氧化钠溶液外 ,其余按测定操作制成空白溶液 , 也在同样条件下测量吸光度。
4． 结果计算 :由试样吸光度或试样吸光度与空白吸光度之差 ,
从标准曲线中查得蛋白质浓度 , 即为每升试样中含蛋白质的毫克数 。