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科目 分子生物学实验 题目 质粒DNA提取、纯化和电泳检测 学号
【实验目的】
1、掌握碱变性提取质粒DNA法的原理、过程及各种试剂的作用。
2、掌握凝胶电泳对DNA分离纯化的原理和方法。
【实验原理】
1、提取、纯化质粒DNA（碱变性提取法）
提取和纯化质粒DNA的方法很多，目前常用的有：碱变性提取法、煮沸法、羟基磷灰石柱层析法、EB一氯化铯密度梯度离心法和Wizard法等。其中，碱变性提取法最为经典和常用，适于不同量质粒DNA的提取。该方法操作简单，易于操作，一般实验室均可进行。提取的质粒DNA纯度高，可直接用于酶切、序列测定及分析。碱变性提取质粒DNA一般包括三个基本步骤：培养细菌细胞以扩增质粒；收集和裂解细胞；分离和纯化质粒DNA。
在细菌细胞中，染色体DNA以双螺旋结构存在，质粒DNA以共价闭合环状形式存在。细胞破碎后，染色体DNA和质粒DNA均被释放出来，但是两者变性与复性所依赖的溶液pH值不同。在pH值高达12．0的碱性溶液中，染色体DNA的氢键断裂，双螺旋结构解开而变性；共价闭合环状质粒DNA的大部分氢键断裂，但两条互补链不完全分离。当用pH值4．6的KAc(或NaAc)高盐溶液调节碱性溶液至中性时，变性的质粒DNA可恢复原来的共价闭合环状超螺旋结构而溶解于溶液中；但染色体DNA不能复性，而是与不稳定的大分子RNA、蛋白质一SDS复合物等一起形成缠连的、可见的白色絮状沉淀。这种沉淀通过离心，与复性的溶于溶液的质粒DNA分离。溶于上清液的质粒DNA，可用无水乙醇和盐溶液，使之凝聚而形成沉淀。由于DNA与RNA性质类似，乙醇沉淀DNA的同时，也伴随着RNA沉淀，可利用RNase A将RNA降解。质粒DNA溶液中的RNase A以及一些可溶性蛋白，可通过酚／氯仿抽提除去，最后获得纯度较高的质粒DNA。
2、琼脂糖凝胶电泳
电泳（electrophoresis)是带电物质在电场中向着与其电荷相反的电极方向
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移动的现象。各种生物大分子在一定条件下，可以解离成带电荷的离子，在电场中会向相反的电极移动。凝胶是支持电泳介质，它具有分子筛效应。含有电解液的凝胶在电场中，其中的电离子会发生移动，移动的速度可因电离子的大小、形态及电荷量的不同而有差异。利用移动速度差异，就可以区别各种大小不同的分子。因而，凝胶电泳可用于分离、鉴定和纯化DNA片段，是分子生物学的核心技术之一。
凝胶电泳技术操作简单而迅速，分辨率高，分辨范围极广。此外，凝胶中DNA的位置可以用低浓度荧光插入染料如溴化乙锭(EB)或SYBR Gold染色直接观察到，甚至含量少至20 Pg的双链DNA在紫外激发下也能直接检测到。需要的话，这些分离的DNA条带可以从凝胶中回收，用于各种各样目的的实验。
分子生物学实验中，常用的两种凝胶为琼脂糖和聚丙烯酰胺凝胶。这两种凝胶能灌制成各种形状、大小和孔径，也能以许多不同的构型和方位进行电泳。琼脂糖凝胶电泳易于操作，适用于核酸电泳，测定DNA的相对分子质量，分离经限制酶水解的DNA片段，进一步纯化DNA等。琼脂糖凝胶电泳是一种常用的方法。在溶液中，由于核酸有磷酸基而带负电荷，在电场中向正极移动。DNA在琼脂糖凝胶中的电泳迁移速率主要取决于下面6个因素：
1)样品DNA分子的大小：电泳时，线性双螺旋DNA分子是以头尾位向前迁移的，其迁移速度与相对分子质量(所含碱基)的对数值成反比，这是因为大分子有更大的摩擦阻力。
2)DNA分子的构象：相对分子质量相同而构象不同的DNA分子，其迁移速率不同。在抽提质粒DNA过程中，由于各种因素的影响，使超螺旋的共价闭合环状结构的质粒DNA(covalently closed circular DNA，cccDNA)的一条链断裂，变成开环DNA(open circle DNA，oeDNA)分子，如果两条链发生断裂，就转变为线状DNA(1iner DNA，L DNA)分子。这三种构型的分子有不同的迁移率。一般情况下，超螺旋型迁移速度最快，其次为线状分子，最慢的是开环状分子。
3)琼脂糖浓度：琼脂糖浓度直接影响凝胶的孔径，一定大小的DNA片段在不同浓度的琼脂糖凝胶中的泳动速度不同。通常凝胶浓度越低，则凝胶孔径越大，
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DNA电泳迁移速度越快，因此，相对分子质量越大，选用的凝胶浓度应越低。
4)电泳所用电场：低电压条件下，线性DNA片段的迁移速率与所用电压成正比，电压越高，带电颗粒泳动越快，但随着电场强度的增加，不同长度DNA泳动的增加程度不同，因此凝胶电泳分离DNA的有效范围随着电压上升而减少。为了获得DNA片段的最佳分离效果，电场强度应小于5 V／cm。
5)缓冲液：缓冲液的组成和离子强度直接影响迁移率。当电泳液为去离子水(如不慎误用去离子水配制凝胶)，溶液的导电性很少，带电颗粒泳动很慢，DNA几乎不移动；而在高离子强度下(如错用10×电泳缓冲液)，导电性极高，带电颗粒泳动很快，产生大量的热，有时甚至熔化凝胶或使DNA变性。电泳时常用的缓冲液有乙酸盐（TAE）、硼酸盐（TBE)和磷酸盐（TPE）几种不同的缓冲液，通常配制成10×或5×的浓度母液保存于室温下，用时稀释至工作浓度。TAE缓冲液缓冲能力弱，长时间电泳缓冲能力逐渐丧失（阳极变碱性，阴极变酸性），长时间电泳需要更换缓冲液。TAE缓冲液可以分离数KB长度的DNA，在精致DNA片段以及染色体DNA进行杂交时经常使用。
6)温度：琼脂糖凝胶电泳时，不同大小DNA片段的相对电泳迁移率在4～30℃内无变化，一般琼脂糖凝胶电泳多在室温下进行，而当琼脂糖含量少于0．5％时，凝胶很脆弱，最好在4℃下电泳以增加凝胶强度。
【实验仪器、材料及试剂】
1、仪器和材料
接种环，培养皿，酒精灯，恒温振荡培养箱，高速冷冻离心机，漩涡振荡器，微量移液器及多型号枪头，微波炉，电泳仪等
菌体： E.coli DH5α受体菌，具有Ampr标记的质粒pUC19。 Maker: λ/Hind III DNA Maker DL2000 DNA Maker
点样对照组： pUC19/ Hind II双链线性DNA PUC19（商品） λDNA
2、实验试剂
LB培养基，抗生素（氨苄青霉素），溶液Ⅰ，溶液Ⅱ，溶液Ⅲ，3mol/L NaAc
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溶液，预冷无水乙醇，70%乙醇溶液，RNase A母液，TE缓冲液，饱和酚，氯仿/异戊醇混合液，酚/氯仿/异戊醇(PCI)混合液，TAE电泳缓冲液（10×），溴化乙锭（EB)，上样缓冲液（6×）。
溶液Ⅰ：50mM葡萄糖，25mM Tris-HCl(pH 8.0)，10mM EDTA(pH 8.0）。(1M Tris-HCl，12.5ml pH 8.0；0.5M EDTA 10ml pH 8.0 ，葡萄糖4.730g，加ddH2O至500ml。在121℃高压灭菌15min ，贮存于4℃)。
溶液Ⅱ：0.2M NaOH，1% SDS。(使用前用10M的NaOH和10%的SDS母液配置，防止NaOH吸收空气中的H2O和CO2而减弱了碱性）。
溶液Ⅲ：5M醋酸钾（KAc）缓冲液60ml，冰醋酸11.5ml，重蒸水28.5ml，溶液中浓度K+3M,Ac-5M。
【实验步骤】
1、扩增质粒（菌体培养）
1）在LB平板上划线培养具有Ampr标记的E.coli DH5α菌，37℃恒温倒置培养16-18hr；之后，挑取单菌落，接种于20ml LB液体培养基（含Ampr80ug/ml）中，37℃，220rpm振荡培养过夜12-14hr；再转接一次，进行50或100倍稀释，同样37℃，220rpm振荡培养4-6hr。
2）对50mL的离心管称重（记为m1），取菌液30ml配平，6000rpm离心5min，
弃去上清液；加入5ml溶液Ⅰ混匀，6000rpm离心5min,弃去上清液。取离心管称重（记为m2)，可测得菌体重量W=m2-m1。
2、提取质粒
1）向离心管中加入溶液Ⅰ（1.0ml/100mg菌体），漩涡混匀后，冰浴5min； 向离心管中加入溶液Ⅱ（2.0ml/100mg菌体），轻柔颠倒混匀后，冰浴5min； 向离心管中加入溶液Ⅲ（1.5ml/100mg菌体），轻柔颠倒混匀后，冰浴5min；
离心管配平，12000rpm离心15min,取上清至新50ml离心管（记体积为v1)
2）加入2v1冰乙醇，颠倒混匀，-20℃保存30min，12000rpm离心15min,弃上
清液,将离心管倒置于纸巾上，以使所有液体流出。向沉淀中加入5mL70%乙醇进
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行洗涤，12000rpm离心2min,弃去上清液，重复洗涤一次；
37℃下保存5min,至离心管内干燥，加入1mlTE缓冲液溶解，得粗提物，将粗提物转移至新EP管，加入100ugRNase A（10ug/ul),将EP管放置于37℃下，保温1-2小时。
3、纯化质粒
1）将提取物等分为500ul置于EP管中，加等体积酚液，混匀后，12000r离心5min,将上清液转移至新EP管；加入等体积酚/氯仿/异戊醇(PCI)混合液，混匀后，12000rpm离心5min,转上清至新EP管；加入等体积氯仿/异戊醇混合液，混匀后，12000rpm离心5min,将上清液转移至新EP管；
2）加入1/10体积的3mol/L NaAc，混匀后，加入2倍体积（包括上清液和1/10体积的NaAc)的冰乙醇，颠倒混匀，-20℃保存30min，12000rpm离心15min,弃去上清液；加入5mL70%乙醇进行洗涤，12000rpm离心2min,弃去上清液，重复洗涤一次；
37℃下保存5min,至沉淀干燥,每管加入25ul TE溶液,温和振荡几秒钟，至沉淀溶解。将2管整合到一管，得到50ul质粒DNA组，放置-20℃下保存。
4、凝胶电泳分离质粒
1）制胶：1% 琼脂糖凝胶：称取0.4g琼脂糖于300ml三角烧瓶中，加40ml 1×TAE，微波炉加热至完全溶化，冷却至60℃左右，三角瓶放在手面可坚持1min即可，缓缓倒入架有梳子的电泳胶板中，勿使有气泡，静置冷却30min以上，轻轻拔出梳子，放入电泳槽中（电泳缓冲液1×TAE），即可上样。
2）取3.0μl纯化DNA加入1.0μl上样缓冲液，混合，进行点样。点样完毕后，100V，200mA条件下电泳30min。电泳完毕后，进行EB染色，用凝胶成像仪拍照，得到实验结果。
【注意事项】
1、在接菌时，注意无菌操作，物品应在酒精灯火焰上方无菌区域内。将挑
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有菌体的接种环在三角瓶壁上轻轻接触，然后轻轻摇动三角瓶，让液体的LB培养基轻轻冲刷菌体，当观察到附近的LB培养基有轻微浑浊现象时，接菌成功，再轻轻震荡三角瓶，使全部菌体进入培养基中。
2、注意离心机的使用，离心管要配平，以防错误操作损坏离心机。离心结束后，将离心管从离心机取出时应保持其倾斜状态，防止沉淀重新进入上清液中。
3、为获得高纯度质粒DNA，必须彻底除去杂蛋白、染色体DNA和RNA。在整个提取过程中出去染色体DNA的关键步骤是加入溶液Ⅱ、溶液Ⅲ的变性和复性环节，应控制好变形和复兴的时机。加入溶液Ⅰ时，可剧烈震荡，使菌体沉淀转变成均匀的菌悬液，此时细胞尚未破裂，染色体不会断裂；加入溶液Ⅱ时，菌液变粘稠、透明，无菌块残留；加入溶液Ⅲ时，会立即出现白色沉淀。加入溶液Ⅱ和溶液Ⅲ后，应缓慢上下颠倒离心管数次，切忌在漩涡振荡器上剧烈震荡，否则，染色体DNA会断裂成小片段，不会形成沉淀，而溶解在溶液中，与质粒DNA混合在一起，不利于质粒DNA提纯。因此，操作时一定要缓慢柔和，采用上下颠倒的方法，既要使试剂与染色体DNA充分作用，又不破坏染色体的结构。
4、酚具有腐蚀性，能损伤皮肤和衣物，使用时应小心。皮肤如不小心沾到酚，应立即用碱性溶液、肥皂或大量清水冲洗。
5、沉淀DNA通常使用预冷无水乙醇，在低温条件下长时间放置可使DNA沉淀完全。除用乙醇沉淀DNA外，还可使用0．6倍体积的异丙醇，但异丙醇也能将盐等杂质沉淀，所以沉淀需要在常温下进行，并且时间不宜太长(限20 min内)。沉淀离心后，需用70％乙醇洗涤，以除去盐类及挥发性较小的异丙醇。、
6、在低温下提取质粒DNA，收率较高。对于低拷贝治理，在收集细胞之前，用氯霉素适当处理，可以提高质粒的拷贝数。
7、制备凝胶时，应避免琼脂糖溶液在微波炉里加热时间过长，否则溶液将会爆沸蒸发，影响琼脂糖浓度，可在微波炉中间歇性加热，约沸腾三次后，至凝胶溶解即可。同时，制胶时要将凝胶槽中的水擦拭干净，避免对胶的均一性产生影响。
8、电泳时最好使用新的电泳缓冲液，以免影响电泳效果。如下一步实验要
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求较高，则应尽量使用TAE电泳缓冲液，并且，配制琼脂糖凝胶的电泳缓冲液应与电泳时使用的缓冲液为同一批配制的。
9、凝胶冷却过程中，要自然冷却，不要用冷水冲，否则会导致凝胶各部分不均匀，对电泳结果产生影响
10、注意上样时要小心操作，避免损坏凝胶或将样品槽底部的凝胶刺穿。也不要快速挤出吸头内的样品，避免挤出的空气将样品冲出样品孔。
11、紫外线对眼睛和皮肤均有危害性，对眼睛尤甚。为了最大限度避免受到辐射，要确保紫外光源得到适当遮蔽，并应戴好目镜(眼罩)或能够有效阻挡紫外线的全副完全罩，避免皮肤直接暴露在紫外线下。
12、溴化乙锭是一种具扁平分子的核酸染料，可以插入到DNA或RNA分子的碱基之间，并在300 nm波长的紫外光照射下放射出荧光，所以可用来显现琼脂糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶中的核酸分子。溴化乙锭是一种强烈的诱变剂，有毒性，使用含有这种染料的溶液时，应戴手套进行操作。勿将溶液滴洒在台面或地面上，实验结束后用水彻底冲洗干净。
【实验结果】
（一）实验现象及数据记录
1、灭菌干燥离心管质量： m1=15.711g；
菌液离心后离心管质量： m2=15.807g；
菌体质量： W=0.0960g；
2、加入溶液Ⅰ时，剧烈震荡后，菌体沉淀转变成均匀浑浊的菌悬液，此时细胞尚未破裂，染色体不会断裂； 加入溶液Ⅱ时，菌液变粘稠、透明，无菌块残留，打开EP管时，可以看到粘稠的丝状物。加入溶液Ⅲ时，立即出现白色絮状沉淀，经轻柔混匀后，沉淀漂浮在EP管上部。
3、电泳时可以明显观察到蓝色条带在电泳槽里由负极向正极移动，这是因为DNA双螺旋分子骨架两侧带有含负电荷的磷酸根。所以，电泳时必须注意凝胶摆
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放的位置，应将点样孔靠近负极方向摆放。
（二）凝胶电泳结果
从左至右各泳道的样品及上样量
凝胶电泳观察结果图
（三）结果分析
1、凝胶电泳时，使用了2种DNA Maker，分别为位于第一泳道的λ/Hind III和位于最后一泳道的DL2000。其中，λ/Hind III DNA Maker可由HindI II酶切Lambda后得到的，本应有8条带，最后一条带大小约为125bp,实验中一般很难观察到；DL2000 DNA Marker是由单独的PCR扩增产物混合而成，包括6条DNA条带，其DNA片段相比λ/Hind III DNA Maker要小，适用于比对较小的DNA片段。(2种Maker所含DNA条带大小已在上图标记)。
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2、质粒DNA提取过程中，染色体DNA、蛋白质、RNA等物质仍有部分残留，质粒DNA有超螺旋、开环、线性三种不同的状态，这些因素导致实验组中每种样品都可以观察到多条带。下面以我们组（JD-4）为例，通过横向对比，由上至下对每一条带进行分析：
1）蛋白质条带：点样孔附近可以观察到其周围有微弱荧光，表明纯化后的质粒DNA仍含有少量蛋白质。电泳时，由于蛋白质分子较大，很难通过琼脂糖分子筛，所以残留在点样孔处。残留的蛋白质经EB染色后，在紫外下可看到荧光，由于含量比较少，所以荧光比较弱。
2）染色体DNA条带：在点样孔至23130bp的条带间可以观察到微弱的条带，其条带位置同样与14泳道的λDNA相近，该条带代表的是残留的染色体DNA。其分子量比质粒DNA大很多，所以在琼脂糖凝胶中移动速度较慢，条带靠近点样孔。
3）三种构型质粒DNA条带： 在4361bp至2000bp条带间可以看到两条带：上面一条颜色很浅，条带大小在4300bp左右，为开环DNA分子；下面一条颜色很亮，条带大小接近1900bp，与第三泳道的PUC19位与同一水平，为超螺旋DNA分子。与第二泳道的pUC19/ HindIII对比，可以推测在两条带间应还有一线性DNA分子条带，大小接近2500bp。正常情况下，由于没有专门的限制酶切割DNA分子，所以线性DNA分子比较难形成。
在细菌体内，质粒DNA是以负超螺旋构型存在的。在琼脂糖凝胶电泳中不同构型的同一种质粒DNA,尽管分子量相同，但具有不同的电泳迁移率。其中跑在最前沿的是共价闭合DNA，其后依次是线性DNA和开环DNA,其原因是共价闭合的DNA其空间位阻最小，所以跑得最快。而开环DNA空间位阻最大，所以跑得最慢。
4)RNA条带：图示中第15和16泳道为未加RNA酶的样品，可见在500-100bp范围内有宽而亮的条带，该条带为RNA条带。本组中，均加过RNA酶，RNA分解比较彻底，仅在100bp左右有一条很模糊的带。
（四）实验小结
综合以上分析，可以看出我们组（JD-4)的实验结果所得的质粒DNA纯度还算理想。染色体DNA和双链开环DNA含量少，蛋白质含量相对多一些。质粒DNA条带
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比较亮，其亮度大约为商品PUC19的3-4倍，故可以推测，提取的质粒DNA浓度为PUC19浓度的3-4倍。
【思考】
1、质粒提取过程中，实验重要试剂及操作步骤的意义和作用。
溶液Ⅰ的作用：葡萄糖使溶液密度增加，悬浮后的大肠杆菌不会快速沉积到管子的底部；维持渗透压，防止细胞提前破裂，防止DNA受机械剪切力作用而降解。EDTA是Ca2+和Mg2+等二价金属离子的螯合剂，可抑制DNase的活性，抑制微生物的生长。Tris-Cl溶液提供适当的pH。
溶液Ⅱ的作用：NaOH使细胞膜发生了从bilayer（双层膜）结构向micelle（微囊）结构的相变化导致细胞溶解。同时，强碱性使染色体DNA、质粒DNA和蛋白质变性；SDS为下一步沉淀做铺垫。
溶液Ⅲ的作用： 十二烷基硫酸钠（SDS sodium dodecylsulfate）遇到KAc后变成了十二烷基硫酸钾（potassium dodecylsulfate, PDS），而PDS是水不溶的，因此发生了沉淀。又SDS专门喜欢和蛋白质结合，平均两个氨基酸上结合一个SDS分子，钾钠离子置换所产生的大量沉淀自然就将绝大部分蛋白质沉淀了，此外大肠杆菌的基因组DNA也一起被共沉淀了。 HAc中和NaOH，因为长时间的碱性条件下会打断基因组DNA，只要是50－100 kb大小的片断，就没有办法再被PDS共沉淀了。同时变性的质粒DNA复性。该步反应形成的高盐环境进一步加速了这一沉淀。冰浴使反应更充分。
冰乙醇作用：用无水乙醇沉淀DNA，这是实验中最常用的沉淀DNA的方法。乙醇的优点是可以任意比和水相混溶，乙醇与核酸不会起任何化学反应，对DNA很安全，因此是理想的沉淀剂。
DNA溶液是DNA以水合状态稳定存在，当加入乙醇时，乙醇会夺去DNA周围的水分子，使DNA失水而易于聚合。在pH为8左右的溶液中，DNA分子是带负电荷的，加一定浓度的NaAc或NaCl，使Na+中和DNA分子上的负电荷，减少DNA分
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子之间的同性电荷相斥力，易于互相聚合而形成DNA钠盐沉淀。因为溶液Ⅲ加入后，经计算可知Na+的浓度为1 M，又Na+浓度达到0.1M即可沉淀DNA，所以该处没有添加Na+。
TE溶液的作用：pH缓冲液，为DNA提供稳定的生理状态，呈弱碱性，有利于保护碱基对。同时含有EDTA是二价阳离子的螯合剂，抑制DNA酶作用。
RNase：在质粒DNA沉淀的同时，由于RNA与DNA性质类似，RNA会同时沉淀。混在质粒DNA中的RNA会用RNase除去。
2、质粒纯化过程中，实验重要试剂及操作步骤的意义和作用。
苯酚/氯仿/异戊醇混合液的作用:苯酚是强的蛋白阻断剂，可使蛋白变性；氯仿也是蛋白阻断剂，但强度弱于苯酚，其主要作用是将同水以极小比例互溶的苯酚萃取出来。如果不加氯仿，残留的苯酚会阻碍酶切反应等，且水饱和酚的密度略轻于水，苯酚相位于上层，不利于获得含质粒的水相，加入氯仿后可以增加比重，使得酚/氯仿始终在下层，方便水相的回收；异戊醇则可起消除抽提过程中出现的泡沫，有利于分层更明显。
无水乙醇和盐溶液可使溶于上清液中的质粒DNA凝聚而形成沉淀，其中盐溶液的作用是中和DNA所带的负电荷，使DNA之间的排斥力减小，有助于DNA的沉淀。在提取质粒DNA过程中，加无水乙醇沉淀DNA时没有额外加入NaAc溶液，原因是之前加入的溶液Ⅱ和溶液Ⅲ已经提供了足够的盐浓度；在质粒提纯过程中，加无水乙醇沉淀DNA时必须加入1/10体积的NaAc，以保证一定的离子强度，使DNA沉淀。
3、质粒电泳过程中，实验重要试剂及操作步骤的意义和作用。
loading buffer作用 ：增大样品密度，确保DNA均匀进入样品孔内；以溴酚蓝及二甲苯氰作为双色电泳指示剂，使样品呈现颜色，了解样品泳动情况，使操作更为便利。