天然药物化学
实验指导
循环使用
请勿带走
目 录
实验一 槐花米中芦丁的提取
实验二 芦丁水解液的纸色谱鉴定
实验三 大黄中大黄素的提取
实验四 大黄中大黄素的柱色谱提纯
实验五 苦参生物碱的薄层鉴定
实验六 茶叶中咖啡因的提取
实验一 槐花米中芦丁的提取
芦丁（Rutin）广泛存在于植物界中，现已发现含芦丁的植物至少在70种以上，如烟叶、槐花、荞麦和蒲公英中均含有。尤以槐花米（为植物Sophora japonica的未开放的花蕾）和荞麦中含量最高，可作为大量提取芦丁的原料。
槐花米为豆科植物槐花的未开放花蕾。味苦性凉，具清热、凉血、止血之功。槐花的主要化学成分为芦丁，又名芸香甙，含量可达12-16%。
芦丁是由槲皮素（Quercetin）3位上的羟基与芸香糖（Rutinose）〔为葡萄糖（Glucose）与鼠李糖（Rhamnose）组成的双糖〕脱水合成的苷。为浅黄色粉末或极细的针状结晶，含有三分子的结晶水，熔点为174~178℃，无水物188~190℃。溶解度：冷水中为1:10000；热水中1:200；冷乙醇1:650；热乙醇1:60；冷吡啶1:12。微溶于丙酮、乙酸乙酯，不溶于苯、乙醚、氯仿、石油醚，溶于碱而呈黄色。
芦丁具有维生素P的作用。可降低毛细管前壁的脆性和调节渗透性，有助于保持及恢复毛细血管的正常弹性，临床上用作毛细管脆性引起的出血症，并常用作防治高血压病的辅助治疗剂。现在国处也常用芦丁作食品及饮料的染色剂。
一、实验目的
1．通过芦丁的提取与精制掌握碱-酸法提取黄酮类化合物的原理及操作。
2．掌握黄酮类化合物的主要性质。
二、实验原理
芦丁属黄酮类化合物，分子中有较多酚羟基，具弱酸性，易溶于热碱中，酸化后又析出，因此可以用碱溶酸沉的方法提取芦丁，又利用芦丁在冷水和热水中溶解度相差较大的特性进行重结晶精制。
三、实验材料
槐米、石灰乳、0.4％硼砂水溶液、浓盐酸、广泛pH试纸、棉花等。
四、实验内容
称取槐米30g，在乳钵中研碎后，投入300ml 0.4％硼砂溶液的沸水溶液中煮沸2-3分钟，在搅拌下加入石灰乳调pH 9，煮沸40分钟（注意添加水，保持原有体积，保持pH8~9），趁热倾出上清液，用棉花过滤。残渣加100ml水，加石灰乳调pH 9，煮沸30分钟，趁热用棉花过滤，二次滤液合并。滤液保持在60℃，加浓HCl，调pH2-3，放置过夜，则析出芦丁沉淀。
五、实验说明及注意事项
1、加入饱和石灰水溶液既可达到碱溶液提取芦丁的目的，又可除去槐花米中大量多糖粘液质，更容易过滤。也可直接加入150mL水和1g氢氧化钙粉末，而不必配成饱和溶液。
2、pH值过低会使芦丁形成烊盐而增加了水溶性，降低收率。
六、思考题
1．本实验提取过程中应注意哪些问题？
2、根据这个实验，请总结出用酸碱调节法提取中药活性成分的适用条件及一般原理。
实验二 芦丁水解液的纸色谱鉴定
一、实验目的
1．掌握纸色谱方法。
2．掌握黄酮类化合物的色谱特点。
二、实验原理
芦丁可被稀酸水解，生成槲皮素及葡萄糖、李糖，并能通过纸层析鉴定。
三、实验材料
槐米、石灰乳、0.4％硼砂水溶液、2％的硫酸溶液、浓盐酸、正丁醇、醋酸、氨水、1％的氢氧化钠溶液、1％的三氯化铝乙醇溶液、1％的葡萄糖溶液、1％的鼠李糖溶液、1％芸香苷乙醇溶液、1％槲皮素乙醇溶液、95％乙醇、碳酸钡、广泛pH试纸、中速层析滤纸等。
四、实验内容
（一）芦丁的水解
取芦丁1g，研碎，加2％硫酸水溶液80ml，小火加热，微沸回流30-60min，并及时补充蒸发掉的水分。在加热过程中，开始时溶液呈浑浊状态，约10min后，溶液由浑浊转为澄清，逐渐析出黄色小针状结晶，即水解产物槲皮素，继续加热至结晶物不再增加时为止。抽滤，保留滤液20ml，以检查滤液中的单糖。
（二） 糖的纸色谱检识
取上述水解母液10ml小心用Ba(OH)2（大约1－1.5g , 并预先用10ml水调至成乳液）中和至中性，过滤出生成的BaSO4沉淀，滤液用热水浴小心浓缩至小体积1ml备用。取1张圆形滤纸, 用铅笔画出通过圆心的三条直线将滤纸等分为6份，对角点样法两次将样品、葡萄糖、鼠李糖标准品点于距圆心一定（＞0.5mm）处, 并将用其它滤纸卷成的滤纸芯通过圆滤纸的圆心，借助滤纸芯的毛细作用用正丁醇-乙酸-水（4：1：5）上层溶液作径向展开。
支持剂：新华层析滤纸（中速、20cmХ7cm）
样 品：水解浓缩液
对照品：a. 葡萄糖标准品水溶液b. 鼠李糖标准品水溶液
展开剂：正丁醇：冰醋酸：水（4：1：5上层）
显 色：a. 喷苯胺-邻苯二甲酸试剂，于105℃加热10min，显棕色或棕红色斑点
b.喷氨性硝酸银试剂，于100℃左右加热，呈棕褐色斑点。
五、思考题
1、芦丁酸水解时有何现象，如何解释？
2、槲皮素和芦丁纸色谱鉴定时，用BAW（4：1：5）上层和下层展开后，解释两者的相对比移值大小关系？
3、葡萄糖和鼠李糖的纸层析鉴定时，用BAW（4：1：5）上层展开后，何者相对比移值较大，为什么？
实验三 大黄中大黄素的提取
一、实验目的
（1）熟悉蒽醌类成分的提取分离方法
（2）掌握PH梯度提取法的原理和操作技术
二、实验原理
大黄为蓼科植物,味苦,性寒,具有泻热通肠、凉血解毒、逐瘀通经等功效。其主要有效成分为大黄素、芦荟大黄素、大黄素甲醚等蒽醌类化合物 ,其中大部分为结合的蒽醌,少量为游离的蒽醌。结合的蒽醌类化合物由于其苷元具有酚羟基,故呈弱酸性,能溶于水、乙醇、碳酸氢钠溶液,但在有机溶剂中的溶解度很小。游离的蒽醌易溶于氯仿、乙醚等有机溶剂而不溶于水。其中，大黄酸具有羧基，酸性最强；大黄素具有β-酚羟基，酸性第二；芦荟大黄素连有羟甲基，酸性第三；大黄素甲醚和和大黄酚的酸性最弱。根据以上化合物的酸度差异，可用碱性强弱不同的溶液进行梯度萃取分离。
本实验主要用薄层层析法分离纯化大黄素，其Rf值由大到小分别为大黄酚和大黄素甲醚、大黄素、芦荟大黄素、大黄酸。
大黄酸：黄色针状结晶mp.321—322℃（升华），不溶于水，能溶于吡啶、碳酸氢钠水溶液，微溶于乙醇、苯、氯仿、乙醚和石油醚。
大黄素：橙黄色针状结晶，mp.256—257℃（乙醇或冰醋酸），能升华。其溶解度如下：四氯化碳0.01%、氯仿0.07%、二硫化碳0.009%、乙醚0.14%、苯0.041%。易溶于乙醇，可溶于稀氨水、碳酸钠水溶液，几乎不溶于水。
大黄酸 R1=H R2=COOH
大黄素 R1=CH3 R2=OH
芦荟大黄素 R1=CH2OH R2=H
大黄素甲醚 R1=CH3 R2=OCH3
大黄酚 R1=CH3 R2=H
三、实验器材
试药：大黄粗粉、20%硫酸溶液、5%碳酸氢钠溶液、5%碳酸钠溶液、盐酸、丙酮、乙酸乙酯、硅胶CMC-Na板、石油醚、大黄素标准品等
仪器：回流装置一套、烧杯、层析槽、试管、梨形分液漏斗、水浴锅、电热套、旋转蒸发仪循环水式多用真空泵、抽滤瓶、铁架台等
四、实验内容
大黄素的提取、分离流程图
五、具体操作步骤：
1.游离蒽醌的提取
称取大黄粗粉30g，加20%H2SO4水溶液150mL，加热1小时，放冷，抽滤，同时滤饼水洗至近中性（除去H2SO4），于70℃干燥后，置回流装置中，加入乙酸乙酯300 mL回流提取1小时，得到乙酸乙酯提取液。
2.PH梯度萃取分离
（1）将乙酸乙酯提取液加入分液漏斗中，用 5% NaHCO3水溶液萃取三次，经观察乙酸乙酯层颜色变浅及无气泡产生为止。
（2）经5% NaHCO3水溶液萃取后的乙酸乙酯层，继以5% Na2CO3水溶液萃取三次，乙酸乙酯层经薄层检查(标准大黄素作对照)，得知已提尽大黄素后，合并三次Na2CO3萃取液，并用HCl酸化，得大黄素沉淀。（注意:加酸时应缓慢加入，以防酸液溢出）。
六、注意事项：
1、游离蒽醌的提取要控制温度，不宜太高
2、PH梯度萃取分离时，要检查是否萃取完全
3、注意碱液浓度及萃取时的静置时间对实验结果的影响。
五、思考题
pH梯度萃取法的原理是什么？如何利用该方法分离大黄中的5种游离羟基蒽醌化合物？
实验四 大黄中大黄素的柱色谱提纯
一、实验目的
1、学习硅胶柱色谱的分离原理。
2、学习大黄素柱色谱的操作方法。
二、实验原理
利用混合物中各组分对固定相的吸附能力不同可将大黄素分离出来。
三、实验方法
（一）大黄素提纯
（1）装柱：取一玻璃层析柱，垂直固定在铁架台上，在管的下端垫入少量棉花，装入100～200目硅胶（约1/3高，湿法装柱）。
（2）上样：将样品置于小蒸发皿中，用少量石油醚分散，另加用3倍量硅胶拌和均匀，并于水浴上缓缓蒸去溶剂。然后将含有样品的硅胶装入色谱柱的上端，并盖一圆形滤纸。
（3）洗脱：将色谱柱活塞打开，洗脱剂为石油醚（沸程60-90℃）-乙酸乙酯（15∶1）混合液。
（4）收集：洗脱液25ml一份，分别收集，用硅胶薄层板跟踪检查（被洗脱的成份先后次序为：大黄酚和大黄素甲醚、大黄素、芦荟大黄素等）。合并大黄素部分，回收溶剂至小体积，放置，即可析出结晶，过滤，即得纯品大黄素。
（二）大黄素的薄层色谱检识
薄层板：硅胶CMC-Na板
样品液：自制大黄素溶液
对照品：标准大黄素溶液
展开剂：石油醚-乙酸乙酯（7：3）
显色：观察斑点颜色
四、思考题
大黄中5种游离羟基蒽醌化合物的极性与结构的关系如何？薄层鉴别时常用何类吸附剂？Rf值顺序如何？
实验五 苦参生物碱的薄层鉴定
一、实验目的和要求
1、掌握硅胶板的制作方法和注意问题。
2、学习苦参生物碱的薄层鉴定方法。
二、实验原理
中药苦参是豆科植物苦参(Sophora flavescens Ait)的干燥根，有清热燥湿、杀虫、利尿之功效。苦参在临床上用于杀虫、治疗痢疾、肝炎、荨麻疹、湿疹、气管炎等。药理实验证明苦参总生物碱有抗心律失常及抗癌活性等。苦参中主要含生物碱和黄酮类成分。苦参中主要生物碱有：苦参碱(1)、氧化苦参碱(2)、槐定(3)、槐果碱(4)，结构如图1。氧化苦参碱有抗癌、抗衰老等作用。
利用生物碱易溶于有机溶剂的特点，用氯仿进行提取，再通过薄层色谱对提取物进行鉴定。
三、实验原理
1、苦参生物碱的提取：取10g苦参粗粉，用滤纸包好放入索式提取管中，加入200ml氯仿，在70℃水浴条件下提取约3小时，回收氯仿，得到苦参生物碱的提取液。
2、薄层鉴定
吸附剂:硅胶-CMC
样品：总碱氯仿液
展开剂：氯仿-甲醇-水（15：4：0.5）；或氯仿-甲醇（9：2）
显色剂：改良碘化铋钾试剂（甲液：0.85g次硝酸铋溶于10mL冰乙酸中，再加水稀释至40mL；乙液：8g碘化钾溶于20ml水中。临用时，取甲、乙两液各5mL，加冰乙酸20mL，水60mL，摇匀即可。）
四、思考题
1. 简述索氏提取器提取原理及特点。
2. 制备性薄层色谱的特点是什么？
实验六 茶叶中咖啡因的提取
一、实验目的
1、 学习从茶叶中提取咖啡因的基本原理和方法, 了解咖啡因的一般性质。
2、掌握用索氏提取器提取有机物的原理和方法。
3、进一步熟悉萃取、蒸馏、升华等基本操作。
二、实验原理
茶叶中含有多种生物碱，咖啡因是茶叶中主要的生物碱，对中枢神经具有兴奋作用，质量分数约为1％～5％。茶叶中还含有少量茶碱、可可碱、茶多酚、有机酸、蛋白质、色素和纤维素等成分。咖啡因的化学名称是1，3，7-三甲基-2，6-二氧嘌呤，其结构式如下：
含结晶水的咖啡碱为白色针状结晶粉末，味苦。能溶于水、乙醇、丙酮、氯仿等。微溶于石油醚，在100℃时失去结晶水，开始升华。120℃时升华显著，178℃以上升华加快。无水咖啡碱的熔点为238℃。
从茶叶中提取咖啡因，是用适当的溶剂（氯仿、乙醇、苯等）在脂肪提取器中连续抽提，浓缩得粗咖啡因。粗咖啡因中还含有一些其它的生物碱和杂质，可利用升华进一步提纯。
三、实验试剂
茶叶 95%乙醇 生石灰
四、实验步骤和实验流程
1、提取
称取10g茶叶，研细后，放入Soxhlet提取器的滤纸套筒中，在圆底烧瓶中加入80 ml 95％乙醇，用水浴加热，连续提取约2-3h直到提取液为浅色后，停止加热。稍冷，改成蒸馏装置，回收提取液中的大部分乙醇。
2、升华
趁热将瓶中的粗提液倾人蒸发皿中，拌入4g生石灰粉，在蒸气浴上蒸干，其间应不断搅拌，并压碎块状物。将口径合适的玻璃漏斗罩在隔以刺有许多小孔滤纸的蒸发皿上，用砂浴小心加热升华。控制砂浴温度在220℃左右。当滤纸上出现许多白色毛状结晶时，停止加热，自然冷却至100℃左右。小心取下漏斗，揭开滤纸，用刮刀将纸上和器皿周围的咖啡因刮下。残渣经拌和后用较大的火再加热片刻，使升华完全。合并两次收集的咖啡因，产量约0.1g。
五、实验装置
Soxhlet提取装置 升华装置
六、操作重点及注意事项
1、滤纸套筒大小要合适，以既能紧贴器壁，又能方便取放为宜，其高度不得超过虹吸管；滤纸包茶叶时要严密，茶叶末不能掉出滤纸套筒，纸套上面折成凹形。
2、瓶中乙醇不可蒸得太干，否则残液很粘，转移时损失较大。
3、生石灰起吸水和中和作用，以除去部分酸性杂质。
4、在萃取回流充分的情况下，升华操作是实验成败的关键。升华过程中，始终都需用小火间接加热。如温度太高，会使产物发黄。注意温度计应放在合适的位置，使正确反映出升华的温度。
5、实验完毕，关好水电。
七、问题讨论
1、你怎样理解索氏提取器的提取高效率？
2、从茶叶中提取出的粗咖啡因有绿色光泽，为什么？
八、主要试剂及产品的物理常数：（文献值）
附录：
如何铺硅胶板
1. CMC－Na溶液的配置：一般其浓度为0.3～0.5％，根据自己经验而定（我习惯用0.4％的）。具体方法如下：先将预用的水加热至60~70℃，然后加入CMC－Na，边加边搅拌，使之溶解，即得。
2. 与硅胶混合：CMC－Na溶液与硅胶的比例为3：1。具体方法如下：先将CMC－Na溶液倒入自动搅拌器或研钵中，然后加入硅胶，搅匀即可。若是在研钵中研磨，按一个方向研磨，自下而上，然后自上而下，以赶尽气泡为佳。
3. 铺板：但此过程中最关键的是板子边缘铺得好坏，手动铺板一定要将玻璃板边缘硅胶涂匀（我习惯用两头掂法，即板下方的中间垫一物体，两头悬空，两手均匀掂动）。而机械铺板要注意板与板之间平整性，或者由高到低排列。
4. 晾干：自然晾干。
5. 活化：将晾干的板子在105℃烘箱中干燥30min，取出，放入干燥器中，备用。
HCl 5%Na2CO3
大黄酸沉淀（粗品）
水层（红色） 乙醚层
HCl 0.25% NaOH
大黄素沉淀（粗品） 水层（红色）
芦荟大黄素、大黄酚、大黄素甲醚沉淀（混合物）