国标法测定大肠杆菌样本的细菌总数

实验目的

实验原理：国标法操作的原理

实验器材：

培养箱，10只移液管，1只250ml锥形瓶，5只大试管，试管架，4个平皿，500ml大烧杯1个，电子天平，纱布，脱脂棉，灭菌锅，PH计或PH试纸，100ml量筒，橡皮手套，超净台

实验药品：

磷酸盐缓冲液，蒸馏水，LB培养基，琼脂，5%NaOH，5%HCl

实验步骤：

一：

10只移液管，1只250ml锥形瓶，5只大试管，4个平皿，500ml大烧杯1个，100ml量筒进行洗涤，然后一起放入高压蒸汽灭菌锅中在121摄氏度条件下灭菌20min。灭完菌后烘干，完成后放入超净台中。

用酒精擦拭超净台，紫外消毒30min

二：

1：用电子天平称取成品LB 3.1241g和琼脂1.8756g放入250ml的洁净锥形瓶中。 2：用量筒量取125ml的蒸馏水加入该锥形瓶中，制成培养基。

3：用棉花堵住该锥形瓶的瓶口，用牛皮纸包住瓶口，用橡皮筋扎牢，再将培养基放入灭菌锅中在121摄氏度之下灭菌20min。

4：灭完菌后放入超净台中备用。

三：

1：取1只无菌250ml锥形瓶，用量筒向其中加入49ml PBS

2：将1ml样品加入到该锥形瓶中，摇匀制成1:50的细菌溶液。

3：取4只试管，编号1—4

4：用无菌移液管分别向4只试管中加入9ml的PBS

5：用1ml无菌移液管从样品中移取1ml菌液加入到1中.震荡试管使菌液均匀。 6：用1ml无菌移液管从1号试管中移取1ml的细菌溶液加入2号试管中，摇匀

7：用另一只1ml无菌移液管从2号试管中移取１ｍｌ细菌溶液，加入3中，摇匀．．．．．．以此类推直至4只试管中均加入了细菌溶液。

9：取4只平皿，编号1—4

10：分别用4只无菌移液管从这4只试管中移取１ｍｌ的菌液置于4只平皿中，加入４５—５０摄氏度温度下的培养基，约１５ｍｍ厚度。缓慢旋转平皿使菌液与培养基混合均匀；待培养基冷凝后倒置。

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邹平县产品质量监督检验所检验原始记录

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主检：                  校核：            检验日期：        年   月   日

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出口食品中大肠菌群、粪大肠菌群和大肠杆菌检验方法

Method for examination of coliform，fecal coliform and escherichia coli in food for export

SN 0169—92

代替ZB X09 002—86

1 主题内容与适用范围

本标准规定了出口食品中大肠菌群、粪大肠菌群和大肠杆菌的检验方法。

本标准适用于出口食品的检验。

2 设备和材料

2.1 吸管：1mL，具0.1mL刻度；5mL和10mL，具1mL刻度。

2 2 水浴箱：44.5±0.5℃。

2.3 培养箱：36±1℃，44.5±0.5℃。

2.4 冰箱：0～5℃和-15～-20℃。

2.5 均质器。

2.6乳钵和研棒。

2.7 平皿：直径90mm。

2.8天平：感量0.1g。

2.9 显微镜。

2.10 稀释瓶：100mL、200mL和500mL三角烧瓶及广口瓶。

2.11 玻璃珠：直径约5mm。

2.12菌落计数器。

3 培养基及试剂

3.1 月桂基硫酸盐胰蛋白 (LST)肉汤。

3.2 煌绿乳糖胆盐(BGLB)肉汤。

3.3 EC肉汤。

3.4 伊红美蓝琼脂(EMB)。

3.5营养琼脂斜面。

3.6 色氨酸肉汤。

3.7 MR-VP培养基。

3.8 Korser氏枸椽酸盐肉汤。

3.9 结晶紫中性红胆盐琼脂(VRBA)。

3.10 Butterfield氏磷酸盐缓冲稀释液。

3.11 生理盐水。

3.12 革兰氏染色液。

3.13 Kovacs氏靛基质试剂。

3.14 甲基红指示剂。

3.15 Voges—pros kauer(V—P)试剂。

4 样品制备

4.1 以无菌操作取有代表性的样品。如有包装则用75％乙醇在开口处擦拭后取样。若不能及时检验，应将冷冻样品置于-15℃保存；非冷冻而易腐的食品，应置于4℃冰箱保存。检验前冷冻样品可于2—5℃18h内解冻，或在45℃以下15min内解冻。

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大肠杆菌紫外线诱变及抗药性菌株筛选

1.前言

抗生素能破坏细菌细胞壁的结构，使细菌的繁殖和生长受到抑制。但某些细菌对抗生素表现出抗性，原因是其基因发生了改变，产生能抵抗抗生素的性状。在自然情况下，细菌的基因突变率很低，而且突变是不定向的，因此在自然条件下，想要获得有抗性的细菌是很困难的。当给与适当的物理条件时，其突变率会大大增加。如当用α射线、β射线、γ射线、Χ射线、中子和其他粒子、紫外线、微波等物理因素辐射时，能够促进遗传物质突变。DNA 对紫外线（UV）有强烈的吸收作用，尤其是碱基中的嘧啶，它比嘌呤更为敏感。紫外线引起DNA 结构变化的形式有 DNA 链断裂、碱基破坏、胸腺嘧啶二聚体等。因此，紫外线通常作为诱变剂，用于微生物菌种选育。一般细胞分裂越旺盛，诱变剂量越大，突变率高，诱变最有效的波长253~265 nm。选择合适的诱变剂量对于获得较高突变率十分关键，过高或过低的辐射剂量会导致菌株死亡或诱变不充分而降低诱变效果。

在紫外线诱变下，菌株发生不定向的突变，想要得到需要的特向变异必须对诱变后的菌株做筛选。本实验想要得到的是能够抵抗抗生素的菌株，因此可以用抗生素培养基作为筛选培养基对菌种进行筛选。若菌株没有发生定向突变，则该菌株不能在抗性培养基上正常生长，只有发生了定向突变才可能在筛选培养基上正常生长。

紫外线对于菌株有诱变作用外，对菌株还有较强的致死作用，因为紫外线改变了菌株的基因结构导致菌株无法正常生长繁殖。

因此，通过本实验的操作，在合适的照射剂量的设置下，比较不同不同照射剂量下的致死效果和突变率，并初步分析两者的相关性。在分析死亡曲线和诱变率曲线的基础上，能了解诱变育种的机理和方法，为做进一步的诱变实验做准备。

2.材料和方法

2.1实验材料、仪器和试剂

菌种：大肠杆菌

仪器：超净台、离心机、高压灭菌锅、培养箱、磁力搅拌器、培养皿、涂布器、移液管、移液器

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大肠杆菌的检测：大肠菌群测定的操作细则

大肠菌群系指一群能发酵乳糖、产酸产气、需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽胞杆菌。该菌主要来于人畜粪便,故以此作为粪便污染指标来评价食品的卫生质量,推断食品中有否污染肠道致病菌的可能。

食品中大肠菌群数系以100mL(g)检样内大肠菌群最可能数(MPN)表示。 1 设备和材料

1.1 温箱：36±1℃。 1.2 冰箱:0～4℃。 1.3 恒温水浴 :44.5±0.5℃。 1.4 天平。 1.5 显微镜。1.6 均质器或乳钵。 1.7 平皿:直径为90mm。 1.8 试管。 1.9 吸管。 1.10 广口瓶或三角烧瓶:容量为500mL。 1.11 玻璃珠:直径约5mm。

1.12 载玻片。 1.13 酒精灯。 1.14 试管架。

2 培养基和试剂

2.1 乳糖胆盐发酵管:按GB 4789.28中4.9规定。

2.2 伊红美蓝琼脂平板:按GB 4789.28中4.25规定。

2.3 乳糖发酵管:按GB 4789.28中4.10规定。

2.4 EC 肉汤:按GB 4789.28中4.11规定。

2.5 磷酸盐缓冲稀释液:按GB 4789.28中3.22规定。

2.6 生理盐水。

2.7 革兰氏染色液:按GB 4789.28中2.2规定。

3.1 检样稀释

3.1.1 以无菌操作将检样25mL(或g)放于有225mL灭菌生理盐水或其他稀释液的灭菌玻璃瓶内(瓶内予置适当数量的玻璃珠)或灭菌乳钵内,经充分振摇或研磨做成1:10的均匀稀释液。固体检样最好用均质器,以8 000-10 000 r/min的速度处理1min,做成1:10的均匀稀释液。

3.1.2 用1mL灭菌吸管吸取1:10稀释液1mL,注入含有9mL灭菌生理盐水或其他稀释液的试管内,振摇试管混匀,做成1:100的稀释液。

3.1.3 另取1mL灭菌吸管,按上条操作依次做10倍递增稀释液,每递增稀释一次,换用1支1mL灭菌吸管。

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大肠菌群及检验 一、大肠菌群介绍

大肠菌群并非细菌学分类命名，而是卫生细菌领域的用语，它不代表某一个或某一属细菌，而指的是具有某些特性的一组与粪便污染有关的细菌，这些细菌在生化及血清学方面并非完全一致，其定义为：需氧及兼性厌氧、在37℃能分解乳糖产酸产气的革兰氏阴性无芽胞杆菌。一般认为该菌群细菌可包括大肠埃希氏菌、柠檬酸杆菌、产气克雷白氏菌和阴沟肠杆菌等。

大肠菌群分布较广，在温血动物粪便和自然界广泛存在。调查研究表明，大肠菌群细菌多存在于温血动物粪便、人类经常活动的场所以及有粪便污染的地方，人、畜粪便对外界环境的污染是大肠菌群在自然界存在的主要原因。粪便中多以典型大肠杆菌为主，而外界环境中则以大肠菌群其他型别较多。

大肠菌群是作为粪便污染指标菌提出来的，主要是以该菌群的检出情况来表示食品中有否粪便污染。大肠菌群数的高低，表明了粪便污染的程度，也反映了对人体健康危害性的大小。粪便是人类肠道排泄物，其中有健康人粪便，也有肠道患者或带菌者的粪便，所以粪便内除一般正常细菌外，同时也会有一些肠道致病菌存在（如沙门氏菌、志贺氏菌等），因而食品中有粪便污染，则可以推测该食品中存在着肠道致病菌污染的可能性，潜伏着食物中毒和流行病的威胁，必须看作对人体健康具有潜在的危险性。

大肠菌群是评价食品卫生质量的重要指标之一，目前已被国内外广泛应用于食品卫生工

作中。

二、大肠菌群检验方法：

由于大肠菌群指的是具有某些特性的一组与粪便污染有关的细菌，即：需氧及兼性厌氧、在37℃能分解乳糖产酸产气的革兰氏阴性无芽胞杆菌。因此大肠菌群的检测一般都是按照它的定义进行。

目前国内采用的进出口食品大肠菌群检测方法主要有国家标准和原国家商检局制订的行业标准。两个标准方法在检测程序上略有不同。

（一）国家标准：国家标准采用三步法，即：乳糖发酵试验、分离培养和证实试验。

乳糖发酵试验：样品稀释后，选择三个稀释度，每个稀释度接种三管乳糖胆盐发酵管。36±1℃培养48±2h，观察是否产气。

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大肠杆菌的检测方法

一、大肠杆菌的生物学特性

大肠杆菌为两端钝圆的短小杆菌，一般约0.5-0.8μm*1.0-3.0 μm，多单独存在或成双，但不呈长链排列。约50%的菌株有周生鞭毛，但多数只有1-4根，一般不超过10根，故菌体动力弱。多数菌株有菌毛，有的有荚膜或微荚膜，不形成芽孢，对普通碱性染料着色良好，革兰氏染色阴性。

二、培养特性：

大肠杆菌合成代谢能力强，在含无机盐、铵盐、葡萄糖的普通培养基上生长良好。最适生长温度为37℃，在42-44 ℃条件下仍能生长，生长温度范围15-46 ℃。

在普通营养琼脂上有3中菌落形态：

1）光滑型：菌落边缘整齐，表面有光泽、湿润、 光滑、呈灰色，在生理盐水中易分散；

2）粗糙型：菌落扁平、干涩、边缘不整齐，易 在生理盐水中自凝；

3）黏液型：常为含有荚膜的菌株

三、大肠菌群及大肠杆菌测定——MPN法检验流程（FDA BAM） 检样50g+450ml稀释液，适当十倍稀释样品，选择3个适宜的连续稀释度的样品稀释液，

每个稀释度接种三管LST肉汤（每管9mlLST肉汤并加有导管），每管接种1mL，如没有产气，则报告为阴性；如有产气，

则分别接种BGLB肉汤管（35 ± ℃ ，48 ± 2h）和EC肉汤（44.5±0.5 ℃ （水浴培养）24 ± 2h ~48 ± 2h ），对于接种BGLB肉汤管的查MPN表报告结果，验证是否为大肠菌群；对于接种EC肉汤的产气管接种EMB平板（35℃、18~24h）从EMB平板上挑取5个可疑菌转接到PCA斜面，进行革兰氏染色、IMVC生化鉴定、接种LST复检产气查MPN表报告结果验证是否为大肠杆菌。

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