蛋白质测定方法

——化学报告

蛋白质的检测

              

     由上表可大致了解五种检测蛋白质的方法，下面以实验的形式进行详细阐述：

1　材料与方法

1.1　仪器材料

(1)仪器:凯氏定氮仪、紫外分光光度计、可见光分光光度计、工作离心机、布氏漏斗、抽滤泵。

(2)试剂及原材料:牛奶、酸奶、豆浆、0.12mol/LpH=4. 7醋酸- 醋酸钠缓冲液、乙醇-乙醚等体积混合液、浓H2SO4 、40%氢氧化钠、30%过氧化氢、2%硼酸溶液、0. 050molPL标准盐酸溶液、硫酸钾- 硫酸铜接触剂、混合指示剂、标准蛋白溶液、双缩脲试剂、考马斯亮蓝G- 250试剂。

1.2　实验方法

(1)凯氏定氮法测定蛋白质含量

将待测样品与浓硫酸共热,含氮有机物即分解产生氨(消化) ,氨又与硫酸作用,变成硫酸铵。为了加速消化,可以加入CuSO4 作催化剂和加入K2SO4 以提高溶液的沸点,而加入30%过氧化氢有利于消化溶液的澄清。消化好的样品在凯氏定氮仪内经强碱碱化使之分解放出氨,借蒸汽将氨蒸至定量硼酸溶液中,然后用标准盐酸溶液进行滴定,记录,计算出样品含氮量。每个样品做三次重复测定,取平均值。

(2)紫外吸收法测定蛋白质含量

蛋白质分子中,酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸残基的苯环含有共轭双键,使蛋白质具有吸收紫外光的性质,吸收峰在280nm处,其吸光度(即光密度值)与蛋白质含量成正比。此外,蛋白质溶液在238nm的光吸收值与肽键含量成正比。利用一定波长下,蛋白质溶液的光吸收值与蛋白质浓度的正比关系,可以进行蛋白质含量的测定。

紫外吸收法简便、灵敏、快速,不消耗样品,测定后仍能回收使用。低浓度的盐,例如,

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实验二 蛋白质含量的测定（Folin-酚法）

一、研究背景

  蛋白质是与生命、与各种形式的生命活动联系在一起的物质。可以说没有蛋白质就没有生命。它是机体的重要物质基础，机体的每一个细胞和所有重要组成部分都有蛋白质参与。蛋白质的结构千差万别，具有多种多样的生物学功能：例如酶的催化作用、激素的生理调节作用、血红蛋白的运载作用、肌纤维蛋白的收缩作用、机体的免疫作用和胶元蛋白的支架作用等。蛋白质不仅是构成各类细胞原生质的主要物质，而且核蛋白及其相应的核糖核酸还是遗传的主要物质基础。因此，建立正确的测定蛋白质含量的方法很重要。本实验所采用的Folin-酚法就是其中一种。

二、实验原理

Folin-酚法是一种根据蛋白质侧链基团中的特殊残基进行含量测定的简便而灵敏的方法。其理论基础是蛋白质中所含酪氨酸和色氨酸的残基数与蛋白质成正比。

Folin-酚试剂由两部分组成：试剂甲相当于双缩脲试剂，在碱性条件下含一定量的二价铜离子，Cu ²⁺在OH^-条件下可与蛋白质中的肽键形成络合物。试剂乙为磷钨酸和磷钼酸混合液，在碱性条件下极不稳定，易被酚类化合物还原，生成钼蓝和钨蓝混合物而呈蓝色反应，在650nm下有光吸收。由于蛋白质中存在含有酚基的氨基酸，所以上述络合物可与试剂乙反应，而其反应颜色的深浅与蛋白质的含量成正比，从而可以据此测定蛋白质的含量。

三、仪器与试剂

1、仪器

 （1）722型分光光度计：上海精密科学仪器有限公司

 （2）架盘天平：北京天平物华医疗器械有限公司

2、试剂

 （1）试剂甲：相当于双缩脲试剂。

 （2）试剂乙：磷钨酸和磷钼酸混合液。

 （3）250微克/毫升的牛血清白蛋白标准原液

四、实验步骤

  1、配制系列牛血清蛋白溶液

取具塞试管6支，按表一加入牛血清白蛋白标准原液及蒸馏水。编号1~6备用。

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实验三：福林(Folin)-酚试剂法测定蛋白质的浓度

一、 实验目的

1． 学会制备无蛋白血滤液。

2． 掌握Folin－Wu 法测定血糖含量的原理和方法。

3． 掌握7200 型可见分光光度计的使用方法。

二,实验原理

蛋白质或多肽分子中有带酚基酪氨酸或色氨酸，在碱性条件下，可使酚试剂中的磷钼酸化合物 还原成蓝色（生成钼蓝和钨蓝化合物）。蓝色的深浅不蛋白质的含量成正比，可用比色法测定。

三.实验仪器 1． 试管 2． 秱液管 3． 卵清蛋白片 4． 7220 分光光度计

四. 实验试剂 1、碱性硫酸铜溶液 A 液：无水碳酸钠35g，酒石酸钠13g 及碳酸氢钠11g 溶于蒸馏水，秲释定容至 1000ml. B 液：硫酸铜晶体5g，溶于蒸馏水并定容至100ml。 临用时，A 液：

B 液=9：1 混合（体积比），混合液于冰箱中保存（4℃）。 2、标准葡萄糖溶液（0.1mg/ml） (1)1%葡萄糖母液：称取1.000g 葡萄糖，溶于蒸馏水，秲释并定容至100ml。 (2)葡萄糖标准液：取1.0ml 葡萄糖母液于100ml 容量瓶中，加蒸馏水定容。 3、10%钨酸钠溶液： 称取钨酸钠10g，溶于蒸馏水并定容至100 毫升。 4、

0.33mol/LH2SO4 溶液： 于53ml 蒸馏水中加入1ml 的浓硫酸。

五.实验步骤 1、无蛋白血滤液的制备： 用奥氏吸管吸取全血（已加抗凝剂）1ml,缓缓放入100ml 锥形瓶中，加蒸馏水7ml， 摇匀，

溶血后（血液变为红色透明）加10%钨酸钠1ml，摇匀.。 再加

0.33mol/L H2SO41ml，边加边摇，加毕充分摇匀，放置5～15 分钟，至沉淀变 为暗棕色（如丌变色可再加0.33mol/L H2SO41-2 滴）。 用干滤纸过滤。先倾入少许，待滤纸湿润后在全部倒入，如滤液丌清需重新过滤。每 毫升无蛋白血滤液相当于1/10ml 全血。 2、血糖的定量测定： 取25ml 的血糖管3 支，编号。第一支血糖管中加入2ml 蒸馏水（空白管）；第二支血 糖管中加2ml 标准葡萄糖液；用吸管吸取无蛋白血滤液2ml，放入第三支血糖管中。 然后向三支血糖管中各加入2ml 新配制的碱性硫酸铜溶液，同时置于沸水浴中8 分钟，取 出，在流水中迅速冷却后,勿摇动，各加4ml 酸性钼酸盐溶液。 一分钟后，用蒸馏水秲释至25ml，混匀，用7200分光光度计在420nm波长处比色， 以空白管调节零点。

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紫外分光光度法测定蛋白质含量

一、实验目的

1.  学习紫外光度法测定蛋白质含量的原理；

2.  掌握紫外分光光度法测蛋白质含量的实验技术。

二、实验原理

1.测蛋白质含量的方法主要有：①测参数法：折射率、相对密度、紫外吸收等；②基于化学反应:定氮法、双缩脲法、Folin―酚试剂法等。本实验采用紫外分光光度法。

2.蛋白质中的酪氨酸和色氨酸残基的苯环中含有共轭双键，因此，蛋白质具有吸收紫外光的性质，其最大吸收峰位于280nm附近（不同蛋白质略有不同）。在最大吸收波长处，吸光度与蛋白质溶液的浓度服从朗伯―比尔定律。

利用紫外吸收法测蛋白质含量的准确度较差，原因有二：①对于测定那些与标准蛋白质中酪氨酸和色氨酸含量差异较大的蛋白质，有一定误差，故该法适于测定与标准蛋白质氨基酸组成相似的蛋白质；②样品中含有的嘌呤、嘧啶等吸收紫外光的物质，会出现较大干扰。

三、仪器与试剂

TU―1901紫外可见分光光度计、标准蛋白质溶液3.00mg·mL^-1、0.9%NaCl溶液、试样蛋白质溶液。

    10mL比色管、1cm石英比色皿、吸量管。

四、实验步骤

1.绘制吸收曲线

用吸量管吸取2mL3.00mg·mL^-1标准蛋白质溶液于10mL比色管中，用0.9%NaCl溶液稀释至刻度，摇匀。用1cm石英比色皿，以0.9%NaCl溶液作参比溶液，在190~400nm间每隔5nm测一次吸光度Abs，记录数据并作图。

2.绘制标准曲线

用吸量管分别吸取1.0、1.5、2.0、2.5、3.0mL3.00mg·mL^-1标准蛋白质溶液于10mL比色管中，用0.9%NaCl溶液稀释至刻度，摇匀。用1cm石英比色皿，以0.9%NaCl溶液作参比溶液，在波长280nm处分别测其吸光度，记录数据并作图。

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本科学生综合性实验报告

学号              姓名

学院             专业、班级

实验课程名称测定蛋白质含量的三种方法及其比较

教师及职称

开课学期      至学年       学期

            填报时间       年   月    日

云南师范大学教务处编印

一．实验设计方案

二．实验报告

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实验一 蛋白质分子的测定─凝胶层析法

一、     实验原理

凝胶层析法（即凝胶过滤法，gel filtration）是利用凝胶把分子大小不同的物质分离开的一种方法。将凝胶颗粒在适宜溶剂中浸泡，使充分吸液膨胀，然后装入层析柱中，加入欲分离的混合物，再以同一溶剂洗脱，在洗脱过程中大分子不能进入凝胶内部而沿凝胶颗粒间的空隙最先流出柱外，小分子可以进入凝胶内部，流苏缓慢，一直最后流出柱外，从而使样品中分子大小不同的物质得以分离。

凝胶是由胶体溶液凝结而成的固体物质，不论是天然凝胶还是人工合成凝胶，其内部都具有很微细的多空网状结构。凝胶层析法常用的天然凝胶是琼脂糖凝胶（Sepharose），人工合成的凝胶是聚丙烯酰胺凝胶（Bio-gel-P）和葡聚糖凝胶（Sephadex G）。其中葡聚糖凝胶是具有不同孔隙度的立体网状结构的凝胶，不溶于水。

将凝胶装柱后，柱床体积称为“总体积”，以Vt表示。Vt由Vo，Vi与Vg三部分组成，即Vt=Vi+Vg+Vo。Vo为“孔隙体积”、“外水体积”，即存在于柱床内凝胶颗粒外面空隙之间的水相体积；Vi为内体积，即凝胶颗粒内部所含水相的体积；Vg为凝胶本身体积；Ve为洗脱体积，即自加入样品时算起到组分最大浓度（峰）出现时所流出的体积，Ve与Vo及Vi之间的关系为：Ve=Vo+K_dVi，；K_d为样品组分在二相间的分配系数，Kd=(Ve-Vo)/Vi，有效分配系数为Kav，Kav=(Ve-Vo)/(Vt-Vo)。

在一般情况下，凝胶对组分没有吸附作用时，当流动相流过Vt体积后，所有的组分都应该被洗出来，这一点为凝胶层析的特点，与一般层析方法不同。

Ve与分子量的关系：对同一类型的化合物，洗脱特性与组分的分子量有关，流过凝胶柱时，按分子量大小顺序流出，分子量大的走在前面。Ve与分子量的关系为：Ve=K₁-K₂logM，K₁与K₂为常数，M为分子量，通常用Kav代替Ve，建立标准蛋白质分子式量LgM与Kav的标准曲线，称为“选择曲线”。在允许的工作范围内，曲线越陡，则分级越好，而工作坊为越窄。凝佼层析主要决定于溶质分子的大小，每一类型的化合物，如球蛋白类，右旋糖酐类等都有它自己的特殊的选择曲线，可用以测定未知物的M_r，测定时以使用曲线的直线部分为宜。

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蛋白质浓度的测定（Folin-酚试剂法）

【实验目的】

熟悉并掌握用Folin-酚法测定蛋白质浓度的方法。

【实验原理】

    蛋白质（或多肽）分子中含有酪氨酸或色氨酸，能与Folin-酚试剂起氧化还原反应，生成蓝色化合物，蓝色的深浅与蛋白质浓度成正比，可通过绘制标准曲线，用比色法测定蛋白质浓度。

【实验试剂】

1.标准酪蛋白200ug/ml

2.Folin-酚乙液（原液与水按1:1比例混合，实验室已准备）

3.Folin-酚甲液（实验室已准备） A液  4%Na2CO3: 0.2%NaOH=1：1

B液  1%CuSO4 : 2%酒石酸钾钠=1：1

                             A：B= 50：1   混匀

4.样品血清（稀释200倍）

【实验步骤】

1.      准备9支干净的试管，按表一顺序加入试剂

表一

2.      各试管中加入5ml Folin-酚甲液，用旋涡摇匀器充分混合均匀，静置水浴（37度）10min。

3.      各试管中加入0.5ml Folin-酚乙液，用旋涡摇匀气充分混合均匀，静置水浴（37度）30min。

4.      使用分光光度计，用640nm波长进行比色。

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