微生物实验报告

一 环境中的微生物的检测和分离纯化

实验目的：

1 学习并掌握无菌操作技术原理和方法

2 学习用稀释涂布法分离微生物

3 认识微生物存在的普遍性，体会无菌操作的原理

实验材料：

1 土样溶液0.5ml，无菌生理盐水

2 取液器(1000μL一支，100μL一支)，培养箱，培养皿(12个)，无菌有帽试管，三角瓶，无菌涂棒，接种环，1000μL无菌吸头若干，记号笔，酒精灯，火柴，试管架

实验步骤：

A 培养基的制备(已提前制备好)

B 周围环境中的微生物的检测，在牛肉膏蛋白胨培养基平板上作如下实验

         1 取三个平板，用100μL的取液器分别吸取100μL的河水、豆浆、豆奶，均匀加在三个培养基上，并用无菌玻璃涂棒涂布均匀(要多涂几次，时间约1-2分钟，使细菌均匀分布)。

         2 再取三个平板，三个同学分别用手指(未洗过)在培养基上涂抹几秒钟，一个同学对应一个平板。

         3 再取一个平板，其中一个同学将手用肥皂洗过后，再在培养基上涂抹。

         4 再取一个平板，打开皿盖，一个同学对着培养基咳嗽，使口腔中的气流和飞沫落到培养基上。

         5 再取一个平板，打开皿盖，在空气中放置10min左右，关上皿盖。

         6 将上述9个平板放置在35℃的培养箱中培养24h。

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无菌操作技术及其重要性

  杨昆霖1    郑涛1   张雷1   张哲1   李杰2

1.北京大学医学部临床医学08级一班学生  2.北京大学医学部微生物学系副教授

【摘要】  目的：建立无菌观念，认识无菌操作的重要性，学习并掌握基本的无菌操作方法。方法：对暴露于空气中不同时间长短的琼脂培养基进行培养并观察；对不洗的手和洗过手但擦干与没擦干的手在培养基上按手印并对培养基进行培养；运用无菌接种技术接种并培养大肠埃希氏菌和表皮葡萄球菌；运用紫外光线照射培养中的细菌并观察被照射部分的菌落生长情况。结果：暴露在空气中的培养基上生长出了菌落，且菌落的数量随暴露在空气中的时间增长而增加；洗手组和不洗手组均出现了数量不等的菌落；紫外线照射下的培养基上没有菌落生长或菌落少于非照射组。

【关键词】  无菌操作；接种；培养；重要性

尽管我们的肉眼无法直接看到细菌的踪影，但在空气中，人体皮肤表层和深层，细菌却是无处不在。而在实验研究中，保证实验用具和试验用微生物不被杂菌污染显得尤为重要。生活中或是实验中，人们常常可以通过各种方法（洗液清洗、紫外杀菌等）来达到减少细菌或是灭菌的状态。本实验通过细菌培养的方法验证空气和人的皮肤存在大量细菌，运用紫外光照射培养基验证紫外线灭菌作用。

1 材料与方法

1.1材料

器材：琼脂平板培养基；洗手液；擦手巾；紫外灯；恒温培养箱；接种环；酒精灯；打火机。

菌种：大肠埃希氏菌；表皮葡萄球菌。

1.2方法

1.2.1  空气暴露组  把实验室里的八个小组按顺序依次编号为1-8组（本组为第二组），从第1组开始至第8组，分别取一块琼脂培养基，依次将培养基暴露在实验室空气中5min、10min、15min、20min、25min、30min、35min、40min；然后将培养基放入恒温箱培养两天后取出观察。

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一、实验目的

1、学习并掌握动物细胞培养的无菌操作技术。

2、学习并掌握细胞传代培养的方法。

3、学习并掌握用倒置荧光显微镜观察细胞细胞形态。

二、实验原理

细胞培养（cell culture）：细胞在体外条件下生长，细胞不再形成组织。

动物细胞培养（animal cell culture）就是从动物机体中取出相关的组织，将它分散成单个细胞（使用胰蛋白酶或胶原蛋白酶）然后，放在适宜的培养基中，让这些细胞生长和增殖。由于细胞具有生长和自我复制的能力，为细胞体外培养和研究提供可能。

动物细胞培养可分为原代培养和传代培养。

原代培养（primary culture）即直接从动物机体分离、获得组织细胞，在无菌条件下，用胰蛋白酶消化或机械分散等方法，将动物组织分散成单个细胞开始首次培养长出单层细胞的方法。

传代培养（subculture）当细胞生长增值达到一定密度，用胰蛋白酶将细胞消化分散成单细胞，将细胞转移到新的培养皿中扩大培养的方法。

    高等生物是由多细胞构成的整体，在整体条件下要研究单个细胞或某一群细胞在体内的功能活动是十分困难的，但如果把或细胞拿到体外培养、增殖并进行观察和研究，则方便简单的多。被培养的动物细胞是非常好的实验对象和实验研究材料，对体外培养的活细胞进行研究可以帮助人类探索防治各种疾病途径和机制，也可以人为地诱导和改变细胞的遗传性状和特性，因此，动物细胞体外培养技术是研究细胞分子机制非常重要的实验手段，被广泛应用于医学、生物技术、基因工程等研究领域。

三、细胞培养相关设施及材料

1、细胞培养室

无菌操作区：只限于细胞培养及其它无菌操作，与外界隔离。

孵育区：培养箱设定的条件为37℃，5%CO₂。

制备区：培养液及有关培养用液体的制备，液体制备后应该在净化工作台进行过滤除菌。

储藏区：包括冰箱、干燥箱、液氮罐等。

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无菌操作基本技术

1.在开始实验前要制定好实验计划和操作程序。有关数据的计算要事先做好。根据实验要求，准备各种所需器材和物品、清点无误后将其放于操作场所(培养室、超净台)内，然后开始消毒，以避免往返拿取造成污染机率增大。

超净工作台台面每次实验前用75％酒精擦拭，按照顶板→侧壁→器械→挡风玻璃→操作台面的顺序对超净台内部进行彻底的消毒。然后开启超净台和无菌培养室的紫外灯照射30min，关闭紫外，启动风机运转15分钟后，方可开始实验操作。在工作台面消毒时切勿将培养细胞和培养用液同时照射紫外线。

2. 无菌操作工作区域应保持清洁及宽敞，必要物品，例如试管架、吸管吸取器或吸管盒等可以暂时放置，其它实验用品用完即应移出，以利于气流流通。实验用品以75 % 酒精擦拭后放入无菌操作台内。实验操作应在台面中央的无菌区域，勿在边缘之非无菌区域操作。

3. 小心取用无菌实验物品，避免造成污染。勿碰触吸管尖端或容器瓶口，亦不要在开口容器的正上方操作。容器打开后，以手夹住瓶盖并握住瓶身，倾斜约45°角取用。

4. 操作人员应注意自身安全，须穿戴实验衣及手套后才进行实验。对于来自人类或是病毒感染之细胞株应特别小心操作，并选择适当等级的无菌操作台。操作过程中，应避免引起气溶胶的产生，小心毒性药品，例如DMSO，并避免尖锐针头的伤害等。

5. 每次操作只处理一株细胞株，且即使培养基相同也不共享培养基，以避免失误混淆或细胞间污染。为拿取方便，工作台面上的用品要有合理的布局，原则上应是右手使用的东西放置在右侧，左手用品在左侧，酒精灯置于中央。工作由始至终要保持一定顺序性，组织或细胞在未做处理之前，勿过早暴露在空气中。同样，培养液在未用前，不要过早开瓶；用过之后如不再重复使用，应立即封闭瓶口。

6. 实验完毕后，关闭超净台风机，以75 %酒精擦拭操作台面及其他实验物品，将多余的物品拿出超净台，打开风机运转15 min，关闭风机并打开紫外灯照射30min。

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动物细胞培养

一、试验目的。

1、掌握无菌操作技术。

2、掌握原代和传代细胞培养。

3、掌握细胞冷冻和复苏技术。

4、了解培养成纤维细胞的形态。

二、试验原理。

将动物机体的组织从机体中取出，经各种酶（常用胰蛋白酶）、螯合剂（常用EDTA）或机械方法处理，分散成单细胞，置合适的培养基中培养，使细胞得以生存、生长和繁殖，这一过程称原代培养。

细胞在培养瓶长成致密单层后，已基本上饱和，为使细胞能继续生长，同时也将细胞数量扩大，就必须进行传代（再培养）。 传代培养也是一种将细胞种保存下去的方法。同时也是利用培养细胞进行各种实验的必经过程。悬浮型细胞直接分瓶就可以，而贴壁细胞需经消化后才能分瓶。

对具有移动特性的稳定细胞系或细胞株进行长期保存，一方面可以作为细胞研究的试验材料，另一方面可以做细胞制品的生产材料。目前广泛应用的细胞保存方法是低温冷冻保存法，。细胞的冷冻保存的原则是慢冻快融，这样做是为了防止细胞由于冷冻过程中产生了冰晶而发生细胞破裂。

三、实验器材及药品。

器材：怀孕的小白鼠、培养箱、培养瓶、培养皿、移液器、眼科剪、镊子、酒精灯、离心机、水浴锅、倒置显微镜、CO₂培养箱、超净工作台、离心管、高压灭菌锅、试管架等。

药品：小牛血清、DMEM合成培养基、抗生素、DMSO冷冻剂、胰酶、PBS缓冲液等。

四、实验操作。

1、消毒灭菌。

将实验所需用到的工具（如枪头、培养皿、眼科剪、镊子以及每个人的实验服等）集中灭菌、烘干。配制75%的酒精以备实验时所需。

2、培养基的配制。

分别取10ml的小牛血清、90ml的DMEM合成培养基，将两种培养基混合在一起，再向其中加入1ml的抗生素，吹打混匀就得到了细胞培养的培养液。

3、原代培养。

（1）、准备。将实验过程中会用到的工具以及药品全部放在超净工作台上进行紫外消毒灭菌。实验开始前带好乳胶手套，用酒精对手进行消毒。将怀孕的小白鼠放在酒精中杀死，取出子宫内的胚胎组织。

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无菌技术操作试卷答案

一．填 空

1．以开启过的未被污染的溶液可保存。

2．无菌盘的有效期不超过小时。

3．无菌包的有效期一般为天，或应重新灭菌。

4．一套无菌物品只供一位患者使用，以防

5．无菌包外应注明物品的

6．消毒液应浸没无菌持物钳轴节以上cm处。

7．打开无菌容器，将盖平移离开容器，向上置于稳妥处或拿在手中。

8．手持无菌容器时，应托住容器，手指不可触及容器及

9．戴手套时未戴的手不可触及手套的

10．打开包后的干镊子罐、持物钳应当

二．判 断 题

1．已倒出的无菌溶液没有用可以再倒回瓶中。（× ）

改错：无菌溶液倒出后，不可再倒回瓶中。

2．无菌持物钳用于夹取无菌物品，可夹取无菌纱布，无菌治疗巾，也可夹取油纱布。（ × ） 改错：无菌持物钳不能用以换药和消毒皮肤，不能触碰未经消毒的物品，不能用持物钳夹取油纱布及直接伸入药瓶内醮取药液。

3．高压蒸汽灭菌的纱布敷料、棉球打开未用完，最长保存期为24小时。（ √ ）

4．半铺半盖法铺无菌盘时，治疗巾的上层向远端呈扇形折叠，开口边向外。（

5．一个无菌容器内可以放两把无菌持物钳。（ × ）

改错：一个无菌容器内只可放一把无菌持物钳。

三．选 择 题

1．取无菌溶液时，最先检查（ B ）

A、有无裂缝 C、有效期 D、瓶盖有无松动 E、溶液的浓度 取无菌溶液时，要先核对瓶签（药名、浓度、剂量、有效期），检查瓶盖有无松动，瓶口有无裂缝，无菌溶液内有无沉淀、浑浊、变色等。

2．无菌持物钳的正确使用方法是（ B ）

A、取放无菌持物钳时，将钳端闭合

C、钳端向上，用后立即返回

D、门诊应每周更换一次 √ ）

E、一个容器内最多能放两把

无菌持物钳的正确使用方法：

①手固定在持物钳上端的两个圆环或镊子上1/3部分。②保持头端向下，闭合钳端，垂直取出，钳端不可倒转向上。③用后闭合钳端，立即垂直放回容器，浸泡时轴节松开。④到远距离取物时，应将持物钳和容器一起移至操作处。④无菌持物钳及其浸泡容器每周清洁、消毒一次，更换消毒液，使用频率较高的应每天清洁、灭菌。⑤不可用无菌持物钳夹取油纱布，防止油粘于钳端而影响效果。

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实验十二 微生物实验操作基础——灭菌及无菌操作

一、目的要求 学习灭菌的方式方法，区别几种灭菌方式的相同点和不同点。掌握实验室无菌操作的操作方法和注意事项，体会无菌操作技术在微生物研究中的重要性。

二、知识介绍

灭菌技术sterilization

为什么要灭菌？（杂菌污染的后果）

1.营养基质或产物被消耗损失；

2.抑制生产菌的生长；

3.抑制产物的生物合成；

4.杂菌繁殖导致培养液性质（如pH）改变，造成生物反应异常。

灭菌原理与方法

灭菌(sterilization）是指利用物理或化学方法，杀灭或去除物料或设备中所有微生物的技术或 工艺过程。灭菌方法有化学物质灭菌、辐射灭菌、过滤介质除菌和热灭菌等。

（一）、化学物质灭菌

通过改变微生物细胞膜的渗透性，或者损伤细胞膜，影响微生物细胞的正常代谢。

不适合于培养基的灭菌，只适合于局部空间或某些器械的消毒。

1.无机酸、碱及盐类

酸碱的杀菌能力主要由其电离度而定，电离出得氢离子或氢氧根离子浓度越高，杀菌力越强。

盐溶液的杀菌力与其浓度成正比。

（腌咸菜可以保藏很长时间而不染菌）

2.重金属盐

杀菌原理是重金属盐使细胞中蛋白质失活。

比如升汞。

服食牛奶、

鸡蛋等高蛋白含量食物可解毒。

3.氧化剂

高锰酸钾

4.有机化合物

乙醇：脱水、使蛋白质变性和沉淀，70~75%最有效。

(二)、辐射灭菌

1.紫外线：诱导胸腺嘧啶二聚体的形成，从而抑制了DNA的复制；空气在紫外线照射下产生臭 氧，臭氧也具有一定的杀菌作用。

2.X射线、γ射线：能量极高，被菌体吸收后，菌体内的水和有机物产生强烈的离子化反应，形成OH-、过氧化氢和有机过氧化物，这些过氧化物阻碍微生物的代谢活动而导致菌体迅速死亡。

（三）、过滤介质除菌

工业上利用过滤的方法制备大量的无菌空气，供好氧微生物的深层培养使用。

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