自我总结的Westen Blot步骤，简单实用！

蛋白质的提取

（整个过程冰上进行）

一．组织膜蛋白

裂解液 bufferA+1%蛋白酶抑制剂

蛋白保存液 40%SDS+60%RIPA+1%蛋白酶抑制剂

1.-80°C冰箱中取出组织放入研磨管中（研磨管和配套的研磨棒事先用去离子水冲洗，用纸吸干水)按600-700μl/100mg组织加裂解液研磨（研磨后研磨管和研磨棒用去离子水冲洗，用纸吸干水）

2.用1000枪转入1.5ml离心管中4°C离心，1500转15min

3.用1000枪将上清转入差速离心专用离心管中（离心管事先用去离子水冲洗）用裂解液配平

4.差速离心33000-35000转（45000g）30min

5.弃上清，沉淀加入150μl左右蛋白保存液（根据沉淀的量调整）用枪来回吹打使沉淀溶解，枪头在液面下，尽量不要出沫

6.将上述液体分装到0.5ml离心管中，每管20-25μl，留一管-20°C保存测浓度，其余放入-80°C保存

二．组织总蛋白

裂解液 40%SDS+60%RIPA+1%蛋白酶抑制剂

1.-80°C冰箱中取出组织放入研磨管中（研磨管和配套的研磨棒事先要用去离子水冲洗，用干净的纸擦干)按600-700μl/100mg组织加裂解液研磨（研磨后研磨管和研磨棒用去离子水冲洗，用纸吸干水）

2.用1000枪转入1.5ml离心管中4°C离心，13500转30min

3.取上清分装到0.5ml离心管中，每管20-25μl，留一管-20°C保存测浓度，其余放入-80°C保存

三．细胞总蛋白

裂解液 RIPA+1%蛋白酶抑制剂

1.将培养瓶中培养液倒掉，加入PBS冲洗5-6遍，倒掉PBS，用枪吸出倒不尽的PBS

2.每瓶加100-150μl裂解液，用细胞刮刀尽量将细胞刮下来（刮刀用前去离子水冲洗，用纸吸干水，用完一样处理）用200枪转入1.5ml离心管中

3.超声破碎细胞，频率80-100间，超声探头（用前用纸擦，用后用纸擦并盖上盖）插入液面下，超声3-5s停3-5s，总共20s左右，停止5min左右

4.重复上步4-6次

5.4°C离心13500转15min

6.取上清分装到0.5ml离心管中，每管40μl，留一管-20°C保存测浓度，其余放入-80°C保存。

蛋白质浓度的测定

工作液（BCA试剂B液：BCA试剂A液=1：50）

1.用100枪将19μl PBS加入96孔板（两边不加，测浓度不准）

2.用2.5枪加入1μl待测样品（加样时枪头在液面下，提抢时贴壁，尽量不产生气泡)

3.用200枪加入200μl工作液，混匀（枪头在液面下，不产生气泡）

4.放入37°C孵箱30min

5.用酶标仪测浓度，记录数据

凝胶的配置

一． 分离胶的配置：

1. 将胶板用自来水冲洗干净（否则配出的胶会不均匀），用去离子水冲洗。将胶板固定在架子上，加入去离子水至矮板高度，等待3~4分钟，测试是否漏水。期间可以准备配胶时所需要的溶液：

去离子水：室温放置

30%丙烯酰胺：4℃放置，神经毒性

TRIS—HCL（ph8.8）：4℃放置

TRIS—HCL（ph6.8）：4℃放置

10%SDS（自配）：室温放置

10%AP（现配现用）：避光

TEMED：室温放置，神经毒性

2. 根据所需蛋白质的分子量确定所要配制多大浓度的胶。本实验采用的胶为10%的分离胶，2块胶版配置25ml即可。按照如下的量进行配制分离胶：

去离子水：9.9ml

30%丙烯酰胺：8.3ml

TRIS—HCL（ph8.8）：6.3ml

10%SDS（自配）：0.25ml

10%AP（现配现用）：0.25ml

TEMED：0.01ml

配置时要将液体混匀，加入最后两种物质的速度要快，因为丙烯酰胺是促凝剂，凝聚的物质为APH和TEMED。将配好的分离胶倒入胶板中（倒入量为胶板高度的3/4）加入去离子水封住，防止空气进入，排除气泡。加去离子水时要轻，防止将上层的分离胶稀释。通常分离胶需要30~35分钟即可，凝固后可以看到用一条直线。

3. 在配好的分离胶上层加入TRIS—HCL（ph6.8）作为一种缓冲，因为积层胶用的是TRIS—HCL（ph6.8）。然后配制积层胶：

去离子水：5.5ml

30%丙烯酰胺：3.5ml

TRIS—HCL（ph6.8）：1.5ml

10%SDS（自配）：0.08ml

10%AP（现配现用）：0.08ml

TEMED：0.008ml

配好后将TRIS—HCL倒出，倒入积层胶，插入梳子（梳子要用去离子水冲洗干净，并将去离子水甩掉，否则会在胶板上留下不能用的孔道），插梳子的时候要排除气泡，从一端向另一端推。20分钟即可凝固，拔出梳子。

将配好的胶板放入装有去离子水的饭盒中，防止胶中的水分蒸发，发生缩胶现象。

电泳液和转膜液的配制

1. 电泳液：Gly15.0g，Tris-base3.02g，SDS1g，1000ml 去离子水，室温保存

2. 转膜液：Gly14.4g，Tris-base3.00g，甲醇100ml，900ml去离子水，4℃保存

蛋白质样本的处理

1. 从-80℃冰箱中取出提好的蛋白质，按照算好的蛋白，ripa,loading将蛋白稀释到同一个体积。（此操作过程在冰域中进行）

蛋白质的体积 X= 40μg/[（1.3484*OD值-0.0799）*20]

Ripa的体积 Y=体积最大的蛋白质补整-X

Loading的体积Z=1/4(X+Y)

2. 煮样：100℃，5min。（将管外的水擦干净）

电泳过程

1. 将电泳槽准备好，胶板的矮面朝里，加入电泳液，先在里面和外面个加入一半的电泳液，排净气泡后加满。

2. 上样，上样量为8μl。上样时要慢，如果担心样的中央处有凹陷，那就在边处让样流下。

3. 按照“红对红，黑对黑”的原则安装电极。开始跑电泳。先恒压70v使蛋白质跑到同一条起跑线上，待跑至分离胶上时，改为100v，使溴酚蓝全部跑出时停止。电压越小跑的越好。

转膜过程

1.剪好滤纸和NC膜，滤纸要比膜小1~2cm，在转膜液中浸泡。

2.准备白色的矮一些的盒子，里面装好转膜液，将膜取下，取得过程中要注意不要将膜弄破。

3.制作“三明治”，夹板黑色的一面朝向桌子，第一层为海绵，第二层为滤纸，第三层为胶，第四层为滤纸，这时不要急于将最后一层海绵盖上，先将前面三层中的气泡赶走，然后再加入第五层海绵。夹紧，不要让夹板扭动。

4.放入“三明治”时要按照“黑对黑”的原则放入。在倒满转膜液之前不要忘记将一个冰盒放在转膜槽内。将转膜槽放在装满冰的盆里，开始转膜。我们需要的分子量范围是：>250kd~31kd，我们转膜的条件为恒压70v，2h。

封闭

1. 封闭液的配制（5%）：将10g脱脂奶粉加入到200mlPBS中，在漏斗中过滤。

2. 将膜取出，放在去离子水中冲洗一下，放入封闭液中。

3. 放在摇床上封闭2h。

一抗的孵育

1. 将膜从封闭液中取出，用PBS冲洗3次，每次10min。按照分子量将膜剪开。

2. 一抗有两种孵育方法：一、室温孵育：在桌面上铺一张纸，将剪好的膜放在纸上，加上相应的一抗。二、过夜孵育：准备夹链袋，将膜用镊子放入，但是不能碰到膜的表面，将抗体加入，不能有气泡。在室温下摇动1h（可以将枪按到一档）4℃过夜。

3. APP(1:200),Navβ2（1：200），Nav1.2(1:200),NR1(1:200),BACE1(1:1000),GAPDH(1:1000)

二抗的孵育

1. 将膜从夹链袋中取出,一抗回收放在PBST中冲洗3次，10min一次。

2. 二抗在暗室中进行，GAPDH二抗用800鼠（1：4000），其他用700兔（1：4000）。

3. 二抗孵育1h。

4. 洗膜：PBST冲洗3次，每次10min。最后再用PBS冲洗一次。扫膜。

第二篇：western Blot经验总结

1.抗体的选择

对于国内的大多数实验室来讲，做western blot实验选择抗体是个头疼的问题。原因很简单，买进口抗体捉襟见肘，买国产抗体得需要大无畏的勇气。

进口抗体一般不会出现闪失：abcam品种全，质量过硬，但价高（3400元/100微升），而且说是100微升，但至多能吸出来90微升；Sigma的价最贵；比较有性价比的是CST的抗体，现在好像是2200元/100微升，我前后用过二十几种，1:1000的稀释比下，还没有失过手，100微升通常能完成所有的免疫组化和western blot实验，还有一个优点是通常量比100微升多出来10微升，唯一的不足是CST的品种实在不多。Santa的多克隆抗体质量可以，但是选用Santa的单抗还是有风险，估计这也是业界共识了吧。

进口抗体国内分装包装我也用过不少，大概好抗体的比例约为50%，如果能做出来，也存在一个问题，就是抗体大多只能用一次。

国产抗体比较知名的就几家，但质量确实不敢恭维。

我也帮别人自制过抗体，再用抗原亲和纯化。效价非常不错，夸张的时候1：10000都能做出条带

2.Western Blot设备

目前最好的垂直槽和转移槽还是Biorad（伯乐），尤其是MINI3好用,MINI4可以一次跑四块胶，但通常用不上，由此造成垂直缓冲液的浪费，而且MINI4用绿色塑料夹住玻璃板来组成内槽，容易漏液。

Biorad的一套系统得两万多。好在咱中国人聪明，上海天能的外观和构造和伯乐的MINI3几乎一模一样，而且可以通用，不带电泳仪是5千多一套，挺好用的。唯一的不足是塑料寿命不如伯乐，胶架容易断裂。不过仔细算算，三套天能也就是一套伯乐的价格，值了。北京六一的垂直槽很转移槽很好用，但垂直槽配胶不方便，玻板太厚，散热不好，但能用，六一的电泳仪（电源）还是很好用的。

3. Western Blot实验条件

Western Blot实验条件我基本是按ABCAM公司经典教材做的

（http://www.abcam.com/ps/pdf/protocols/WB-beginner.pdf）。具体的试剂配方我是按宝生物试剂册的附录部分配制。

丙烯酰胺和甲叉我是从北京华美买的德国biomol原装货，配出来的胶可以提在手里玩，弹性非常好，价格比sigma的便宜许多，1公斤好像是480多人民币，够实验室用好长时间，现在我们实验室做双向电泳都用biomol的胶，很好用。Marker我现在用fermantas 的SM1811，2微升就很清晰了。

要强调的是垂直电泳缓冲液千万不能回收用，具体愿因你只需上网查查SDS-PAGE的原理就知道了。转移电泳缓冲液可以回收再用两次。

转膜我通常是快转两百200毫安/2小时，慢转80毫安/12小时。快转是一定得做冰水浴，就是把槽子泡在冰水混合液里。

封闭我通常用BD的脱脂奶粉，260元500克，也是从北京华美买的。

ECL我用pierce的，500毫升1650元，比国产的还便宜好用。

胶片是柯达的，以前用过乐凯的，不如柯达。

我很少用丽春红或考马斯染膜或染胶，总觉得是脱裤子放屁的事。

4. Western Blot实验关键

Western Blot操作步骤多，每一步的失误都会造成全盘失败，综合而言，抗体仍然是决定成败的关键，如果抗体很滥，就是神仙也没招。其中内参抗体很重要，因为内参抗体的选择关系到全盘实验的考评。Actin，Tubulin，GAPDH我都用过，Actin，Tubulin的缺点是有时候会出现复带，比较稳定的还是GAPDH。如果用心看看cell，nature，science上的文章，

大多用GAPDH做内参。进口的，国内分装的，国产的，我都用过。进口的最强的1:10000都能做出条带（Upstate，现在被Minipore招安了），国内分装的也好用，但就是不好回收重复使用，国产的一般只能用一次。现在我用的是杭州贤至的GAPDH兔多抗，200微升420元钱，我在蛋白上样量12微升/孔的情况下，按1:20xx稀释比，条带非常清晰，没有杂带，是我目前用过的最好的国产抗体，我估计按1:4000照样能做出来，因为按按1:20xx稀释做，在暗室里点上ECL后肉眼清楚地看到荧光条带。抗体我在不加叠氮化钠的情况下4度过夜杂交，可回收重复使用5到6次。

5.关于奶粉，膜的选择和显影定影

奶粉看似简单，其实很重要，如果要凑合，可以到超市买光明的脱脂奶粉。奶粉质量不好，会最终导致显影要么漆黑一片，要么啥都没。fluka的很好，可惜因为疯牛病的原因，现在海关禁止进口美国牛制品。我现在用的bd的，很好很稳定，如果回收使用，500可以用很长时间。

nc膜，pvdf膜我都用过，现在我已经固定下来用密理博的0.45微米的pvdf膜。pvdf膜的好处是蛋白载量大，韧性好。唯一的麻烦是事先得用甲醇泡几分钟。甲醇泡完后，得在转移缓冲液里泡一两分钟。国内用nc膜的人多一些，主要是因为nc膜有分装的小片，忽悠老板买一张膜就100元钱，老板肯定乐意，若是说膜得花上千元，老板就有可能长时间的思考，然后过些日子再答复你。所以大多数人会采取前一种方式，当然得告诉老板好几次，膜就100元钱。现在pvdf膜国内大概是1600元到1700元一卷，33厘米*375厘米。现在我基本是从北京的欣津科和华美买，大概1700元一卷，完完整整。

0.45微米的pvdf膜我用5%的脱脂奶粉（溶于tbst中）室温封闭1小时，0.22微米的用8%的脱脂奶粉。bsa我很少用，主要是bsa会出现封闭不均匀的情况。我也很少用0.22微米的膜，原因是背景不干净，再者无论是封闭时间还是洗膜时间都得延长。标准教程上推荐20kd以下的分子用0.22微米的膜，我杂过最小的分子是cleaved-caspase3，12ka，按我在一楼的转膜条件，在0.45微米的膜上清清楚楚。我在上海的师弟他们转7ka的分子也用0.45微米的，没出过事。

一抗我一般4度摇床过夜，洗膜3此，每次5分钟。要注意的是，如果一抗里添加了叠氮化钠，务必洗膜5次，每次10分钟，因为叠氮化钠会灭活二抗偶联的辣根过氧化物酶（hrp）活性。二抗我用的是中杉金桥分装的，120元一支，通常1:5000，室温1小时，然后洗膜三次，每次5分钟。

一般8.3*4.3厘米的膜，大概要400微升的ecl混合液。加ecl我一般就在灯光下，或者白天把窗帘拉上。加好ecl，覆上保鲜膜后，我才端着暗盒进暗室，暗室里我的暗室红灯始终开着，没有那么可怕。

在暗室里，我一般是剪4张同样尺寸的胶片，叠在一起，压在膜上方，暗盒一扣，就干别的事情去了。5个小时或过夜，我再把胶片显影，显影我起初很注意技巧，但现在基本上是在显影液里放10分钟，捞出来放到水盘里涮一涮，然后在定影液里放十分钟。我一般总能找到一张理想的胶片，因为胶片叠加到一起后，层层屏蔽，从而逐渐递减荧光强度，我试过多次，即便是荧光强度最强的内参，也至多能达到最上面的第四层胶片。所以显定影后，肯定有曝光过度的胶片，但也肯定有趋势，背景，强度恰到好处的一张，嘿嘿，傻瓜做法。 傻瓜做法看似呆笨，实则不然。我在很长的一段时间里，都是读秒，或三分钟，或15分钟，或半小时，或1小时取出胶片显影，眼睛紧紧盯着，一看到条带就捞出来定影。如果不理想，再压胶片，再等，再取再投再捞，活脱脱是个“猴埋儿”。西北人传说小猴夭折了，母猴把小猴埋到土里面，一会又挖出来，再埋进去，又挖出来...反复无止。显定影时如果采取猴埋儿式的技巧，是最费胶片，最费时间，最费心力的做法。所以我是傻瓜就用傻瓜的办法。 我用过好几个品牌的国产ecl，和进口的ecl也做过对照。国产的一半是a液b液总共

50毫升180元钱，单价3.6元/毫升，一般肉眼可见的荧光强度可持续1个小时，pierce和milipore的可以持续3小时。milipore的麻烦之处在于由a液b液c液三组成分组成，费枪头，费脑子。现在我固定使用pierce的super ecl，1650元500毫升，折算下来是3.3元/毫升。

胶片我用过医院放射科的，乐凯的，柯达的，柯达现在小胶片（小暗盒尺寸）好像是130元/50张，乐凯的是其价格的一半。乐凯的缺点在于胶片容易出现划痕，有莫名奇妙的背景，虽然瑕不掩瑜，但还是让人不爽，再就是感光不如柯达的灵敏。这些我都比对过。如果细心地把二者胶片厚度比比，也可看出差距。我就此请教过甘肃的乐凯总代理，他说根源出在牛身上。

显影液定影液我一直用乐凯的，便宜，量又足，谁用谁说好。进口的从未染指，连想都没想过，呵呵，我内心里还是极其渴望支持国货的，爱之深，恨之切啊！