一株发酵产黑色素的枯草芽孢杆菌及发酵产黑色素的方法 技术领域：
本发明属于生物工程发酵技术领域，具体涉及通过枯草芽孢杆菌液体发酵生产黑色素及提取方法。
背景技术：
黑色素是一种广泛存在于生物体中的一类天然色素，是酪氨酸经过一连串的化学反应形成的，通常以聚合的方式存在。黑色素可以作为吸收紫外线的化妆品成分、天然染发剂的成分、以及生物杀虫剂的光保护剂尤其是应用于化妆品，因其具有吸收紫外线的作用，可以保护皮肤；色素有很多重要的生物学功能,它能通过与蛋白质的交联起到强化结构的作 用,同时黑色素还能提供一些机械力,并且保护蛋白质不被降解；此外黑色素在医学上也具有很广的应用范围，具有清除自由基、阻止心磷脂脂质体的氧化、抗辐射及抗氧化、对病理学和分类学的研究具有重要意义、作为新型的天然药物载体、用来治疗某些与黑色素缺乏相关的神经性疾病,例如白癜风是常见的一种由于黑色素的缺失而引起的一种疾病。
目前，黑色素既可以通过酪氨酸或其衍生物的氯化进行化学合成，也可以从动植物材料中提取，还可以利用微生物合成，但现在大规模生产黑色素仍以化学合成法为主。例如一种以哺乳类动物的毛发为原料和一种以黑芝麻味原料，用氢氧化钠溶液浸提后采用盐析作为沉淀剂使黑色素沉淀来制取黑色素的方法。但随着人们对以化学原料合成黑色素安全性问题的认识，现越来越倾向于对天然黑色素的开发和应用。尤其倾向于用微生物液体发酵生产黑色素。
天然黑色素安全性高，成分确定可操作性强，尤其是采用微生物发酵生产黑色素具有反应条件温和、操作简单、低成本等特点。现在国内对利用微生物发酵生产黑色素的研究还较少，本发明是利用枯草芽孢杆菌液体发酵生产黑色素。
发明内容：
本发明针对现有黑色素合成工艺的不足，提供一种利用微生物液体发酵生产黑色素并提取的方法。
本发明所用菌株为枯草芽孢杆菌*****（ ）现已保藏在中国微生物菌种保藏委员会普通微生物中心（CGMCC），保藏编号为****
本枯草芽孢杆菌*****（ ）属于革兰氏阴性菌
本发明的技术方案：通过枯草芽孢杆菌的液体发酵生产黑色素，其过程包括菌种的斜面培养、种子液培养、摇床发酵培养、深层液体发酵培养和黑色素的提取。
本发明的具体步骤为:
(1)发酵菌种的准备：取保存在-80℃的枯草芽孢杆菌接种于于固体培养基中，划线培养，培养温度36～38℃，培养时间48～72h，挑取单菌落作为种子菌。
固体培养基的配制方法：成分为蛋白胨1g、葡萄糖0.1g、NaCl0.5g、CaCl2 0.01g、L-酪氨酸0.1g、琼脂粉1.5g，然后用去离子水定容到100ml，调节PH为7.0，最后在温度121℃、高压蒸汽灭菌15～20min，冷却制得固体平板。
(2)种子液发酵培养：将固体平板菌接种于种子液中，在温度36～38℃、转速181r/min，培养12～16h，培养至对数期。
种子液的配制方法：成分为蛋白胨1g、牛肉膏0.5g、NaCl1g然后用去离子水定容至100ml，调节PH为7.0，分装到若干个250ml摇瓶中，在温度121℃、高压蒸汽灭菌15～20min，冷却得到种子液。
(3)将种子液进行放大培养：取上述（2）种子液按接种量6%（V/V）接种于发酵培养基中，在温度36℃～38℃、转速181r/min培22～26h，然后加入L-酪氨酸0.1g/100ml，再继续培养20～30h。
发酵培养基制备：成分为氮源1.5%～2.5%、碳源1.5%～2.5%、NaCl0.4g、KH2PO4、MgSO4.7H2O 0.02g、KNO31g、（NH4）2SO4 1g、玉米粉1g，然后用去离子水定容到100ml，调节PH为7.0，在温度121℃、高压蒸汽灭菌20min制得发酵液。
上述（3）中发酵液：
①氮源可为酵母膏、尿素中的一种或多种。
②碳源可为麸皮、蔗糖、乳糖中的一种或多种。
⑷深层通风液体发酵培养：
（5）发酵液中黑色素的提取：
发酵结束后将枯草芽孢杆菌黑色素发酵液过滤或者离心除去菌体，取发酵液浓缩，用5mol/LHCl调pH值至2～3，充分振荡,静置40～100min，在搅拌的同时加入等体积有机溶剂使其充分沉淀，用滤布过滤弃上清，得黑色粗提物，于50℃真空干燥至恒重。 所述发酵液离心转速为5000～8000r/min，离心10min，除去菌体。
所述有机溶剂为无水乙醇、无水甲醇或无水丙酮中任意一种。
所述有机溶剂为浓度40%～100%的乙醇。
所述黑色素发酵液的浓缩比为50%。
所述静置可以为恒温水浴中静置，水浴温度为0℃～100℃。
所述水浴温度优选为80℃。
本发明制备黑色素的优点：本发明方法制备的黑色素具有安全、简单、高效等优点。在化妆业、工农业、医药业具有广泛的应用前景。产自枯草芽孢杆菌的黑色素降低的生产能耗、缩短的生产周期、对环境危害小，于国家倡导的可持续性发展相结合。
具体实施方式：
下面结合具体事例对发明做详细介绍：
本发明所用菌种为枯草芽孢杆菌******（ ）现已保藏在中国微生物菌种保藏委员会普通微生物中心（CGMCC），保藏编号为****
本枯草芽孢杆菌*****（ ）属于革兰氏阴性菌
实施例一、种子液的培养
(1)发酵菌种的准备：取保存在-80℃的枯草芽孢杆菌菌种于固体培养基中，划线培养，培养温度36℃～38℃，培养48～72h，挑取单菌落作为种子液菌种。
固体培养基的配制方法：成分为蛋白胨1g、葡萄糖0.1g、NaCl0.5g、CaCl2 0.01g、L-酪氨酸0.1g、琼脂粉1.5g，然后用去离子水定容到100ml，用NaOH或HCL调节PH为7.0，在温度121℃、高压蒸汽灭菌15～20min，冷却制得固体平板。
(2)枯草芽孢杆菌种子液培养：将固体平板菌接种于种子液中，在温度36～38℃、转速181r/min，培养12～16h，培养至对数期。
种子液的配制方法：成分为蛋白胨1g、牛肉膏0.5g、NaCl1g然后用去离子水定容至100ml，用NaOH或HCL调节PH为7.0，分装到2个250ml摇瓶中，在温度121℃ 、高压蒸汽灭菌15～20min，冷却得到种子液。
实施例二、 摇瓶发酵培养
取上述枯草芽孢杆菌种子液按接种量6%（V/V）接种于发酵培养基中，在温度36℃～38℃、转速181r/min培22～26h，然后加入L-酪氨酸0.1g/100ml，再继续培养20～30h。
发酵培养基制备：成分为氮源1.5%～2.5%、碳源1.5%～2.5%、NaCl0.4g、KH2PO4、MgSO4.7H2O0.02g、KNO31g、（NH4）2SO41g、玉米粉1g，然后用去离子水定容到100ml，调节PH为7.0，在温度121℃、高压蒸汽灭菌20min制得发酵液。
上述发酵培养基中：
①源可为酵母膏、尿素中的一种或多种。
②碳源可为麸皮、蔗糖、乳糖中的一种或多种。
实施例三、深层通风液体发酵培养
实施例四、发酵液中黑色素的提取
发酵罐装液量为15L，接种量为6%（V/V）,溶氧量20%,37℃181r/min，在24h后加入L-酪氨酸0.1g/100ml培养2-3d。
发酵结束后将枯草芽孢杆菌黑色素发酵液过滤或者离心除去菌体，取发酵液浓缩，用5mol/LHCl调pH值至2～3，充分振荡,静置40～100min，在搅拌的同时加入等体积有机溶剂使其充分沉淀，用滤布过滤弃上清，得黑色粗提物，于50℃真空干燥至恒重。 所述发酵液离心转速为5000～8000r/min，离心10min，除去菌体。
所述有机溶剂为无水乙醇、无水甲醇或无水丙酮中任意一种。
所述有机溶剂为浓度40%～100%的乙醇。
所述黑色素发酵液的浓缩比为50%。
所述静置可以为恒温水浴中静置，水浴温度为0℃～100℃。
所述水浴温度优选为80℃。
利用此发酵生产和提取方法制得的黑色素的产量为
第二篇：发明专利请求书模板
发 明 专 利 请 求 书
(第2页)
发 明 专 利 请 求 书 英 文 信 息
(第3页)
填 表 注 意 事 项
缴 费 须 知
1、申请人应当在收到受理通知书之后，最迟自申请日起两个月内缴纳申请费、公布印刷费和申请附加费。申请人要求优先权的，应当在缴纳申请费的同时缴纳优先权要求费。
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3、各种专利费用可以直接向国家知识产权局专利局缴纳，也可以通过邮局或者银行汇付。
4、通过邮局汇付的，请寄北京市海淀区蓟门桥西土城路6号国家知识产权局专利局费用管理处；并应在汇款单附言栏中写明申请号、费用名称。
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6、对于只能采用电子联行汇付的，应向银行付电报费，正确填写并要求银行至少将申请号及费用名称两项列入汇款单事由栏中同时发至专利局。
7、应正确填写申请号9位阿拉伯数字，小数点不需填写。
8、每一申请案的费用应单独汇款，不得将两个或两个以上申请的费用在一个单据中汇出。
9、费用名称可以使用下列简称：
申请费——申
发明申请公布印刷费——文
优先权要求费——优
申请附加费——附加
实质审查费——实审
申请维持费——维
专利登记费——登
印花税——印
年费——年
滞纳金——滞
复审费——复审
中止程序请求费——中止
实用新型检索费——实检
延长期限请求费——延
恢复权利请求费——恢
无效宣告请求费——无效
著录事项变更费——变更
强制许可请求费——强许
强制许可使用费的裁决请求费——强裁
10、未按上述规定办理缴费手续的，所产生的法律后果由汇款人承担。