1、 抽提出高质量的RNA。要求：实验器材和用品做好抑制RNA酶准备；操作过程中避免RNA酶污染；提取的组织细胞样品不能太多（可能裂解不充分等）。
2、选用高质量的RT酶。如Promega、Invitrogen公司等。
3、引物设计正确。尤其注意动物种属、至少包含1个内含子、参考文献的质量等。
4、PCR扩增中循环次数恰当。过少的循环次数条带出不来，过高的循环次数条带太亮看不出差异（达到平台期后也不准确）。
5、Mg2+浓度和Taq酶含量适度。过高容易引起非特异性条带。
6、建议在RT逆转录前可以对样品进行DNA酶处理，以纯化提取的样品RNA。
7、图像定量分析时尽量选择浅条带，太亮的条带不可靠。
我在做半定量Rt-Pcr 如下图。跑出来发现平行样的亮度差异颇大。
实验设计：
共有4个cDNA的样本,分别命名为A,B,C,D，检测其中某基因表达的差异。
为了准确每个样本设3个平行样，也就是说 A1, A2 ,A3 均是从同一管(A管)取等量的（3UL）cDNA，加入同样的反应系统（先配好反应系统再分装到各pcr管中），用同一次pcr反应跑出来的。
发现平行样的亮度差异颇大。尤其是A 和C系列，几乎相差两倍。
请问各位大侠，PCR中平行样的误差真有这么大吗？？还是我的操作有问题？？
请各位大侠帮忙………………….
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我用的是50ul的反映系统，条件是：94 ℃ 30秒 ，55 ℃ 60秒， 72 ℃60秒。
25次循环
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