米氏常数是酶的特征性常数，可用来表示酶和底物亲和力的大小。米氏常数与底物浓度和酶浓度无关，而受温度和pH值的影响，竞争性抑制剂米氏常数增大，最大反应速度不变；非竞争性抑制剂米氏常数不变，最大反应速度减小；反竞争性抑制剂米氏常数减小，最大反应速度减小。

Km：米氏常数，是研究酶促反应动力学最重要的常数。它的意义如下： 它的数值等于酶促反应达到其最大速度Vm一半时的底物浓度〔S〕，图示以及公式推导。 它可以表示E与S之间的亲和能力，Km值越大，亲和能力越强，反之亦然。 它可以确定一条代谢途径中的限速步骤：代谢途径是指由一系列彼此密切相关的生化反应组成的代谢过程，前面一步反应的产物正好是后面一步反应的底物，例如，EMP途径。限速步骤就是一条代谢途径中反应最慢的那一步，Km值最大的那一步反应就是，该酶也叫这条途径的关键酶。 它可以用来判断酶的最适底物，某些酶可以催化几种不同的生化反应，叫多功能酶，其中Km值最小的那个反应的底物就是酶的最适底物。 Km是一种酶的特征常数，只与酶的种类有关而与酶的浓度无关，与底物的浓度也无关，这一点与Vm是不同的，因此，我们可以通过Km值来鉴别酶的种类。但是它会随着反应条件（T、PH）的改变而改变。

米氏常数是酶的特征性常数，可用来表示酶和底物亲和力的大小。米氏常数与底物浓度和酶浓度无关，而受温度和pH值的影响，竞争性抑制剂米氏常数增大，最大反应速度不变；非竞争性抑制剂米氏常数不变，最大反应速度减小；反竞争性抑制剂米氏常数减小，最大反应速度减小。

Km：米氏常数，是研究酶促反应动力学最重要的常数。它的意义如下： 它的数值等于酶促反应达到其最大速度Vm一半时的底物浓度〔S〕，图示以及公式推导。 它可以表示E与S之间的亲和能力，Km值越大，亲和能力越强，反之亦然。 它可以确定一条代谢途径中的限速步骤：代谢途径是指由一系列彼此密切相关的生化反应组成的代谢过程，前面一步反应的产物正好是后面一步反应的底物，例如，EMP途径。限速步骤就是一条代谢途径中反应最慢的那一步，Km值最大的那一步反应就是，该酶也叫这条途径的关键酶。 它可以用来判断酶的最适底物，某些酶可以催化几种不同的生化反应，叫多功能酶，其中Km值最小的那个反应的底物就是酶的最适底物。 Km是一种酶的特征常数，只与酶的种类有关而与酶的浓度无关，与底物的浓度也无关，这一点与Vm是不同的，因此，我们可以通过Km值来鉴别酶的种类。但是它会随着反应条件（T、PH）的改变而改变。

Michaelis & Menten 于19xx年推导出了上述矩形双曲线的数学表达式，即米氏方程： ν= Vmax[S]/(Km+[S])。其中，Vmax为最大反应速度，Km为米氏常数。

传统上，米氏方程动力学描述的是分子数量为1015的集体分子的行为，米氏方程在单分子水平上也是有效的。

⑶Km和Vmax的意义：

①当ν=Vmax/2时，Km=[S]。因此，Km等于酶促反应速度达最大值一半时的底物浓度。

②当k-1>>k+2时，Km=k-1/k+1=Ks。因此，Km可以反映酶与底物亲和力的大小，即Km值越小，则酶与底物的亲和力越大；反之，则越小。

③Km可用于判断反应级数：当[S]<0.01Km时，ν=（Vmax/Km）[S]，反应为一级反应，即反应速度与底物浓度成正比；当[S]>100Km时，ν=Vmax，反应为零级反应，即反应速度与底物浓度无关；当0.01Km<[S]<100Km时，反应处于零级反应和一级反应之间，为混合级反应。

④Km是酶的特征性常数：在一定条件下，某种酶的Km值是恒定的，因而可以通过测定不同酶（特别是一组同工酶）的Km值，来判断是否为不同的酶。

⑤Km可用来判断酶的最适底物：当酶有几种不同的底物存在时，Km值最小者，为该酶的最适底物。

⑥Km可用来确定酶活性测定时所需的底物浓度：当[S]=10Km时，ν=91%Vmax，为最合适的测定酶活性所需的底物浓度。

⑦Vmax可用于酶的转换数的计算：当酶的总浓度和最大速度已知时，可计算出酶的转换数，即单位时间内每个酶分子催化底物转变为产物的分子数。

⑷Km和Vmax的测定：主要采用Lineweaver-Burk双倒数作图法和Hanes作图法。

第二篇：分光光度法测定蔗糖酶的米氏常数

分光光度法测定蔗糖酶的米是常数

一．实验目的：

1.     用分光光度法测定蔗糖酶的米是常数和最大反应速率。

2.     了解底物浓度与酶反应速率之间的关系

3.     掌握分光光度计的使用方法

二．实验原理：　

酶是由生物体内产生的具有催化活性的蛋白质。它表现出特异的催化功能，因此叫生物催化剂。酶具有高效性和高度选择性，酶催化反应一般在常温、常压下进行。

在酶催化反应中，底物浓度远远超过酶的浓度，在指定实验条件时，酶的浓度一定时，总的反应速率随底物浓度的增加而增大，直至底物过剩此时底物的浓度不再影响反应速率，反应速率最大。

Michaelis应用酶反应过程中形成中间络合物的学说，导出了米氏方程，给出了酶反应速率和底物浓度的关系：

　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　

米氏常数是反应速率达到最大值一半时的底物浓度。测定不同底物浓度时的酶反应速率，为了准确求得，用双倒数作图法，可由直线方程：

以为纵坐标，为横坐标，作图，所得直线的截距是，斜率是，直线与横坐标的交点为。

本实验用的蔗糖酶是一种水解酶，它能使蔗糖水解成葡萄糖和果糖。该反应的速率可以用单位时间内葡萄糖浓度的增加来表示，葡萄糖与3,5-二硝基水杨酸共热后被还原成棕红色的氨基化合物，在一定浓度范围内，葡萄糖的量和棕红色物质颜色深浅程度成一定比例关系，因此可以用分光光度计来测定反应在单位时间内生成葡萄糖的量，从而计算出反应速率。所以测量不同底物（蔗糖）浓度的相应反应速率，就可用作图法计算出米氏常数值。

三．仪器与试剂：

高速离心机一台；分光光度计一台；恒温水浴一套；比色管（25ml）9支；称液管（1ml）10支；称液管（2ml）4支；试管（10ml）10支；3,5-二硝基水杨酸试剂（即DNS）；0.1mol.dm^-3醋酸缓冲溶液；蔗糖酶溶液；蔗糖（分析纯）；葡萄糖（分析纯）。

四．实验步骤：

１．蔗糖酶的制取。在50ml的锥形瓶中加入鲜酵母10g，加入0.8g醋酸钠，搅拌15-20min后使块团溶化，加入1.5ml甲苯，用软木塞将瓶口塞住，摇动10min，放入37℃的恒温箱中保温60h。取出后加入1.6ml的4mol/L的醋酸和5ml水，使PH为4.5左右。混合物以每分钟3000转的离心机离心灶小时，混合物形成三层，将中层移出，注入试管中，为粗制酶液。

２．溶液的配制。

（１）0.1%葡萄糖标准液（1mg/mL）：先在90℃下将葡萄糖烘1h，然后准确称取1g于100ml烧杯中，用少量蒸馏水溶解后，定量移至1000ml容量瓶中。

（2）3,5-二硝基水杨酸试剂（即DNS）：6.3gDNS和262ml的 2mol/LNaOH加到酒石酸钾钠的热溶液中（182g酒石酸钾钠溶于500ml水中），再加5g重蒸酚和5g亚硫酸钠，微热搅拌溶解，冷却后加蒸馏水定容到1000ml，贮于棕色瓶中备用。

（3）0.1mol/L的蔗糖液：准确称取34.2g蔗糖溶解后定容至1000容量瓶中。　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　

３．葡萄糖标准曲线的制作。在9个50ml的容量瓶中，加入不同量0.1%葡萄糖标准液及蒸馏水，得到一系列不同浓度的葡萄糖溶液。分别吸取不同浓度的葡萄糖溶液1.0ml注入9支试管内，另取一支试管加入1.0ml蒸馏水，然后在每支试管中加入1.5mlDNS试剂，混合均匀，在沸水浴中加热5min后，取出以冷水冷却，每支内注入蒸馏水2.5ml，摇匀。在分光光度计上用540nm波长测定其吸光度。由测定结果作出标准曲线。

４．蔗糖酶米氏常数的测定。在９支试管中分别加入0.1mol/L蔗糖液、醋酸缓冲溶液，总体积达2ml，于35℃水浴中预热，另取预先制备的酶液在35℃水浴中保温10min，依次向试管中加入稀释过的酶液各2.0ml，准确作用5min后，按次序加入0.5ml 2mol/L的NaOH溶液，摇匀，令酶反应中停止，测定时，从每支试管中吸取0.5ml酶反应液加入装有1.5mlDNS试剂的25ml比色管中，加入蒸馏水，在沸水中加热5min后冷却，用蒸馏水稀至刻度，摇匀，540nm波长测定其吸光度。

实验所需仪器设备

五．数据处理：

由各反应液测得的吸光度值，在葡萄糖标准曲线上查出对应的葡萄糖浓度，结合反应时间计算其反应速率，并将对应的底物（蔗糖）浓度，一并用表格形式列出，将对作图，以直线斜率和截距求出和。

六．思考题

１．为什么测定酶的米氏常数要采用初始速度法？为什么会产生过冷现象？

２．试讨论本实验对米氏常数的测定结果与底物浓度、反应温度和酸度的关系。