缓冲溶液

   缓冲溶液是一类能够抵制外界加入少量酸和碱的影响，仍能维持pH值基本不变的溶液。该溶液的这种抗pH变化的作用称为缓冲作用。缓冲溶液通常是由一或两种化合物溶于溶剂（即纯水）所得的溶液，溶液内所溶解的溶质（化合物）称之为缓冲剂，调节缓冲剂的配比即可制得不同pH的缓冲液。

    缓冲溶液的正确配制和pH值的准确测定，在生物化学的研究工作中有着极为重要的意义，因为在生物体内进行的各种生物化学过程都是在精确的pH值下进行的，而且受到氢离子浓度的严格调控，能够做到这一点是因为生物体内有完善的天然缓冲系统。生物体内细胞的生长和活动需要一定的pH值，体内pH环境的任何改变都将引起与代谢有关的酸碱电离平衡移动，从而影响生物体内细胞的活性。为了在实验室条件下准确地模拟生物体内的天然环境，就必须保持体外生物化学反应过程有体内过程完全相同的pH值，此外，各种生化样品的分离纯化和分析鉴定，也必须选用合适的pH值，因此，在生物化学的各种研究工作中和生物技术的各种开发工作中，深刻地了解各种缓冲试剂的性质，准确恰当地选择和配制各种缓冲溶液，精确地测定溶液的pH值，就是非常重要的基础实验工作。下表列出某些人体体液的pH值：

1960年，N.E.Good和他的同事们提出，适合生命科学研究使用的缓冲体系应具有以下特性：

     ① pK_a值在6～8之间； ② 在水中的溶解度高；③ 不易穿透生物膜；④ 盐效应小；⑤ 离子浓度、溶液组成和温度对解离的影响小；⑥ 不与金属离子生成复合物或沉淀； ⑦ 该缓冲剂化学稳定；⑧ 紫外和可见光波长范围内光吸收小；⑨ 易制得高纯度的盐。

    按照这些要求可以设计和选择最为合适的缓冲剂来配制所需的缓冲溶液。

生物化学常用缓冲液

    ⑴ 磷酸盐缓冲液

    磷酸盐是生物化学研究中使用最广泛的一种缓冲剂，由於它们是二级解离，有二个pK_a值，所以用它们配制的缓冲液，pH范围最宽：

           NaH₂PO₄： pK_a1＝2.12， pK_a2＝7.21  

           Na₂HPO₄： pK_a1＝7.21， pK_a2＝12.32

     配酸性缓冲液： 用 NaH₂PO₄，pH＝1～4，

     配中性缓冲液： 用混合的两种磷酸盐，pH＝6～8，

     配碱性缓冲液： 用 Na₂HPO₄，pH＝10～12。

    用钾盐比钠盐好，因为低温时钠盐难溶，钾盐易溶，但若配制SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳的缓冲液时，只能用磷酸钠而不能用磷酸钾，因为SDS（十二烷基硫酸钠）会与钾盐生成难溶的十二烷基硫酸钾。

    磷酸盐缓冲液的优点为：①容易配制成各种浓度的缓冲液；②适用的pH范围宽；③pH受温度的影响小；④缓冲液稀释后pH变化小，如稀释十倍后pH的变化小于0.1。

    其缺点为：①易与常见的钙Ca⁺⁺离子、镁Mg⁺⁺离子以及重金属离子缔合生成沉淀；②会抑制某些生物化学过程，如对某些酶的催化作用会产生某种程度的抑制作用。

   ⑵Tris（三羟甲基氨基甲烷，N-Tris(hydroxymethyl)aminomethane）缓冲液

　 Tris缓冲液在生物化学研究中使用的越来越多，有超过磷酸盐缓冲液的趋势，如在SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳中已都使用Tris缓冲液，而很少再用磷酸盐。

    Tris缓冲液的常用有效pH范围是在“中性”范围，例如：

            Tris-HCl缓冲液：    pH＝7.5～8.5

            Tris-磷酸盐缓冲液： pH＝5.0～9.0

    配制常用的缓冲液的方法有两种：①按书后附录中所列该缓冲液表中的方法，分别配制0.05mol/L Tris和0.05mol/L HCl溶液，然后按表中所列体积混合。由于标准浓度的稀盐酸不易配制，所以常用另一种方法；②若配1L 0.1mol/L的Tris-HCl缓冲液：先称12.11g Tris碱溶于950mL～970mL 无离子水中，边搅拌边滴加4N HCl，用pH计测定溶液pH值至所需的pH值，然后再加水补足到1L。

    Tris-HCl缓冲液的优点是： ①因为Tris碱的碱性较强，所以可以只用这一种缓冲体系配制pH范围由酸性到碱性的大范围pH值的缓冲液；②对生物化学过程干扰很小，不与钙、镁离子及重金属离子发生沉淀。

其缺点是：①缓冲液的pH值受溶液浓度影响较大，缓冲液稀释十倍，pH值的变化大于0.1；②温度效应大，温度变化对缓冲液pH值的影响很大，即：

△pK_a／℃＝－0.031 ，例如：4℃时缓冲液的pH＝8.4，则37℃时的pH＝7.4，所以一定要在使用温度下进行配制，室温下配制的Tris-HCl缓冲液不能用于0℃～4℃。 ③易吸收空气中的CO₂，所以配制的缓冲液要盖严密封。 ④此缓冲液对某些pH电极发生一定的干扰作用，所以要使用与Tris溶液具有兼容性的电极。

    ⑶ 有机酸缓冲液

    这一类缓冲液多数是用羧酸与它们的盐配制而成，pH范围为酸性，即pH＝3.0～6.0，最常用的是甲酸、乙酸、柠檬酸和琥珀酸等。

    甲酸～甲酸盐缓冲液很有用，因其挥发性强，使用后可以用减压法除之。乙酸～乙酸钠和柠檬酸～柠檬酸钠缓冲体系也使用的较多，柠檬酸有三个pK_a值：pK_a1＝3.10，

pK_a2＝4.75， pK_a3＝6.40。琥珀酸有二个pK_a值：pK_a1＝4.18， pK_a2＝5.60。
    有机酸缓冲液的缺点是：①所有这些羧酸都是天然的代谢产物，因而对生化反应过程可能发生干扰作用；②柠檬酸盐和琥珀酸盐可以和过渡金属离子（Fe³⁺、Zn⁺⁺、Mg⁺⁺等）结合而使缓冲液受到干扰；③这类缓冲液易与Ca⁺⁺离子结合，所以样品中有Ca⁺⁺离子时，不能用这类缓冲液。

    ⑷ 硼酸盐缓冲液

    常用的有效pH范围是：pH＝8.5～10.0，因而它是碱性范围内最常用的缓冲液，其优点是配制方便，只使用一种试剂，缺点是能与很多代谢产物形成络合物，尤其是能与糖类的羟基反应生成稳定的复合物而使缓冲液受到干扰。

   ⑸ 氨基酸缓冲液

    此缓冲液使用的范围宽，可用于pH=2.0～11.0，例如最常用的有：

    甘氨酸—HCl缓冲液：pH=2.0～5.0，

    甘氨酸—NaOH缓冲液：pH=8.0～11.0，　 　 　    

　 甘氨酸—Tris缓冲液：pH=8.0～11.0，（此缓冲液用于广泛使用的SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳的电极缓冲液），

    组氨酸缓冲液：pH=5.5～6.5，

    甘氨酰胺（glycine amide）缓冲液：pH=7.8～8.8，

    甘氨酰甘氨酸（glycylglycine）缓冲液：pH=8.0～9.0。

    此类缓冲体系的优点是：为细胞组份和各种提取液提供更接近的天然环境。其缺点是：①与羧酸盐和磷酸盐缓冲体系相似，也会干扰某些生物化学反应过程，如代谢过程等。②试剂的价格较高。

    ⑹ 两性离子缓冲液（Zwitterionic buffers），又称Good’s缓冲液

1960年，N.E.Good和他的同事们总结了现有的各种缓冲试剂的优缺点后认为，必须用人为设计和人工合成的方法来找到专门用于生命科学研究的特定的缓冲体系，这些缓冲体系应具有前面所述的九条要求和特性。他们合成的一系列Good’s缓冲液可查阅有关的资料。

Good’s缓冲液的主要优点是不参加和不干扰生物化学反应过程，对酶化学反应等无抑制作用，所以它们专门用于细胞器和极易变性的、对pH敏感的蛋白质和酶的研究工作。其缺点是：①价格昂贵，②对测定蛋白质含量的双缩脲法和Lowry法不适用，因为它们会使空白管的颜色加深。

PBS是最普遍不过的实验室缓冲液，但其配方各异。以下是我的总结：

母液的配制：

0.2M Na2HPO4：称取 71.6g Na2HPO4-12H2O，溶于 1000ml 水
0.2M NaH2PO4：称取 31.2g NaH2PO4-2H2O，溶于1000ml 水
各种浓度PB(pH=7.4)的配制：
先配 0.2M PB (pH=7.4，100ml)：取19ml 0.2mol/L的 NaH2PO4，
81ml 0.2mol/L 的 Na2HPO4, 即可。
然后 只需将0.2M PB (pH=7.4)按相应比例适当稀释即可，如：
0.1M PB（PH=7.4） ：取 500ml 0.2M PB，加水稀释至 1000ml 即可。
0.01M PB （PH=7.4）：取50ml 0.2M PB，加水稀释至 1000ml 即可。
0.02M PB （PH=7.4）：取100ml 0.2 M PB，加水稀释至 1000ml 即可。

若需要 NaCL 的话，加入 NaCL 至0.9%（g/100ml）即可。

另另另：其它各种另 PH值的 0.2M PB（100ml)配方 ：
pH 0.2M NaH2PO4（ml） 0.2M Na2HPO4（ml）
5.7             93.5                          6.5
5.8              92                                8            
5.9             90                              10
6.0             87.7                        12.3
6.1             85                             15
6.2              81.5                        18.5
6.3              77.5                        22.5
6.4             73.5                        26.5
6.5              68.5                        31.5
6.6              62.5                        37.5
6.7             56.5                        43.5
6.8             51                           49
6.9              45                            55
7.0              38                             62
7.1              33                            67
7.2             28                            72
7.3              23                            77
7.4              19ml                        81ml
7.5              16                            84
7.6              13                            87
7.7             10.5                        90.5
7.8              8.5                        91.5
7.9             7                              93
8.0              5.3                         94.7

第二篇：常用生化缓冲液配方

1.甘氨酸-盐酸缓冲液（0.05M）

X ml 0.2M甘氨酸 +Y ml 0.2M盐酸 再加水稀释至200ml

pH X/ml Y/ml pH X/ml Y/ml

2.2 50 44.0 3.0 50 11.4

2.4 50 32.4 3.2 50 8.2

2.6 50 24.2 3.4 50 6.4

2.8 50 16.8 3.6 50 5.0

甘氨酸分子量＝75.07 0.2M甘氨酸溶液含15.01g/L

2.邻苯二甲酸-盐酸缓冲液（0.05M）

X ml 0.2M邻苯二甲酸氢钾 +Y ml 0.2M盐酸 再加水稀释至200ml pH X Y pH X Y

2.2 5 4.670 3.2 5 1.470

2.4 5 3.960 3.4 5 0.990

2.6 5 3.295 3.6 5 0.597

2.8 5 2.642 3.8 5 0.263

3.0 5 2.032

邻苯二甲酸氢钾分子量＝2.4.23 0.2M邻苯二甲酸氢钾溶液含40.85g/L

3.磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液

pH 0.2M Na2HPO4/ml 0.1M柠檬酸/ml pH 0.2M Na2HPO4/ml 0.1M柠檬酸/ml

2.2 0.40 19.6 5.2 10.72 9.28

2.4 1.24 18.76 5.4 11.15 8.85

2.6 2.18 17.82 5.6 11.60 8.40

2.8 3.17 16.83 5.8 12.09 7.91

3.0 4.11 15.89 6.0 12.63 7.37

3.2 4.94 15.06 6.2 13.22 6.78

3.4 5.70 14.30 6.4 13.85 6.15

3.6 6.44 13.56 6.6 14.55 5.45

3.8 7.10 12.90 6.8 15.45 4.55

4.0 7.71 12.29 7.0 16.47 3.53

4.2 8.28 11.72 7.2 17.39 2.61

4.4 8.82 11.18 7.4 18.17 1.83

4.6 9.35 10.65 7.6 18.73 1.27

4.8 9.86 10.14 7.8 19.15 0.85

5.0 10.30 9.70 8.0 19.45 0.55

Na2HPO4分子量＝141.98 0.2M溶液含28.40g/L

Na2HPO4·2H2O分子量＝178.05 0.2M溶液含35.61g/L

C6H8O7·H2O分子量＝210.14 0.1M溶液含21.01g/L

4.柠檬酸-氢氧化钠-盐酸缓冲液

pH 钠离子浓度/M 柠檬酸C6H8O7·H2O/g 氢氧化钠NaOH/g 浓盐酸HCl/ml 终体积/L

2.2 0.20 210 84 160 10

3.1 0.20 210 83 116 10

3.3 0.20 210 83 106 10

4.3 0.20 210 83 45 10

5.3 0.35 245 144 68 10

5.8 0.45 285 186 105 10

6.5 0.38 266 156 126 10

使用时可以每升中加入1g酚，若最后pH有变化，再用少量50%氢氧化钠溶液或浓盐酸调节，冰箱保存。

柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液（0.1M）

pH 0.1M柠檬酸/ml 0.1M柠檬酸钠/ml pH 0.1M柠檬酸/ml 0.1M柠檬酸钠/ml

3.0 18.6 1.4 5.0 8.2 11.8

3.2 17.2 2.8 5.2 7.3 12.7

3.4 16.0 4.0 5.4 6.4 13.6

3.6 14.9 5.1 5.6 5.5 14.5

3.8 14.0 6.0 5.8 4.7 15.3

4.0 13.1 6.9 6.0 3.8 16.2

4.2 12.3 7.7 6.2 2.8 17.2

4.4 11.4 8.6 6.4 2.0 18.0

4.6 10.3 9.7 6.6 104 18.6

4.8 9.2 10.8

C6H8O7·H2O分子量＝210.14 0.1M溶液含21.01g/L

Na3C6H5O7·2H2O分子量＝294.12 0.1M溶液含29.41g/L

6.乙酸-乙酸钠缓冲液（0.2M）

pH 0.2M NaAc/ml 0.2M HAC/ml pH 0.2M NaAc/ml 0.2M HAC/ml

3.6 0.75 9.25 4.8 5.90 4.10

3.8 1.20 8.80 5.0 7.00 3.00

4.0 1.80 8.20 5.2 7.90 2.10

4.2 2.65 7.35 5.4 8.60 1.40

4.4 3.70 6.30 5.6 9.10 0.90

4.6 4.90 5.10 5.8 9.40 0.60

NaAc分子量＝136.09 0.2M溶液为27.22g/L

7.磷酸盐缓冲液

(1)磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液（0.2M）

pH 0.2M Na2HPO4/ml 0.2M NaH2PO4/ml pH 0.2M Na2HPO4/ml 0.2M NaH2PO4/ml

5.8 8.0 92.0 7.0 61.0 39.0

5.9 10.0 90.0 7.1 67.0 33.0

6.0 12.3 87.7 7.2 72.0 28.0

6.1 15.0 85.0 7.3 77.0 23.0

6.2 18.5 81.5 7.4 81.0 19.0

6.3 22.5 77.5 7.5 84.0 16.0

6.4 26.5 73.5 7.6 87.0 13.0

6.5 31.5 68.5 7.7 89.5 10.5

6.6 37.5 62.5 7.8 91.5 8.5

6.7 43.5 56.5 7.9 93.0 7.0

6.8 49.5 51.0 8.0 94.7 5.3

6.9 55.0 45.0

7.0 61.0 39.0

7.1 67.0 33.0

7.2 72.0 28.0

7.3 77.0 23.0

7.4 81.0 19.0

7.5 84.0 16.0

7.6 87.0 13.0

7.7 89.5 10.5

7.8 91.5 8.5

7.9 93.0 7.0

8.0 94.7 5.3

Na2HPO4·2H2O分子量＝178.05 0.2M溶液含35.61g/L

Na2HPO4·12H2O分子量＝358.22 0.2M溶液含71.64g/L

NaH2PO4·H2O分子量＝138.01 0.2M溶液含27.6g/L

NaH2PO4·2H2O分子量＝156.03 0.2M溶液含31.21g/L

(2) 磷酸氢二钠-磷酸二氢钾缓冲液（1/15M）

pH 1/15M Na2HPO4/ml 1/15M KH2PO4/ml pH 1/15M Na2HPO4/ml 1/15M KH2PO4/ml

4.92 0.10 9.90 7.17 7.00 3.00

5.29 0.50 9.50 7.38 8.00 2.00

5.91 1.00 9.00 7.73 9.00 1.00

6.24 2.00 8.00 8.04 9.50 0.50

6.47 3.00 7.00 8.34 9.75 0.25

6.64 4.00 6.00 8.67 9.90 0.10

6.81 5.00 5.00 9.18 10.00 0

6.98 6.00 4.00

Na2HPO4·2H2O分子量＝178.05 1/15M溶液含35.61g/L

KH2PO4分子量＝136.09 1/15M溶液含9.078g/L

8.磷酸二氢钾-氢氧化钠缓冲液（0.05M）

X ml 0.2M KH2PO4 +Y ml 0.2M NaOH 再加水稀释至20ml

pH(20℃) X/ml Y/ml pH(20℃) X/ml Y/ml

5.8 5 0.372 7.0 5 2.963

6.0 5 0.570 7.2 5 3.500

6.2 5 0.860 7.4 5 3.950

6.4 5 1.260 7.6 5 4.280

6.6 5 1.780 7.8 5 4.520

6.8 5 2.365 8.0 5 4.680

9.巴比妥钠-盐酸缓冲液（18℃）

pH 0.04M巴比妥钠/ml 0.2M盐酸/ml pH 0.04M巴比妥钠/ml 0.2M盐酸/ml

6.8 100 18.4 8.4 100 5.21

7.0 100 17.8 8.6 100 3.82

7.2 100 16.7 8.8 100 2.52

7.4 100 15.3 9.0 100 1.65

7.6 100 13.4 9.2 100 1.13

7.8 100 11.47 9.4 100 0.70

8.0 100 9.39 9.6 100 0.35

8.2 100 7.21 100

巴比妥钠分子量＝206.18 0.04M溶液为8.25g/L

10.Tris-盐酸缓冲液

50ml 0.1M三羟甲基氨基甲烷(Tris)溶液于X ml 0.1M盐酸混匀后，加水稀释至100ml pH X/ml pH X/ml

7.1 45.7 8.1 26.2

7.2 44.7 8.2 22.9

7.3 43.4 8.3 19.9

7.4 42.0 8.4 17.2

7.5 40.3 8.5 14.7

7.6 38.5 8.6 12.4

7.7 36.6 8.7 10.3

7.8 34.5 8.8 8.5

7.9 32.0 8.9 7.0

8.0 29.2

三羟甲基氨基甲烷(Tris)分子量＝121.14 0.1M溶液为12.114g/L

Tris溶液可以从空气中吸收二氧化碳，使用时注意将瓶盖严

11.硼酸-硼砂缓冲液（0.2M硼酸根）

pH 0.05M硼砂/ml 0.2M硼酸/ml pH 0.05M硼砂/ml 0.2M硼酸/ml

7.4 1.0 9.0 8.2 3.5 6.5

7.6 1.5 8.5 8.4 4.5 5.5

7.8 2.0 8.0 8.7 6.0 4.0

8.0 3.0 7.0 9.0 8.0 2.0

硼砂Na2B4O7·10H2O分子量＝381.43 0.05M(=0.2M硼酸根)溶液为19.07g/L 硼酸H3BO3分子量＝61.84 0.2M溶液为12.37g/L

硼砂易失去结晶水，必须在带塞的瓶中保存

12.甘氨酸-氢氧化钠缓冲液（0.05M）

X ml 0.2M甘氨酸 +Y ml 0.2M氢氧化钠 再加水稀释至200ml

pH X/ml Y/ml pH X/ml Y/ml

8.6 50 4.0 9.6 50 22.4

8.8 50 6.0 9.8 50 27.2

9.0 50 8.8 10.0 50 32.0

9.2 50 12.0 10.4 50 38.6

9.4 50 16.8 10.6 50 45.5

甘氨酸分子量＝75.07 0.2M甘氨酸溶液含15.01g/L

13.硼砂-氢氧化钠缓冲液（0.05M硼酸根）

X ml 0.05M硼砂 +Y ml 0.2M氢氧化钠 再加水稀释至200ml

pH X/ml Y/ml pH X/ml Y/ml

9.3 50 6.0 9.8 50 34.0

9.4 50 11.0 10.0 50 43.0

9.6 50 23.0 10.1 50 46.0

硼砂Na2B4O7·10H2O分子量＝381.43 0.05M(=0.2M硼酸根)溶液为19.07g/L

14.碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液（0.1M）

Ca2+，Mg2+存在时不得使用

pH 0.1M碳酸钠/ml 0.1M碳酸氢钠/ml

20℃ 37℃

9.16 8.77 1 9

9.40 9.12 2 8

9.51 9.40 3 7

9.78 9.50 4 6

9.90 9.72 5 5

10.14 9.90 6 4

10.28 10.08 7 3

10.53 1028 8 2

10.83 1057 9 1

Na2CO3·10H2O分子量＝286.2 0.1M溶液为28.62g/L

NaHCO3分子量＝84.0 0.1M溶液为8.40g/L