生化技术实验指导书
湖北工业大学生物工程学院
二0一0年三月修订
实验一 酵母RNA的提取及其组分的鉴定
一、 实验目的
1. 了解稀碱法提取RNA及提取物组分鉴定的基本原理；
2. 掌握稀碱法提取RNA及提取物组分鉴定的具体操作方法。
二、 实验原理
酵母中RNA的含量比较丰富（2.67%~10%），而DNA的含量相对地较少（据资料报道，酵母DNA的含量低于RNA的20%），因此从酵母中提取RNA比较方便。RNA溶于碱性溶液，碱性溶液使蛋白质带负电荷，促进RNA(带负电荷)与蛋白质的分离，碱性溶液可使酵母细胞壁变性，同时进行加热，可增加细胞壁的通透性，使核酸从细胞内释放出来。因此，酵母粉用稀碱液加热抽提时，可将其中的RNA抽提出来。当碱性抽提液中和后，加入2倍体积的95%乙醇时，可以使抽提物沉淀出来。抽提物的主要成分是RNA的钠盐，并带有少量的蛋白质。用碱抽提时，RNA会有不同程度的降解。
地衣酚（3，5-二羟基甲苯）是比较灵敏的测定戊糖的试剂，常用于测定RNA。核糖与地衣酚试剂反应呈现鲜绿色。地衣酚试剂反应灵敏，也易被其他物质干扰。DNA中的脱氧核糖也可与地衣酚反应，因此，单靠地衣酚显色实验不能作为RNA与DNA鉴别依据。
二苯胺试剂是常用于测定DNA中脱氧核糖的试剂，脱氧核糖与二苯胺试剂反应产生蓝色物质，而RNA中的核糖一般不与苯胺起反应。
嘌呤碱可与硝酸银反应生成白色的嘌呤银化合物的沉淀。
双缩脲反应是检验蛋白质常用的颜色反应。双缩脲或含有两个以上肽键的化合物（蛋白质、肽等）在碱性条件下与硫酸铜反应生成紫红色的配合物。如果蛋白质含量很低时，此颜色反应不易观察到。
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三、 试剂与器材
1. 试剂：
（1）酵母粉（药用）； （2）0.5%NaOH溶液；
（3）乙酸； （4）10%硫酸溶液；
（5）氨水； （6）5%硝酸银溶液；
（7）95%乙醇；
（8）地衣酚试剂（硫酸铁铵1.35g，地衣酚2g，用蒸馏水配成50mL作为母液，保存于冰箱中。使用前，取母液2.5mL，加浓盐酸41.5mL再加蒸馏水60mL）；
（9）二苯胺试剂（1.5g二苯胺溶于100mL高纯度的冰醋酸中，再加1.5mL浓硫酸）；
（10）10%氢氧化钠溶液； （11）1%硫酸铜溶液。
2. 器材：
（1）离心机 3000转/分以上
（2）100mL离心管 4支
（3）100mL烧杯 1支
（4）试管 5支
（5）50mL量筒 1只
（6）水浴锅 1只
（7）电炉 1台
（8）台式天平 1架
四、实验操作
1．提取
取酵母粉4g，放入100mL烧杯中，加0.5%氢氧化钠溶液30mL，将烧杯置沸水浴上加热半小时，并不时搅拌。加热完毕，加入乙酸约4~5滴使溶液呈微酸性 2
（pH6），然后倒入离心管中离心15分钟（3000转/分）。取上清液于100mL的烧杯中，加入2倍体积的95%的乙醇，边加边搅拌，最后静置待其沉淀完全。进行过滤，滤渣先用15mL95%乙醇分2次洗涤。继用15mL无水乙醇分2次洗涤，洗涤时可用玻璃棒轻轻地把滤渣搅动，以免下层滤渣洗涤不到，待乙醇滤干后完成成分的鉴定。
2. 组成成分的鉴定
（1）将上述提取到的沉淀物刮到100mL烧杯中后，溶于10mL 10% 的硫酸溶 液中，直接在电炉上加热，煮沸1~2分钟进行水解；
（2）取水解液0.5mL，加入地衣酚试剂1mL，直接加热，煮沸1分钟，观察颜色变化；
（3）取2mL 水解液，加入氨水2mL及5%硝酸银1mL，摇匀后观察是否产生絮状的沉淀物（如不出现，放置10min再观察）；
（4）取1mL 水解液，加10% NaOH 10滴，摇匀后再加1%硫酸铜溶液2滴，静置一会儿观察有无紫玫瑰色出现；
（5）取1mL 水解液加2mL二苯胺试剂，摇匀后，沸水浴中加热10分钟，观察颜色变化；
试从上述（2）~（5）四个反应的情况，说明从酵母中提出的物质是不是RNA。
五. 注意事项
1. 乙醇试剂易燃，应远离火源；
2. 用烧杯加热反应时，防止溶液外溅伤人；
3. 离心时一定要将离心管和内容物在天平上称平衡后再对称放入离心机中离心，否则会损坏离心机并发生事故；
4. 过滤前滤纸用乙醇湿润，不能用水湿润，因为RNA溶于水；
5. 滤下来的乙醇应回收使用。
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六、 思考题
1. 本实验是根据RNA的哪些性质设计的？其设计思想如何？
2. 在提取RNA过程中所用试剂及加热的作用是什么？
3. 在进行组分鉴定前为什么RNA溶于10%的硫酸中进行水解？
4. 稀碱法提取RNA为什么先不破壁？
5. 提取RNA有哪些方法？如果提取具有活性的RNA最好采用哪一种方法？还应注意些什么？
6. 提取DNA又有哪些方法？如果提取具有活性的DNA最好采用哪种方法？
7. 试分析RNA水解液进行组分鉴定的现象并解释其现象产生的原因。
8. 试分析本实验操作关键和注意事项，为什么？
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实验二 地衣酚显色法测定RNA含量
一、实验目的
学习和掌握测定RNA含量的方法—地衣酚显色法的原理和操作方法。
二、实验原理
在三氯化铁及盐酸存在下，RNA与3，5-二羟基甲苯（地衣酚）反应，生成绿色复合物，其吸收高峰在670nm处。当核糖核酸浓度在10~100ug/mL范围内，吸光度与其浓度呈线性关系。
三、试剂与材料
（1）标准RNA母液：准确称取RNA10.0mg，用少量蒸馏水溶解（如不溶，可滴加浓氨水，调pH7.0），定容至10.0mL，此溶液每ml含RNA1mg。
（2）标准RNA溶液：取母液1.0mL，置10mL容量瓶中，用蒸馏水稀释至刻度。此溶液为100ugRNA/mL。
（3）样品溶液：将一定量的RNA粗品（用上次实验所提取的RNA代替）用蒸馏水溶解到一定浓度。
（4）地衣酚—三氯化铁试剂：将100mg地衣酚溶于100mL浓盐酸中，再加入100mgFeCl3.H2O（催化剂），临用时配置。此配法与我们以前用稀碱法提取RNA的地衣酚（苔黑酚）试剂不同。
四、实验操作
1. 标准曲线的制作
分别吸取0、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0mL RNA标准溶液，用蒸馏水补充至2.0mL，各加入2.0mL地衣酚试剂，混匀，于沸水浴中加热45min。自来水冷却后，测定OD670。以RNA的量为横坐标，OD670为纵坐标，绘制标准曲线或求出回归方程。
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2. 样品的测定
取样品溶液2.0mL，加入地衣酚试剂2.0mL，如前述方法测定OD670，从标准曲线查出或用回归方程计算RNA含量。
? 样品液中RNA浓度（ug/mL）
样品中RNA含量（%）? 样品中测得的RNA微克数2.0 mL样品液中RNA的浓度（ug/mL）?样品液体积（mL）?100%样品的微克数
五、注意事项
1. 要注意RNA标准试剂的配制。
2. 标准曲线的制作仔细准确。
六、思考题
1. 凡戊糖均可与地衣酚反应，因此测定RNA时，如何减小DNA等杂质的影响？
2. 如何保证标准曲线的准确性？如何判断标准曲线的准确性？
3. 地衣酚反应中，干扰RNA测定的因素有哪些？如何能减少它们的影响？
4. 什么是分光光度检测？根据吸收光谱的不同，分光光度检测可分为哪几种？本实验是属于哪种分光光度检测？
5. 用上次实验提取的RNA配制样品溶液时，要注意什么？
6. 分光光度检测的原理是什么？它有哪些优点？
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实验三 氨基酸的纸层析
一、实验目的
1. 学习分配层析的原理和方法。
2. 掌握氨基酸纸上层析法的操作技术（包括点样、平衡、展层、显色、鉴定）。
二、实验原理
层析法又称色层分离法、色谱法。是一种分离分析多组分混合物质的极有效的物理及物理化学分析方法。
色谱法是目前各种化学分离法中最重要的一种方法。由于其分离效能高、分离速度快，试样用量少等特点，已经成为在与化学有关的一切领域中广泛应用的一种分离技术。
纸层析是以滤纸为载体（惰性支持物）的分配层析。什么是分配呢？一般把物质在两种互不相溶的溶剂之间的溶解过程称为分配。达到平衡时，溶质在两种溶剂中的浓度之比称为分配系数，又称平衡常数。通常用K表示，即：
分配系数（K）?
滤纸纤维与水有较强的亲和力，滤纸纤维能吸附25-29%的水分，其中6-7%的水以氢键与纤维素的羟基结合，在通常条件下较稳定，不易除去。这种水分组成为固定相。而有机溶剂与滤纸的亲和力甚弱，因而有机溶剂为流动相（在纤维间空隙中流动），它沿着滤纸移动。溶剂由下向上移动的，称上行法；由上向下移动，称下行法。
将样品点在滤纸上（此点称为原点），然后进行展层。样品中的各种溶质（如各种氨基酸）即在两相溶剂中不断进行分配。由于分配系数不同，不同溶质随流动相 7 溶质在固定相中的浓度溶质在流动相中的浓度
移动的速率不等，于是将这些溶质分离开来，形成距原点不等的层析点。
溶质在滤纸上移动的速率可用Rf值表示：
层析点中心到原点的距离R? f溶剂前沿到原点的距离
只要条件（如温度、展层溶剂的组成、滤纸的质量等）不变，Rf值是常数。故可根据Rf值作定性分析。
三、试剂与器材
1. 试剂
（1）酸性展开剂：4份水饱和的正丁醇和1份醋酸的混合物。将20毫升正丁醇和5毫升醋酸放入分液漏斗中，与15毫升水混合，充分震荡，静止后分层，放出下层水层。取扩展剂倒入培养皿中备用。
（2）显色剂：0.1%茚三酮显色液。称取0.1g茚三酮，溶于100mL正丁醇中（用前配）。
（3）未知氨基酸溶液
（4）标准氨基酸溶液。
2. 器材
（1）毛细管； （2）层析缸；
（3）新华滤纸一号（如果滤纸不干净，可用0.4mol/LHCL浸包20小时或过夜后，用蒸馏水洗至中性，再用95%乙醇冲洗，晾干后用）；
（4）喷雾器； （5）培养皿；
（6）分液漏斗； （7）电吹风；
（8）针线。
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四、操作
1. 层析滤纸的准备
在19cm×23cm的滤纸上一端距边缘3cm处用铅笔轻轻划一条直线，在此直线上每间隔3cm做一记号。
2. 点样
用毛细管将各氨基酸样品分别点在这四个位置上；每点完一次后，吹干再点第二次。点的直径应小于0.5cm，每点共点三到四次。
3. 平衡与展开
将滤纸缝成圆筒形（注意纸的二边不相碰），挂在层析缸盖内的钩上，盖好盖子饱和0.5h。然后将滤纸筒放入盛有展开剂的培养皿中（点样的一端在下，展开剂的液面需低于点样线1cm），待溶剂前沿上升到离顶端1cm时取出，吹干至无正丁醇气味为止,用铅笔画出溶剂前沿界线。
4. 显色
用0.1%茚三酮溶液均匀喷雾显色，65℃烘干或吹干即可显出各种氨基酸的层析斑点。
五、定性鉴定
计算各种氨基酸的Rf值，与各种氨基酸的标准Rf值（见主要参考书[1]的p49表2-4）进行对照，鉴定是什么氨基酸。
六、注意事项
1. 滤纸要保持清洁，操作时勿用手接触，载手套或只拿边角。
2. 点样斑点要尽量小，最大不超过0.5cm的直径，每次点样后用冷风吹干再点第二次。
3. 展开时点样点不要浸入有机溶剂中，至少要平衡半小时或1~2小时。
4. 显色时喷雾要均匀小点，不均匀会将斑点（溶质）冲下来。
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5. 溶剂必须新鲜配制并摇匀才能使用。
七、思考题
1. 结合本实验所得氨基酸图谱，分析酸性系统溶剂对酸性、碱性及中性氨基酸极性基团的解离有何影响？
2. 什么是分配层析，本实验是利用氨基酸的什么性质进行设计的？
3. 影响Rf值的因素有哪些？Rf值如何计算？
4. 为什么要进行双向层析？
5. 层析后如何进行氨基酸的定量?
6. 试分析酸性、中性、碱性氨基酸在酸性展剂中分离的图谱，为什么？
7. 做此实验要注意些什么？为什么？
八、参考书籍
[1] 陈钧辉，陶力，李俊. 生物化学实验（第三版）. 北京：科学出版社. 10
实验四 人血清蛋白的醋酸纤维薄膜电泳
一、实验目的
1. 掌握醋酸纤维薄膜电泳的原理及操作技术；
2. 应用醋酸纤维薄膜电泳分离鉴定人血清蛋白。
二、实验原理
采用醋酸纤维素薄膜为支持物的电泳方法，叫做醋酸纤维素薄膜电泳。醋酸纤维素，是纤维素的羟基乙酰化所形成的纤维素醋酸酯。将它溶于有机溶剂（如：丙酮、氯仿、氯乙烯、乙酸乙酯等）后，涂抹成均匀的薄膜则成为醋酸纤维素薄膜。该膜具有均一的泡沫状的结构，有较强的渗透性，厚度约为120微米。
醋酸纤维素薄膜电泳是近年来推广的一种新技术。它具有微量、快速、简便、分辨力高，对样品无拖尾和吸附现象等优点。目前，醋酸纤维素薄膜电泳趋向于代替纸电泳。
蛋白质分子，由于具有许多可解离的酸性基团和碱性基团，如COO-及NH3+等，是一种典型的两性电解质，在一的pH条件下，会解离而带电。带电的性质和多少决定于蛋白质分子的性质及溶液的pH值和离子强度。在某一pH条件下，蛋白质分子所带的正电荷数恰好等于负电荷数，即净电荷等于零，此时蛋白质质点在电场中不移动，溶液的这一pH值，称为该蛋白质的等电点（pI）。如果溶液的pH值小于pI，则蛋白质带正电荷，在电场中向负极移动；反之，溶液的pH值大于pI ，则蛋白质分子带负电荷，在电场中向正极移动。不同的蛋白质分子，由于所带电荷不同，移动的方向或速度不同，从而达到分离的目的。
三、试剂和器材
1. 试剂
（1）新鲜血清（无溶血现象）；
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（2）巴比妥一巴比妥钠缓冲液（pH8.6，离子强度0.075）：
称取巴比妥钠（A.R）10.30g、巴比妥（A.R）1.84g溶于蒸馏水中再加蒸馏水定容至1000mL。
（3）染色液：
氨基黑10B 0.5g或0.25g、甲醇（A.R）50mL、冰醋酸（A.R）10mL、蒸馏水40mL，将以上试剂混匀后贮存在具塞试剂瓶中可反复使用。
（4）漂洗液：
95%乙醇（A.R）45mL、冰醋酸（A.R）5mL、蒸馏水50mL、以上试剂混匀后放入具塞试剂瓶中贮存。
2. 器材
（1）醋酸纤维素薄膜条 2×8cm； （2）培养皿（Φ9-10cm）；
（3）点样用载玻片； （4）电泳仪和电泳槽；
（5）直尺和铅笔； （6）竹镊子；
（7）普通滤纸； （8）电吹风。
四、实验操作
（一）仪器和薄膜准备
1. 醋酸纤维薄膜的润湿和选择
将醋酸纤维薄膜条（8×2cm）浸于盛有巴比妥缓冲液的培养皿内，使它漂浮在液面。若迅速润湿，整条薄膜色泽深浅一致，则表明薄膜质地均匀；若润湿时，薄膜上出现深浅不一的条纹或斑点等，则为薄膜厚薄不匀。应选用质地均匀的薄膜条。因为，纤维素薄膜的质量对电泳的结果影响很大。例如，膜厚薄不均匀可以造成区带歪扭不齐，各区带界限不清，背景脱色困难，实验结果难于重复等现象。
将选用的薄膜用镊子轻压，使它全部浸入缓冲液内，待膜完全浸透（约半小时）后取出，夹在清洁的滤纸中间，轻轻吸去多余的缓冲液，同时分辨出光泽面和无光 12
泽面，并用铅笔做上记号（在无光泽面上）
2. 制作“滤纸桥”
剪裁尺寸合适的滤纸条，取双层附着在电泳槽的支架上，使它的一端与支架的前沿对齐，而另端浸入电极槽的缓冲液内，然后，用缓冲液将滤纸全部润湿并驱除气泡，使滤纸紧贴在支架上，即为“滤纸桥”。按同样方法，在另一个电极槽支架上制作相同的“滤纸桥”。它们的作用是联系醋酸纤维素薄膜和两电极缓冲液之间的中间“桥梁”。
（二）点样
用点样管吸取血清2-3微升，将此血清涂在载玻片的一端截面上（玻片宽度应小于薄膜的宽度），然后轻轻与距纤维薄膜一端1.5cm处接触，样品即呈一条状涂于纤维膜上。切不可用力过大把薄膜弄破。待血清透入膜内后，马上移去载玻片，将薄膜平贴在电泳槽的滤纸桥上，点样面朝下，点样端放在阴极，加盖密封平衡10分钟后进行电泳。
（三）电泳
电压10-25V/薄膜每cm长，电流0.4-0.6mA/薄膜每cm宽，通电0.5-2小时，待电泳区带展开约25-35mm（即2.5-3.5cm）后关闭电源。
（四）显色
电泳完毕立即取出薄膜条，直接浸入染色液中，染色10分钟（薄膜不要重叠）。然后，用漂洗液浸洗，每10分钟左右换一次漂洗液，连续更换5次，至背景无色为止，将膜条夹在干净的滤纸中，吸去多余的溶液。
（五）结果判断
一般在显色后的薄膜上可显现清楚的五条区带。从正极端起，依次为清蛋白、а1球蛋白、а2球蛋白、β球蛋白和γ球蛋白。
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五、注意事项
1. 点样时要均匀，量不宜多也不宜少。
2. 电泳过程中，应注意控制电压和电流强度，一般调节到薄膜每cm宽的电流强度为0.4-0.6毫安，防止过高或过低。
3. 染色时，要注意控制染色和漂洗的时间，防止背景过深或某些区带太浅。
六、思考题
1. 指出醋酸纤维薄膜用作电泳支持物有何优点？
2. 为什么要将点样端放在负极进行电泳？
3. 什么是电泳？泳动度？电泳种类有哪几种？
4. 影响泳动度的主要因素有哪些？
5. 本实验是根据蛋白质的什么性质进行设计的？
6. 查阅人血清中五种蛋白质的分子量和等电点，试分析人血清中五种蛋白质的泳动速度和方向及图谱，看其分析是否与电泳图谱一致。
7. 本实验方法是否可用于猪血清、牛血清、鸡血清的分离？应用的关键是要了解其什么性质？
8. 本实验要注意哪些操作细节？为什么？
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