实验1 叶绿素a、b含量的测定（乙醇）（分光光度法）
一、目的
学会Chla、b含量的测定方法，了解叶片中Chla、b的含量。
二、材料用具及仪器药品
菠菜叶片、721分光光度计、天平、研钵、剪刀、容量瓶（25ml）、漏斗、滤纸、乙醇（95%）
三、原理
叶绿素a、b在波长方面的最大吸收峰位于665nm和649nm，同时在该波长时叶绿素a、b的比吸收系数K为已知，我们即可以根据Lambert Beer定律，列出浓度C与光密度D之间的关系式：
D665=83.31Ca+18.60Cb…………………………….(1)
D649=24.54Ca+44.24 Cb…………………………….(2)
(1)(2)式中的D665、D649为叶绿素溶液在波长665nm和649nm时的光密度。
为叶绿素a、b的浓度、单位为每升克数。
82.04、9.27为叶绿素a、b在、在波长665nm时的比吸收系数。
16.75、45.6为叶绿素a、b在、在波长649nm时的比吸收系数。
解方程式(1)(2)，则得 ：
CA=13.7 D665—5.76 D649………………………(3)
CB=25.8 D649—7.6 D665……………………… (4)
G=CA+CB=6.10 D665+20.04 D649………(5)
此时，G为总叶绿素浓度，CA、CB为叶绿素a、b浓度，单位为每升毫克，利用上面（3）（4）（5）式，即可以计算叶绿素a、b及总叶绿素的总含量。
四、方法步骤
1．称取0.05克新鲜叶片，剪碎，放在研钵中，加入乙醇1ml共研磨成匀浆，再加5ml乙醇，过滤，最后将滤液用乙醇定容到10ml。
2．取一光径为1cm的比色杯，注入上述的叶绿素乙醇溶液，另加乙醇注入另一同样规格的比色杯中，作为对照，在721分光光度计下分别以665nm和649nm波长测出该色素液的光密度。
计算结果：
叶绿素a含量（mg/g. FW）=
叶绿素b含量（mg/g.FW）=
叶绿素总量（mg/g.FW）=
五、实验报告
计算所测植物材料的叶绿素含量。
六、思考题
1、分光光度法与一般比色法有何异同？
2、叶绿素a、b在红光和蓝光区都有一最大吸收峰值，能否用蓝光区的最大吸收波长进行叶绿素a、b的定量分析，为什么？
实验2生长素对根芽生长的不同影响
一、原理
生长素包括植物体内产生的吲哚乙酸及人工合成的化学试剂萘乙酸、2,4－D等，均有刺激植物生长的作用。如促进细胞的生长与分化，加速根、芽的伸长、促进果实的形成与种子的萌发等。但不同浓度作用不一样，一般来说，在浓度小或者用量少时有刺激生长的作用。在浓度大或者用量过多时，则抑制生长，甚至会导致植物死亡。不同器官和不同位置的组织对生长素的反应也不一样，如刺激芽生长的浓度比刺激根生长的浓度要大些。
二、仪器及试剂
（1）培养皿 （9cm） （2）移液管 （0.1ml；10ml） （3）10ppm萘乙酸 （4）滤纸（7cm）
三、实验步骤
1、洗净、烘干五套培养皿，在皿的边缘贴上标签，分别标明
（1）10ppm； （2）10-1ppm （3）10-3ppm （4）10-5ppm （5）蒸馏水；
2、在（1）皿中用10ml移液管加入10ppm萘乙酸溶液10ml；
3、在（2）－（5）皿中各加蒸馏水9.9ml；
4、用0.1ml移液管从（1）皿中吸取0.1ml萘乙酸溶液加入（2）皿充分混匀后，再从（2）皿中吸取0.1ml加入（3）皿中，如此继续稀释至（4）皿，即成各皿所标志浓度，最后从（4）皿吸出0.1ml弃去。
5、在每个培养皿中加入洁净的滤纸两张，纸上均匀排放大小相似而发芽一致（刚露白点）的水稻种子10粒，加盖后放在室内。
6、3－5天后，分别测量不同处理中萌发种子根、芽的长度。并将实验所测结果记录于下表，试比较不同浓度的萘乙酸溶液对于水稻幼苗根、芽生长的影响（促进或抑制）
不同浓度萘乙酸对水稻根芽生长的影响
备注：
1、水稻种子的萌发：在30℃下浸种2－3天，然后在30℃以下保湿催芽至露白点（约1－2天）。
2、1000ppm母液的配制：在分析天平上称萘乙酸0.1克用95％酒精少许将其溶解后，倒入100ml容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度。
3、10ppm萘乙酸溶液的配制：用移液管吸取母液1ml，加蒸馏水定容于100ml容量瓶中。
四、注意事项
1、生长素浓度要尽量配制准确。
2、试验中要防止生长素污染。
五、思考题：
在进行生长素实验时，为什么要用NAA代替IAA？
实验3 植物叶片光合作用的测定（干重法）
一、原理
一般来说，植物叶片所处的内外因素相同时，它们彼此间光合产量也势必相等，这样在对称的叶片上，假设叶片两边所处条件相同，则两侧的光合产量也相等，因此，先测一半叶的单位面积的干重，待进行一定时间的光合作用后，再测另一半叶的单位面积干重，二者之差，加上同时吸收消耗及运出部分的重量，即为该时间内的光合产量。
二、仪器及试剂
（1）小刀或剪刀 （2）黑布袋 （3）纱布 （4）钻孔器 （5）小标签 （6）干燥器（7）铝盒 （8）胶塞 （9）分析天平 （10）烘箱 （11）5％三氯乙酸
三、实验用品
1、样品的选择：在橡胶树或榕树上选中上部老化叶蓬的中间叶片，所选的叶在实验期间须不受遮荫且光照良好，选妥以后在半片叶上，写明编号（光1、光2、光3）。
2、用三氯乙酸涂叶柄、叶脉；叶柄多涂几次。注意三氯乙酸不要涂到叶肉上。
3、剪取样品：叶柄处理完毕，剪下未编号的半叶，夹于湿纱布中，并在叶片上编号（暗1、暗2、暗3），置于黑布袋中取回。
4、待留在树上的半叶进行6－7小时光合作用后，将其剪下置于黑布袋内取回。
5、称重比较：将光、暗两种叶片，用钻孔器打取小圆片各40片，注意不要打到粗的叶脉。分别将“光”和“暗”两种不同处理了的叶片放入铝盒中，在85℃下烘干5小时，取出，放入干燥器中，冷却后，分别在天平上称重，铝盒和叶片的重量减去铝盒重量，即为叶圆片的重量。
6、注意事项：
（1）选择样片时，要注意生理条件一致，对称性好。
（2）在光合期间保证有阳光照到选取的样本叶片。
四、计算：
五、实验作业
记录实验结果并解释之。
六、思考题
1、阻碍光合产物外运的方法有哪些？这些方法对测定结果有何影响？为什么？
2、什么是净光合强度？什么是总光合强度？该实验属于哪一类？为什么？
3、目前在实验室内，用于测定光合强度而灵敏度较高的方法有哪些？其原理是什么？（列举2－3种）
4、根据半叶法原理，如果让你设计一个实验来测定植物叶片呼吸强度，该如何进行？（写出简要步骤）
实验4 用CO2排出法测定呼吸强度
一、原理
植物进行呼吸作用，可通过单位时间内所吸收的O2或放出的CO2来测定。本实验是把植物材料置于密闭系统中，用抑制浓度和数量的Ba(OH)2作为植物呼出的CO2吸收基质，然后再用草酸滴定Ba(OH)2的剩余量，其反应如下：
Ba(OH)2＋CO2→BaCO3↓＋H2O…………………………………（1）
O OC
Ba(OH)2＋（COOH）2→Ba ↓+2H2O……………… (2)
O OC
同时作一空白对照，二者的差数，即为呼吸作用放出的CO2量。
二、仪器及试剂
（1）大红花 （2）广口瓶 （3）橡胶瓶塞 （带孔、带钩） （4）线 （5）小铁钩 （6）0.05mol/L氢氧化钡溶液 （7）0.05mol/L草酸溶液 （8）酚酞指示剂
三、实验步骤
（一）空白实验：准确地称取25毫升0.05mol/L Ba(OH)2溶液于广口瓶中，随即塞紧瓶塞，充分摇动几分钟，使瓶内CO2被Ba(OH)2吸收，接着拔去瓶塞上的小橡皮塞，加入1－2滴酚酞指示剂，然后将滴定管插入小孔中，用0.05mol/L（COOH）2滴定致红色刚退为止，记下草酸的消耗量。
（二）呼吸强度的测定：先将瓶盖上小孔用纸帖好，称取大红花1朵，用线扎住，挂于瓶塞钩上，长度适中，而后，装入25毫升0.05mol/LBa(OH)2溶液到广口瓶中，放入大红花，随即塞紧瓶塞，并记录时间，同时摇动瓶子，待40－50分钟后，取出植物材料再盖紧瓶塞，与空白试验同样，分别加入指示剂并用草酸滴定，记下草酸的消耗量。
四、计算
注：A为对照草酸的消耗量ml、B为呼吸瓶草酸的消耗量ml、44为CO2时的摩尔数
W为呼吸的材料重量（g）、T为净呼吸的时间（小时）
实验5植物组织中自由水和束缚水含量的测定
一、原理
植物组织中的水分是由被胶粒所固着的束缚水以及不被胶粒所固着的自由水两部分所组成。束缚水不易蒸发和结冰，不能转为溶剂，也不易被夺取。所以当植物组织被浸入较浓的糖溶液中脱水，一定时间后仍未被夺取的水分为束缚水，而被夺取的水分作为自由水。自由水的量可根据所加糖液浓度的降低量来计算。再由植物组织的总含水量减去自由水量，即可求得束缚水量。
植物体内自由水束缚水含量及其比值率与植物的生长及抗性有密切关系。自由水较多时，代谢活动常较强，生长速度也较快，但抗性往往降低。而束缚水含量多时，则情况相反，所以自由水与束缚水含量往往作为植物抗性生理的一个指标。
二、仪器与药剂
（1）阿贝折射仪或糖量计 （2）滤纸 （3）烘箱 （4）称量瓶 6个 （5）天平 1/10000 （6）移液管 5ml、10ml、25ml （7）钻孔器 （8）菜心叶片 （9）60％蔗糖溶液
三、实验步骤
1、取铝盒两个，洗净，烘干，称重备用。
2、取待测样品、快速剪碎，分别放于两个已知重量的铝盒重，盖上盖子以免水分蒸发。
3、在天平上称重，记录后，1号盒置于100－105℃烘箱中烘干至恒重，以计算含水量占鲜重的百分数。
4、用5ml移液管吸取60％的蔗糖5ml，加入2号盒中摇匀测糖百分数B1，然后加盖后再在天平上称重，以求得所加糖液重量B，并摇动盒中溶液，使与样品混和均匀，放于荫凉处30分钟，其间不时摇动。
5、用滴管吸取2号瓶中上层透明的溶液，滴一滴在折射仪棱镜（或糖量计）的毛玻璃上，旋紧棱镜，在20℃下测定此浸出液的含糖百分数B2及原来糖液的百分数B1（蔗糖溶液的原始浓度t必须在折射仪上测得）。
6、计算：按下式计算植物样品中自由水含量％。
…………………………………（1）
式中：β为自由水含量％
B为加入样品中蔗糖溶液重
B1为原蔗糖溶液浓度百分数
B2为加样放置一段时间后糖溶液的浓度百分数
Wf为植物样品鲜重
求得自由水含量％后，即可根据下式求出束缚水含量％
束缚水含量％＝组织含水量－组织中自由水％
四、实验作业
测定同一植物不同品种的自由水和束缚水含量，实验重复三次，把结果填入下表：
植物组织自由水和束缚水含量测定记录表
五、思考题
测定自由水和束缚水含量有何意义？
第二篇：植物生理学实验指导
实验1 植物组织渗透势的测定（质壁分离法）
原 理
当植物组织细胞内的汁液与其周围的某种溶液处于渗透平衡状态，植物细胞内的压力势为零时，细胞汁液的渗透势就等于该溶液的渗透势。该溶液的浓度称为等渗浓度。
当用一系列梯度浓度溶液观察细胞质壁分离现象时，细胞的等渗浓度将介于刚刚引起初始质壁分离的浓度和尚不能引起质壁分离的浓度之间的深液浓度。代入公式即可计算出春渗透势。
仪器药品
显微镜 载玻片及盖玻片
镊子 刀片
配成0.5—0.1mol/L梯度浓度的蔗糖溶液各50ml。
称34.23g蔗糖用蒸馏水配成100ml，其浓度为1m0le/L（母液）。再配制成下列各种浓度：
0.50mol/L：吸母液25ml+水25ml
0.45mol/L：吸母液22.5ml+水27.5ml
0.40mol/L：吸母液20.0ml+水30.0ml
0.35mol/L：吸母液17.5ml+水32.5ml
0.30mol/L：吸母液15.0ml+水35.0ml
0.25mol/L：吸母液12.5ml+水37.5ml
0.20mol/L：吸母液10.0ml+水40.0ml
0.15mol/L：吸母液7.5ml+水42.5ml
0.10mol/L：吸母液5.0ml+水45.0ml
操作步骤
将带有色素的植物组织（叶片），一般选用有色素的洋葱鳞片的外表皮、紫鸭跖草、苔藓、红甘蓝或黑藻、丝状藻等水生植物，也可用蚕豆、玉米、小麦等作物叶的表皮。撕取下表皮，迅速分别投入各种浓度的蔗糖溶液中，使其完全浸入，5—10分钟后，从0.5mol/L开始依次取出表皮薄片放在滴有同样溶液的载玻片上，盖上盖玻片，于低倍显微镜下观察，如果所有细胞都产生质壁分离的现象，则取低浓度溶液中的制片作同样观察，并记录质壁分离的相对程度。实验中必须确定一个引起半数以上细胞原生质刚刚从细胞壁的角隅上分离的浓度，和不引起质壁分离的最高浓度。
在找到上述浓度极限时，用新的溶液和新鲜的叶片重复进行几次，直至有把握确定为止。在此条件下，细胞的渗透势与两个极限溶液浓度之平均值的渗透势相等。
将结果记录下表中。
测出引起质壁分离刚开始的蔗糖溶液最低浓度和不能引起质壁分离的最高浓度平均值之后，可按下列公式计算在常压下该组织细胞质液的渗透势。
为细胞渗透势。
R为气体常数=0.083×105/L·Pа/mol·K。
T为绝对温度，单位K，即273℃+t，t为实验湿度。
I为解离系数，蔗糖为1。
C为等渗溶液的浓度，单位为mol/L。
则：=0.083×105×(273℃+t)×1×C
实验人 时期 材料名称 实验时室温 ℃
实验2 植物组织水势的测定（小液流法）
原理
水势表示水分的化学势，象电流之由高电位处流向低电位处一样，水从水势高处流向低处。植物体细胞之间，组织之间以及植物体和环境间的水分移动方向都由水势差决定。
当植物细胞或组织放在外界溶液中时，如果植物的水势小于溶液的渗透势（溶质势），则组织吸水而使溶液浓度变大；反之，则植物细胞内水分外流而使溶液浓度变小；若植物组织的水势与溶液的渗透势相等，则二者水分保持动态平衡，所以外部溶液浓度不变，而溶液的渗透势即等于所测植物的水势。可以利用溶液的浓度不同其比重也不同的原理来测定试验前后溶液的浓度的变化，然后根据公式计算渗透势。
仪器药品
试管 毛细滴管
移液管 剪刀
镊子 甲烯蓝
操作步骤
首先配制一系列不同浓度的蔗糖溶液（0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8 mol/L）各10 ml注入8支试管中，各管都加上塞子，并编号。按编号顺序在试管架上排成一列，作为对照组。
另取8支试管，编好号，按顺序放在试管架上，作为试验组。然后由对照组的各试管中分别取溶液4ml移入相同编号的试验组试管中，再将各试管都加上塞子。
用剪刀将菠菜叶剪成约0.5cm2大小相等的小块60—80片。向试验组的每一试管中各加相等数目（约10片）的叶片小块，塞好塞子，放置30分钟，在这段时间内摇动数次，到时间后，向每一试管中各加甲烯蓝粉末少许，并振荡，此时溶液变成蓝色。
用毛细滴管从试验组的各试管中依次吸取着色的液体少许，然后伸入对照组的相同编号试管的液体的中部，缓慢从毛细滴管尖端横向放出一滴蓝色试验溶液，并观察小液滴移动的方向。
如果有色液滴向上移动，说明溶液从细胞液中吸出水分而被冲淡，比重比原来小了；如果有色液向下移动，则说明细胞从溶液中吸了水，溶液变浓，比重变大；如果液滴不动，则说明试验溶液的密度等于对照溶液，即植物组织的水势等于溶液的渗透势。
记录液滴不动的试管中蔗糖溶液的浓度。
重复测定一次。
按
计算水势。式中
为细胞水势，其余符号同实验4。
注意：毛细滴管要各个浓度专用。
实验3 蒸腾强度的测定（钴纸法）
原理
本实验方法系根据氯化钴纸在干燥时为蓝色，当吸收水分后，变为粉红色，根据变色所需时间的长短，然后按钴纸标准吸水量计算出作物蒸腾强度。
仪器药品
扭力天平 烘箱
干燥器 瓷盘
镊子 剪刀
玻璃板 载玻片
薄橡皮 有塞指管
滤纸 弹簧纸夹
5%氯化钴溶液（9.2g CoCl1·6H2O用蒸馏水配成100ml）滴几滴盐酸调成弱酸性。
操作步骤
1．氯化钻纸的制备
选取优质滤纸，剪成0.8cm宽，20cm长的滤纸条，浸入5%氯化钴溶液中，待浸透后取出，用吸水纸吸去多余的溶液，将其平铺在干洁的玻璃板上，然后置于60—80℃烘箱中烘干，选取颜色均一的钴纸条，小心而精确地切成0.8cm的小方块，再行烘干，取出贮于有塞指管中，再放入氯化钙干燥器中备用。
2．钴纸标准化
使用前，先将钻纸标准化。测出每一钴纸小方块由蓝色转变成粉红色需吸收多少水量。取1—2钴纸小方块，置于扭力天平上称重，并记下开始称重的时间，及每隔一分钟记一次重量，当钻纸蓝色全部变为粉红色时，要立即准确地记下重量和时间，如此重复数次，计算出钻纸小方块由蓝色变为粉红色时平均吸收多少水分，以mg表示，作为钴纸吸水量。
3．测定
取二片玻片，薄橡皮一小块，在其中央开1cm2的小孔，用胶水将它固定在玻片当中，另准备一只弹簧夹。
用镊子从干燥器（管）中取出钻纸小块，放在玻片上的橡皮小孔中，立即置于待测作物叶子的背面（或正面），将另一玻片在叶子的正面（或背面）的相应位置上，用夹子夹紧，同时记下时间，注意观察钻纸的颜色变化，待钻纸全部变为粉红色时，记下时间。以时间的长短作相对比较，可用钻纸小方块的标准吸水量成小纸块由蓝色变为粉红色所需的时间来计算术为该叶片表面蒸腾的强度，用mg/cm2·min表示之。
本实验可选择不同作物的功能叶片，或同一作物的不同部位的叶片测其蒸腾强度，或者可测定作物在不同环境条件下的蒸腾强度。例如光和暗对植物蒸腾作用的影响，事先把一组盆栽的蚕豆、小麦或其他植物放在黑暗中过夜或几个小时，另一组放在光下，二者都要适当灌水，分别测其蒸腾强度（注：黑暗中的植物在测定时可移到实验室柔和的光线下进行）。
每一处理最少要测10次左右，然后求其平均值。
实验4 小孔的扩散（示范）
原 理
气孔蒸腾是植物散失水分的主要途径，气孔口很小，其总面积一般不超过叶面积的1%，可是叶子通过气孔蒸腾所损失的水分却达到与叶面积相等的自由表面的50—80%，如此惊人的蒸腾量，可以用小孔扩散原理加以说明。水分通过小孔扩散的量和小孔的周缘长度成正比，而和小孔面积不成比例。通过此试验所产生的现象，可以证明小孔边缘效应的存在。
仪器获品
小烧杯 台天平
培养皿 刀片
尺及解剖针 卡片纸
1%琼脂 石蜡
红墨水或蓝墨水 酒糟或丙酮
操作步骤
1．物质通过小孔扩散的途径
预备聚乙烯塑料薄膜（可用食品袋）一张，大小约5×5cm，取解剖针于煤气灯上加热，在薄膜中央穿刺一小孔。配制1%琼脂，倒在一小烧坏中，如用10ml小烧杯，则更易于观察。待琼脂还未完全凝固时，将薄膜小心地贴在琼脂的表面，使小孔位于烧杯的中央。等琼脂凝固后，在薄膜上面倒上有色溶液少许。4—5小时后，即可看到有色溶液通过小孔向琼脂凝胶中扩散，形成一个有色的半球形，它显示染料通过小孔扩散的途径。
2．将卡片纸剪成与培养皿大小一致的圆片，然后在一张卡片纸的中部剪成一正方形大孔，每边长3cm，则面积为9cm2。在另一卡片纸上剪成数个小孔，其总面积与大孔完全相等。为此，将其剪成 9个每边长1cm的正方形小孔，并使其均匀地分布在圆形卡片纸上。再将此卡片纸浸于熔化的石蜡中，取出盖于培养皿上，并用石蜡将边缘封严。于两皿中各加入等量的酒精（或丙酮），将此皿分别置于台天平两边用酒精调节使之平衡。隔15—30分钟后，由于小孔具有较高的边缘效应，酒精蒸发较快，因此台天平指针倾向大孔一边，由此可看出孔的总面积虽相等，但酒精通过小孔的散失比大孔要快得多。证明小孔的边缘效应要大，因其周缘长度比大孔大。
实验5 单盐毒害及离了间拮抗现象
原理
离子间的拮抗现象的本质是复杂的，它可能反映不同离子对原生质亲水胶粒的稳定度、原生质膜的透性，以及对各类酶活性调节等方面的相互制约作用，从而维持机体的正常生理状态。
仪器药品
烧杯 纱布
石蜡 0.12mol/L KCl
0.06mol/L CaCl2 0.12mol/L NaCl
（所用药品均需用AR）
操作步骤
实验前3—4天选择饱满的小麦种子100粒浸种，在室温下萌发，待根长1cm时即可用作材料。
取4个小烧杯，依次分别倒人不列盐溶液：
（1）0.12mol／L KCI
（2）0.06 mol／L CaCl2
（3）0.12 mol／L NaCI
（4）0.12 mol／L NaCl 100 ml＋0.06 mol／L CaCl2 1 ml十0.12mol／L KCl 2.2 ml小烧杯用涂石蜡的纱布盖上。挑选大小相等及根系发育一致的小麦幼苗10株或20株，小心种植在纱布盖的孔眼里，使根系接触到溶液，在室温下培育2—3星期后，即可看出在单盐溶液中，小麦幼苗生长，特别是它们的根部出现畸形。
实验6 植物根系对离子的选择吸收
原理
植物根系对不同离子吸收量是不同的，即使是同一种盐类，对阳离子与阴离子的吸收量也不相同。本实验是利用植物对不同盐类的阴、阳离子吸收量不同，使溶液的pH发生改变以说明这一吸收特性。此实验也使我们了解什么是生理酸性盐与生理碱性盐。
仪器药品
pH计 精密pH试纸
移液管 100ml三角烧瓶
0.5mg/ml（NH4）2SO4 0.5mg/ml NaNO3
操作步骤
1．在实验前约2—3周按实验19方法培养根系完好的小麦（或其他植物）植株。
2．实验开始时吸取0.5mg/ml浓度的（NH4）2SO4和NaNO3各100ml分别置于两个100ml三角烧瓶中，另一三角烧瓶中放蒸馏水 100ml。用 pH计或精密pH试纸测定以上各溶液和蒸馏水的原始pH值。
3．取根系发育完善的、大小相似的小麦3份，每份数株，但数目相等，分别放于上述3个三角烧瓶中，在室温下经2一3小时后*取出植株，并测定溶液的pH值。实验结果按下表记录。
植物从盐溶液中吸收离子后溶液pH值的变化
注：为了避免根系的分泌作用影响实验结果，故用蒸馏水作对照，将上述pH值变化进行修正，即得真实的pH变化。
实验7 钾离子对气孔开度的影响
原理
保卫细胞的渗透系统歌可由钾离子所调节，无论是环式或非环式光合磷酸化，都可形成ATP。ATP不断供给保卫细胞原生质膜上的钾－氯离子交换泵作功，支持保卫细胞逆着离子浓度差而从周围表皮细胞吸收钾离子，降低保卫细胞的渗透势，从而使气孔张开。
仪器药品
显微镜
镊子 温箱
载玻片、盖玻片 培养皿
0.5%硝酸钾 0.5%硝酸钠
操作步骤
1．配0.5%KNO3及0.5%NaNO3溶液。
2．在3个培养皿中分别放0.5%KNO3、0.5%NaNO3及蒸馏水各15ml。
3．撕蚕豆叶表皮若干放入上述3个培养皿中。
4．培养皿放入25℃温箱中，使溶液温度达到25℃。
5．将培养皿置于人工光照条件下照光半小时。
6．分别在显微镜下观察气孔的开度。
实验8 植物的元素缺乏症（溶液培养）
原理
植物的生长发育，除需要充足的阳光和水分外，还需要矿质元素，否则植物就不能很好地生长发育甚至死亡。应用溶液培养技术，可以观察矿质元素对植物生活的必需性；用溶液培养做植物的营养试验，可以避免土壤里的各种复杂因素。近年来也已应用溶液培养进行无污染蔬菜的栽培生产。
仪器药品
分析天平 培养缸（瓷质或塑料）
鱼缸打气泵 量筒
烧杯 移液管
按下表分别配制贮备液，所用药品均需为分析纯：
操作步骤
1．材料准备
番茄、蓖麻、小麦、玉米等都作为材料。粒小的种子，从种了带来的营养元素少，缺乏症容易出现，粒大的种子可以在幼苗未做缺元素培养之前，先将胚乳（或子叶）除去，这样也可以加速缺乏症的出现。种子用漂白粉溶液灭菌30分钟，用无菌水冲洗数次，然后放在洗净的石英砂中发芽，加蒸馏水，等幼苗长出第一真叶时待用。
2．配制缺元素培养液
按下表用量配制缺元素培养液：
配制时先取蒸馏水900ml，然后加入贮备液，最后配成1 000ml，以避免产生沉淀。培养液配好后，用稀酸、碱调节至pH5—6
3．培养观察
先取大小一致的植株，用泡沫塑料包裹茎部，插入培养缸盖的孔中，每孔一株。将培养缸移到温室中，经常注意管理并观察，用蒸馏水补充缸中失去的水分。每隔一定时间（一周左右，随植株大小而定）更换培养溶液，并测定换出溶液的pH。植株长大后要通气，通气可用鱼缸打气泵。注意记录植株的生长情况，各种元素缺乏症的症状及出现的部位。
4．元素缺乏症检索
1．老叶受影响。
（1）影响遍及全株，下部叶子干枯并死亡。
a.植株淡绿色，下部叶子发黄，叶柄短而纤弱……缺N
b.植株深绿色，并出现红或紫色，下部叶子发黄，叶柄短而纤弱……………………缺P
（2）影响限于局部，有缺绿斑，下部叶子不干枯，叶子边缘卷曲呈凹凸不下。
a.叶子缺绿斑有时变红，有坏死斑，叶柄纤弱………………缺Mg
b.叶子缺绿斑，在叶边缘和近叶消耗或叶脉间出现小坏死斑，叶柄纤弱…………缺K
c．叶子缺绿斑，叶子包括叶脉产生大的坏死斑，叶子变厚，叶柄变短…………缺Zn
2．幼叶幼叶受影响。
（1）顶芽死亡，叶子变形和坏死。
a.幼叶变钩状，从叶尖和边缘开始死亡………………………………………………缺Ca
b.叶基部淡绿，从基部开始死亡，叶子扭曲…………………………………………缺B
（2）顶芽仍活着，缺绿或萎蔫而无坏死斑。
a.幼叶萎焉，不缺绿，茎尖弱……………………………………………………缺Cu
b.幼叶不发生萎蔫，缺绿。
（a）有小坏死斑，叶脉仍绿色…………………………………………………………缺Mn
（b）无坏死斑，叶脉仍绿色…………………………………………………………缺Fe
（c）无坏死斑，叶脉坏死………………………………………………………………缺S
5．待植株症状表现明显后，将缺元素培养液换成完全培养液，留下一株继续培养，观
察植株症状是否减轻以至消失。其余植株测量根、茎的长度，重量，叶子数目、大小和重量，节数和节间长度，然后在烘箱中烘干，作为实验15、16、17、18的材料，测定植株中的氮，磷，铁，铜的含量。
实验9 硝酸还原酶活性的测定
原理
硝酸还原酸是植物氮素代谢作用中关键性酶，与作物吸收各利用氮肥有关。它作用于NO-3使还原为NO-3；
NO-3+NADH+H+→NO-2+NAD++H2O
产生的NO-2可以从级织内渗透到外界溶液中，并积累在溶液中，测定反应溶液中NO-2含量的增加，即表现该酶活性的大小。这种方法简单易行，在一般条件下都能做到。
NO-2含量的测定用磺胺[对氨基苯磺酸胺（sulfanil-amide）]比色法。在酸性溶液中磺胺与NO-2形成重氮盐，再与α-萘胺偶联形成紫红色的偶氮染料。反应液的酸度大则增加重氮化作用的速度，但降低偶联作用的速度，颜色比较稳定。增加温度可以增加反应速度，但降低重氮盐的稳定度，所以反应需要在相同条件下进行。这种方法非常灵敏，能测定每ml含0.5μg的NaNO2。
仪器药品
721型分光光度计 真空泵（或注射器）
保温箱 天平
真空干燥器 钻孔器
三角烧瓶 移液管
烧杯
0.1mol/L磷酸缓冲液，pH7.5（见附表2）。
0.2mol/L KNO3：溶解20.22gKNO3于1 000ml蒸馏水中。
磺胺试剂：1g磺胺加25ml浓盐酸，用蒸馏水稀释至100ml。
α-萘胺试剂：0.2gα-萘胺溶于含1ml浓盐酸的蒸馏水中，稀释至100ml。
NaNO2标准溶液：1g NaNO2用蒸馏水溶角成1 000ml。然后吸取5ml，再加蒸馏水稀释成1 000ml，此溶液每ml含有NaNO2 10μg，用时稀释之。
操作步骤
1．将新鲜取回的叶片（蓖麻、烟草、向日葵、油菜、小麦、棉花等均可）水先，用吸水纸吸干，然后用钻孔器钻成直径约1cm的圆片，用蒸馏水洗涤2—3次，吸干水分，然后于台天平上称取等重的叶子圆片两份，每份约0.3—0.4g（或每份取50个圆片），分别置于含有下列溶液的50ml三角烧瓶中：（1）0.1mol/L磷酸缓冲溶液（pH7.5）5ml+蒸馏水5ml；（2）0.1mol/L磷酸缓冲溶液（pH7.5）5ml+0.2mol/L KNO3 5ml。然后将三角烧瓶置于真空干燥器中，接上真空泵抽气，放气后，圆片即沉于溶液中（如果没有真空泵，也可以用20ml注射器代替，将反应液及叶子圆片一起倒入注射器中，用手指堵住注射器出口小孔，然后用力拉注射器使真空，如此抽气放气反复进行多次，即可使圆片中的空气抽去而沉于溶液中）。将三角烧瓶置于30℃温箱中，使不见光，保温作用30分钟，然后分别吸取反应溶液1ml，以测定NO-2含量。
注意取样前叶子要进行一段时间的光合作用，以积累碳水化合物，如果组织中的碳水化合物含量低，会使得酶的活性降低，此时则可于反应溶液中加入30μg 3-磷酸甘油醛或1，6-二磷酸果糖，能显著增加NO-2的产生。
2．NO-2含量的测定
保温30分钟的结束时，吸取反应溶液1ml于一试管中，加入磺胺试剂2ml及α-萘胺试剂2ml，混合摇匀，静置30分钟，用比色计进行比色测定，比色波长为520nm，记下吸光度或透光率，从标准曲线上查得NO-2含量，然后计算酶活性，以每小时每克鲜重产生的NO-2μg或μmol表示之。
3．绘制标准曲线
测定NO-2的磺胺比色法很灵敏，可以检出低于1μg/ml的NaNO2含量，可于0—5μg/ml浓度范围内绘制标准曲线。由于显色反应的速度与重氮化作用及偶联作用的速度有关，温度、酸浓度等都影响显色速度，同时也影响灵敏度，但如果标准与样品的测定都在相同条件下进行，则显色速度相同，彼此可以比较。
吸取不同浓度的NaNO2溶液（例如5、4、3、2、1、0.5μg/ml）1ml于试管中，加入磺胺试剂2ml及α-萘胺试剂2ml，混合摇匀，静置303分钟（或于一定温度的水浴中保温30分钟），立即于分光光度计中进行测定，测定时的波长为520nm，比色，读取吸光度或透光率。然后，以吸光度为纵坐标，NaNO2浓度为横坐标。于毫米方格纸上绘制吸光度-浓度曲线。
实验10 叶绿体色素的提取和分离（纸层析法）
原理
叶绿体色素是植物吸收太阳光能进行光合作用的重要物质，主要由叶绿素a、叶绿素b、胡萝卜素和叶黄素组成。从植物叶片中提取和分离色素是对其认识和了解的前提。利用叶绿体色素能溶于有机溶剂的特性，可用丙酮提取。
分离色素的方法有多种，纸层析是其中最简便的一种。当溶剂不断地从层析滤纸上流过时，由于混合物中各成分在两相（即流动相和固定相）间具有不同的分配系数，它们的移动速度不同，使样品中的混合物得到分离。
仪器药品
大试管 台天平
研钵 量筒
烧怀 漏斗
软木层 新华滤纸
丙酮 四氯化碳
无水硫酸钠 碳酸钙
石英砂
操作步骤
1．称取新鲜叶子2 g，放入研钵中加丙酮 5ml，少许碳酸钙和石英砂，研磨成匀浆，再加丙酮 5 ml，然后以漏斗过滤之，即为色素提取液。
2．取准备好的滤纸条（2×2 cm），将其一端剪去两侧，中间留一长约1.5cm，宽约0.5cm的窄条，如图7。
3．用毛细管取叶绿素溶液点于窄条的上方，注意一次所点溶液不可过多。如色素过淡，用电吹风吹干后再点1一2次。
4．在大试管中加入四氯化碳3—5ml及少许无水硫酸钠。然后将滤纸条固定于软木塞上，插入试管内，使窄端浸入溶剂中（色素点要略高于液面，滤纸条边缘不可碰图到试管壁），盖紧软木塞，直立于阴暗处进行层析。
5．经过0.5一1小时后，观察分离后色素带的分布。最上端橙黄色为胡萝卜素，其次黄色为叶黄素，再下面蓝绿色为叶绿素a，最后的黄绿色为叶绿素b。
实验11 植物体色素及其性质
原理
植物色素包括脂溶性的叶绿体色素和水溶性的细胞波色素，前者存在于叶绿体，与光合作用有关，如叶绿素；后者存在于液泡中，特别与花朵的颜色有关，如花青素属黄酮类物质。了解它们的性质有助于对其生理功能的理解。
仪器药品
分光计 天平
研钵 分液漏斗
移液管 量筒
吸球 试管
碳酸钙 氢氧化钾
丙酮 乙醚
甲酸 盐酸
醋酸铜
操作步骤
1．叶绿体色素的提取
取菠菜（或其他植物）叶子2g，放在研钵中，加石英砂和碳酸钙少许，丙酮约 5 ml，研磨成匀浆，再加丙酮15 ml，则得深绿色提取液，用漏斗过滤之，即为色素提取液。
2．叶绿素的荧光现象
取上述色素丙酮提取液少许于试管中，用反射光和透射光，观察提取液的颜色有无不同，反射光观察到的溶液颜色，即为叶绿素产生的荧光颜色．
3．光对叶绿素的破坏作用
取上述色素丙酮提取液少许，分装在2支试管中，1支试管放在黑暗处（或用黑纸包裹），另1支试管放在强光下（太阳光）经2一3小时后，观察两支试管中溶液的颜色有何不同？
4，铜在叶绿素分子中的替代作用
取上述色素丙酮提取液少许于试管中，1滴1滴加入浓盐酸，直至溶液出现褐绿色，此时叶绿素分子已遭破坏，形成去镁叶绿素。然后加醋酸铜晶体1小块，慢慢加热溶液，则又产生鲜亮的绿色。此即表明铜已在叶绿素分子中替代了原来镁的位置。
5．黄色素和绿色素的分离
取上述色素丙酮提取液 10 ml，加到盛有 20 ml乙醚的分液漏斗中，摇动分液漏斗，并沿漏斗边缘加入20ml蒸馏水，轻轻摇动分液漏斗，静置片刻，溶液即分为两层。色素已全部转入上层乙醚中，弃去下层丙酮和水，再用蒸馏水冲洗乙醚溶液1—2次。然后于色素乙醚溶液中加入5ml30%KOH甲醇溶液，用力摇动分液漏斗，静置10分钟，再加蒸馏水约 10 ml，摇动后静置分离，则得到黄色素层和绿色素层，分别保存于试管中。
6．观察色素溶液的吸收光谱
（1）调节分光计，观察电灯光的光谱。
（2）观察色素丙酮提取液，用丙酮将溶液稀释1倍比较之。
（3）观察黄色素乙醚溶液，用乙醚将溶液稀释1倍比较之。
（4）观察皂化叶绿素甲醇溶液，用甲醇将溶液稀释1倍比较之。
（5）观察被光破坏的色素丙酮溶液，试与（2）作比较。
（6）观察被铜取代了镁的色素溶液。
实验12 叶绿素 a和b含量的测定（分光光度法）
原理
如果混合液中的两个组分，它们的光谱吸收峰虽有明显的差异，但吸收曲线彼此又有些重叠；在这种情况下要分别测定两个组分，可根据Lambert-Beer定律，通过代教方法，计算一种组分由于另一种组分存在时对吸光度的影响，最后分别得到两种组分的含量。
如图9叶绿素a和b的吸收光谱曲线，叶绿素a的最大吸收峰在 663nrn，叶绿素 b在 645nrn，吸收曲线彼此又在重叠。
根据Lambert-Beer定律，最大吸收光谱峰不同的两个组分的混合液，它们的浓度C与吸光度A之间有如下的关系（参阅实验86）：
A1=Ca·ka1+Cb·kb1
A2=Ca·ka2+Cb·kb2
式中：Ca为组分a的浓度，g／L。
Cb为组分b的波度，g／L。
Al为在波长λ1（即组分a的最大吸收峰波长）时，混合液的吸光度A值。
A2为在波长λ2（即组分b的最大吸收峰波长）时，混合液的吸光度A值。
kal为组分a的比吸收系数，即组分a当浓度为 1g/L时，于波长λ1时的吸光度A值。
Kb2为组分b的比吸收系数，即组分b当浓度为1g／L时，于波长λ2时的吸光度A值。
ka2为组分a（浓度为1 g/L）在波长λ2时的吸光度A值。
Kb1为组分b（浓度为1 g/L）在波长λ1时的吸光度A值。
从文献中可以查得叶绿素a和b的80%丙酮溶液，当浓度为1g/L时，比吸收系数k值如下：
将表中数值代入上式（1）、（2），则得：
A663=82.04×Ca+9.27×Cb
A645=16.75×Ca+45.60×Cb
经过整理之后，即得到下式：
Ca=0.012 7A663－2.69A645 (3)
Cb=22.9A645－4.68A663 (4)
CT=Ca+Cb=8.02A663+20.21A645 (5)
（5）式中CT为总叶绿素浓度，单位为mg/L。
利用上面（3）、（4）、（5）式，即可计算出叶绿素a和b及总叶绿素的浓度。
注：一般大学教学实验室所用的人光光度计多为721型，属低级类型，其单色光的半波宽值要比中级类型的751型大得多，而叶绿素a和b吸收峰的波长相差仅18nm（663—645nm），难以达到精确测定。此外有时还由于仪器本身的标称波长与实际波长不符，测定的正确性就更差了。根据公式计算往往会得到叶绿素a∶b值小于1，这就不很奇怪了。除向学生说明其中原因外，还可以在实验前对仪器的波长进行校正，使标称波长与实际波长一致。校正可用纯的叶绿素a和b进行，分别在波长650—670nm和630—650nm之间，每隔1—2nm测定叶绿素a或b的吸光度A，以确定叶绿素a和b的吸收峰的波长。如果测得的峰值与文献上的峰值663nm和645nm不同，可按照仪器说明书步骤进行校正，或者更方便的方法可以打开仪器盖子，松动波长刻度盘紧固螺丝，调节刻度盘使波长至正确值，而后旋紧螺丝复原仪器。
为校正仪器波长所需的叶绿素a和b的用量是很少的，用纸层析法很快就能分离制得。取植物叶子约1g，用乙醚提取叶绿体色素，再用毛细管将色素溶液画在3mm厚滤纸上使成一直线，为使分离效果好，一般重复点样一次即可。然后于密闭容器中进行上行层析，溶剂为含0.5%丙醇的石油醚。层析结束，用剪刀小心地剪下蓝绿色的叶绿素a和黄绿素的叶绿素b，注意剪时尽量避开有可能遭污染的地区。最后分别浸于80%丙酮中，洗下叶绿素a和b。
实验13 叶绿体的分离
原理
分离叶绿体应在等渗溶液中制备，以减少渗透压对叶绿体的伤害，仔细研磨，然后离心取得叶绿体的悬浮液。整个过程应在0—5℃下进行，所有提取物、溶液和材料，也应保存在该温度下，分离后活性测定工作应尽快进行。
仪器药品
离心机 天平
容量瓶 量筒
移液管 研钵
烧杯 纱布
0.35mol/L NaCl
35m mol/L NaCl
10m mol/L Tris-HCl缓冲剂，Ph7.8（见附表2）
操作步骤
1．最好在晴天上午10时左右，选取健康的菠菜叶（也可用豌豆叶），洗净，擦干，去叶柄及主脉，称取10g鲜重在冰浴中研磨。
2．研磨时加入20ml 0.35mll/L NaCl，2ml 10 mmol/L Tris-HCl缓冲液，以及少量石英砂。
3．研磨成匀浆后，用4层纱布过滤于烧杯中。
4．滤液用1 000r/min离心2分钟，弃去沉淀，收集上清液。
5．上清液用3 000r/min离心5分钟，弃去上清液，沉淀即是叶绿体。
6．将沉淀分成2份，分别加入0.35mol/L NaCl溶液和35mmol/L NaCl溶液各10 ml，制成悬液，使叶绿体分别处于等渗和低渗溶液中，以获得完整叶绿体和破碎叶绿体。保存在冰箱中，用于实验41的测定。
实验14 离体叶绿体对染料的还原作用（希尔反应）
原理
离体的完整叶绿体，在合适的氧化剂存在下，例如染料二氯靛酚（DCPIP），当照光时，可以使水光解释放氧气，同时使染料还原，结果染料从原来的蓝色变为粉红色至无色。此反应为希尔所发现，故常称为希尔反应。可用分光光度计测定反应前后染料吸光度A的变化，变化在4—5分钟内呈线性关系。
仪器药品
721型人光光度计 试管架
烧杯 容量瓶
移液管 试管
100m mol/L磷酸缓冲液，pH7.3（见附表2）
0.3m mol/L 2，6二氯靛酚钠；称取8.7mg二氯靛酚钠，加蒸馏水定容至100ml（如药品纯度低，可适当提高浓度）。
操作步骤
1．加样
取干净试管6支，分为两组，并分别编成1、2、3号，然后按下表加入试剂。
注：（1）叶绿体悬液为实验40所制备。
（2）2号管加叶绿体悬液后于沸水浴上煮5分钟，然后用蒸馏水补足丧失的水分。
（3）3号管为比色时调节零点用。
（4）各试管都在最后加入二氯靛酚以开始反应，并立即摇匀进行比色测定，以代表作用时间为0。各管在加染料之前保存在冰浴中。
2．比色
当加入染料后立即摇匀倒入相应的比色杯中，迅速测定吸光度，波长为620nm，此即代表0时的吸光度。然后将比色杯置于离150W灯光约60cm处照光，每隔1分钟快速读下吸光度的变化，连续进行5、6次读数，严格控制照光时间。
3．将结果以每分钟A620的变化量（ΔA620/min）为纵坐标，以时间（分钟）为横坐标作图。
实验15 改良半叶法测定大田光合强度
原理
改良半叶法系将植物称叶片的一部分遮光或取下置于暗处，另一部分则留在光下进行光合作用，过一定时间后，在这两部分叶片的对应部位取同等面积，分别烘干称重。因为对称叶片的两对应部位的等面积的干重，开始时被视为相等，照光后叶片重量超过暗中的叶重，超过部分即为光合作用产物的产量，并通过一定的计算可得到光合作用强度。
仪器药品
分析天平 烘箱
剪刀 称量皿
刀片 金属模板
纱布 锡纸
三氯乙酸
操作步骤
1．选择测定样品
在田间选定有代表性植株叶片（如叶片在植株上的部位、叶龄、受光条件等）20张，用小纸牌编号。
2．叶子基部处理
为了不使选定叶片中光合作用产物往外运，而影响测定结果的准确性，可采用下列方法进行处理：
（1）可将叶子输导系统的韧皮部破坏。如棉花等双子叶植物的叶片，可用刀片将时柄的外皮环割约0.5 cm宽。
（2）如小麦、水稻等单子叶植物，由于韧皮部和木质部难以分开处理，可用刚在开水中浸过的纱布或棉花做成的夹子。将叶子基部烫伤一小段即可（一般用90℃以上的开水烫20秒）。
（3）由于棉花叶柄木质化程度低，叶柄易被折断。用开水烫，又难以掌握烫伤的程度，往往不是烫得不够便是烫得过重而叶片下垂，改变了叶片的角度。因此可改用化学方法来环割，选用适当浓度的三氯乙酸，点涂叶柄以阻止光合产物的输出。三氯乙酸是一种强烈的蛋白质沉淀剂，渗入叶柄后可将筛管生活细胞杀死，而起到阻止有机养料运输的作用。三氯乙酸的浓度，视叶柄的幼嫩程度而异。以能明显灼伤叶柄，而又不影响水分供应，不改变叶片角度为宜。一般使用5%三氯乙酸。
3．剪取样品
叶基部处理完毕后，即可剪取样品，记录时间，开始光合作用测定。一般按编号次序分别剪下对秋叶片的一半（主脉不剪下），按编号顺序夹于湿润的纱布中，贮于暗处。过4一5小时后，再依次剪下另外半叶，同样按编号夹于湿润纱布中，两次剪叶的速度应尽量保持一致，使各叶片经历相等的照光时数。
4．称重比较
将各同号叶片之两半按对应部位叠在一起，在无粗叶脉处放上已知面积（如棉花可用1.5×2cm）的金属模板，用刀片沿边切下两个叶块，分别置于照光及暗中的两个称量皿中，80—90℃下烘至恒重（约5小时），在分析天平上称重比较。
5．计算结果
叶片干重差之总和（mg）除以叶面积（换算成dm2，1dm2=100cm2）及照光时数，即得光合作用强度，以干物质，mg/（dm2·b）表示之。
计算公式如下：
光合作用强度=
由于叶内贮存的光合产物一般为蔗糖和淀粉等，可将干物质重量乘系数1.5，得二氧化碳同化量，单位为CO2，mg/(dm2·h)。
实验16 淀粉的合成——淀粉磷酸化酶
原理
植物的组织中有一种淀粉磷酸化酶，能利用1-磷酸葡萄糖合成淀粉，生成的淀粉可用I2-KI染色检出。
1-磷酸葡萄糖
淀粉
仪器药品
台天平 离心机
水浴锅 研钵
移液管 1%1-磷酸葡萄糖
0.1mol/L柠檬酸-0.2mol/L磷酸缓冲液，pH6.5，（见附表2）。
I2-KI溶液：溶液1.5gKI于少量蒸馏水中，加入结晶碘0.3g，待溶解后，稀释100ml。
操作步骤
1．取马铃薯块茎一个，削去皮，切成小块，称取10g，于研钵中加石英砂少许，用10ml 0.1mol/L柠檬酸-0.2mol/L磷酸缓冲溶液研磨成匀浆。
2．用纱布滤取汁液，于3 500 r/min离心15分钟，以除去淀粉，即为粗制酶液。
3．取小试管2支，分别加入1%1-磷酸葡萄糖1ml，再于1管中加入1ml粗制酶液，另1管中加入已经煮沸15分钟的粗制酶液。摇匀试管，立即各吸取1滴于白瓷板上，分别加1滴I2-KI溶液，测试有无淀粉存在。
4．以后每隔10分钟，取试管中混合液1滴，检查淀粉的生成。比较煮沸能否使酶失活？
实验17 植物呼吸强度的测定(小篮子法)
原理
利用Ba（OH）2溶液吸收呼吸过程中释放的CO2，实验结束后，用草酸溶液滴定残留的Ba（OH）2，从空白和样品两者消耗草酸溶液之差，即可计算出呼吸过程中释放的CO2量。
仪器药品
广口瓶 温度计
酸式滴定管 干燥管
尼龙网制小篮
0.05 mol/L Ba（OH）2
指示剂：0.1%麝香草酚酞酒精溶液（见附录表4）。
1/44 mol/L草酸溶液：准确称取重结晶的草酸H2C2O4·2H2O2.8652g，溶于蒸馏水，配成1 000ml，每ml溶液相当于1mg的CO2。
操作步骤
1．取500ml广口瓶一个，装配一只三孔橡皮塞，一孔插入盛碱石灰的干燥管，以吸收空气中的CO2，保证进入呼吸瓶的空气无CO2，一孔插入温度计，另一孔直径约1cm左右供滴定用，滴定前用小橡皮塞塞紧。瓶塞下面挂一尼龙网制小篮，用以盛实验材料，整个装置如图所示。
2．称取萌发的小麦或水稻种子15g，装于小篮内，将小篮挂在广口瓶内，同时加0.05mol/L Ba（OH）2溶液25ml于广口瓶内，立即塞紧瓶塞，并用熔化的石蜡密封瓶口，防止漏气。每10分钟左右，轻轻地摇动广口瓶，破坏溶液表面的BaCO3薄膜，以利对CO2的吸收。
3．1小时后，小心打开瓶塞，迅速取出小篮，加入2滴指示剂，立即重新塞紧瓶塞。然后拔出小橡皮塞，将滴定管插入小孔中，用1/44 mol/L的草酸滴定，直到蓝绿色转变成无色为止。记录滴定所耗用的草酸溶液的ml数。
4．另取用沸水煮死的种子为材料，作同样测定，以此作为对照。
5．计算
式中 V0为煮死的种子，所耗用草酸的ml 数，
V1为发芽的种子，所耗用草酸的ml 数。
实验18 过氧化物酶活性的测定（比色法）
原 理
过氧化物酶广泛分布于植物的各个组织器官中。在有过氧化氢存在下，过氧化物酶能使愈创木酚氧化，生成茶褐色物质，可用分光度计测量生成物的含量。
仪器 药品
721型分光光度计 离心机
秒表 天平
研钵 磁力搅拌器
愈创木酚 30％过氧化氢
20 mmo1／L KH2LPO4
100mmo1/L磷酸缓冲液，pH6.0（见附表2）
反应混合液：100 mmo1／L磷酸缓冲液（pH 6．0）50 ml于烧杯中，加入愈创木酚28μ1，于磁力搅拌器上加热搅拌，直至愈创木酚溶解，待溶液冷却后，加入 30%经过氧化氢19μ1，混合均匀，保存于冰箱中。
操作步瞩
1．称取植物材料1g，加 20 mmol／L KH2PO45 ml，于研钵中研磨成匀浆，以 4 000r／min 离心15分钟，倾出上清液保存在冷处，残渣再用5 ml KH2PO4溶液提取一次，合并两次上清液贮于冷处备用。
2．取光径 Icm比色杯2只，于 1只中加入反应混合液3m1，KH2PO4 1m1，作为校零对照，另1只中加入反应混合液3ml，上述酶液1ml（如酶活性过高可稀释之），立即开启秒表记录时间，于分光光度计上测量吸光度值，每隔1分钟读数一次，读数于波长 470nm下进行。
3. 以每分钟吸光度变化值表示酶活性大小，即以△A470/min·mg蛋白质（或鲜重g）表示之。蛋白质含量测定参阅实验56。
实验19 多酚氧化酶活性的测定（氧电极法）
原 理
多酚氧化酶是一种含铜的氧化酶，能使一元酚和二元酚氧化生成醌。多酚氧化酶活性可以用氧电极测量反应耗氧的速度，或用比色法测量产物的形成，常用的底物如儿茶酚（邻苯二酚）和多巴（3，4-二羟苯丙氨酸）。
仪器药品
测氧仪 记录仪
超级恒温水浴 离心机
磁力搅拌器 匀浆机
反应杯 微量注射器
不溶性PVP（聚乙烯吡咯烷酮，polyvinylpyrrolidone）
1mmol/L儿茶酚：o.11 g儿茶酚溶于1000ml0。1mol/L磷酸缓冲液中，pH 6.5。
0.1mol／L磷酸缓冲液，pH6. 5（见附表2）．
操作步骤
1.粗酶的制备
（1）称取马铃薯块茎 20 g，加不溶性PVP 2 g（事先用蒸馏水浸洗，然后过滤以除去杂质），磷酸缓冲液100ml，于匀浆机中打碎成匀浆，用尼龙网袋（或纱布袋）过滤，得滤液。
（2）滤液中加入30%饱和度硫酸铵（见附表8），离心除去沉淀，上清液再加硫酸铵使达60%饱和度，离心收集沉淀。
（3）将所得沉淀溶于少量 0.01 mol／L磷酸缓冲液中（pH6.5），即为粗制酶液，于同样缓冲液中透析过夜，其间更换透析溶液3—4次。
2.酶活性测定
（1）按实验88所述，将测氧仪、记录仪、恒温水浴（25oC）的管路和电（线）路连接好，然后进行仪器的标定。以求得记录纸上每小格相当的含氧量。
（2）测定酶活性时，先于反应杯中倒入底物儿茶酚，特记录仪上画出一条直线，用微量注射器经小孔注入合适浓度的酶液10μl，记录氧消耗曲线。
（3）取氧消耗曲线的曲线部分，计算酶活性大小，酶活性以耗O2μl/nmin·酶液表示之。
实验20 植物体内有机物运输途径（环割法）
原 理
韧皮部的筛管是植物体内有机物质运输的通道，环割试验即可以证明这一点。在木本植物的枝条或树干上，用刀环形剥去一层树皮，深达形成层，从而阻断了割环上下方有机物的交换，在割环的上方聚集着从叶片运率的大量有机物，引趄树皮组织生长加强，而形成愈伤组织或瘤状物。
仪 器
解剖刀
操作步骤
1.夏季，在幼龄杨树或其他木本植物上选定尚未发生分枝的旺长枝条，于其中1—2枝进行环状剥皮，使剥环宽度在 3cm左右。环割后，每星期观察一次枝条变化，并与生长情况相似的对照枝条进行比较，特别注意观察以下几个方面；
（1）剥环上部叶片是否萎蔫？
（2）枝条顶端生长速度有何改变？
（3）剥环上下切口愈伤组织生长情况。
（4）剥环上下部休眠芽萌发情况。
2.另选一相似枝条进行双环割，再剥环相距40-50cm，同样观察以上各项。
3.秋季要将以上处理的枝条剪下（连同对照枝条，风于保存作教学材料）。
实验21 吲哚乙酸氧化酶活性的测定
原理
吲哚乙酸在吲哚乙酸氧化酶的作用下，被氧化破坏失去活性。植物体内吲哚乙酸氧化酶活力的大小，对调节体内吲哚乙酸的水平，起着重要的作用，而影响植物的生长。酶活力的大小可以其破坏吲哚乙酸的速度表示之。吲哚乙酸的含量可用比色法测定。
仪器药品
721型分光光度计 离心机
恒温水浴锅 天平
研钵 试管
移液管 烧杯
20mmol/L磷酸缓冲液，pH6.0（见附表2）。
1mmol/L2,4-二氯酚：称取二氯酚16.3mg用蒸馏水配成100ml。
1mmol/L氯化锰：称取MnCl2·4H2O19.8mg用蒸馏水配制成100ml。
1 mmol/L吲哚乙酸：称取IAA17.5mg用少量乙醇溶解，然后将其倒于盛有约90ml蒸馏水的容量瓶中（100ml），稀释至刻度。
吲哚乙酸试剂A或B（任备其中之一）：
试剂A：15ml0.5mol/LfeCl3，300ml浓硫酸（比重为1.84），500ml蒸馏水，使用前混合之即成，避光保存。用时1ml样品中加入试剂4ml。
试剂B：10ml0.5mmol/LfeCl3，500ml35%过氯酸，使用前混合之即成，避光保存。用时于1ml样品中加入试剂2ml。试剂B较试剂A灵敏。
操作步骤
1．将大豆或绿豆种子于30℃温箱中萌发3—4天，选取生长一致的幼苗，除去子叶，留下胚轴作材料。
2．取20株胚轴，称得重量，置研钵中，加入预冷的磷酸缓冲液5ml，石英砂少许，置冰浴中研磨成匀浆。再按100mg鲜重材料加入1ml提取液的比例，用磷酸缓冲液稀释之。离心（4000r/min）20分钟，所得上清液即为粗酶液。
3．取试管2支，于一试管中加入氯化锰1ml，二氯酚1ml，IAA2ml，磷酸缓冲液5ml，混合均匀。另一试管中除酶液用磷酸缓冲液代替外，其余成分相同。一起置于30℃恒温水浴中，保温30分钟。
4．吸取反应混合液2ml，加入吲哚乙酸试剂B4ml，摇匀，置于30℃的墨暗处保温30分钟，使显色。
5．将显色后呈红色的反应液于分光光度计中测定吸光度，测定时用波长530nm。
6．根据读数从标准曲线上查出相应的吲哚乙酸残留量（或从直线方程计算反应液中IAA的残留量）。
7．从开始时加入的吲哚乙酸量减去酶作用后残留的吲哚乙酸量，即得被酶所分解破坏的吲哚乙酸量。以每ml酶液在1小时内分解破坏吲哚乙酸量（
）表示酶活力的大小。
8．配制浓度从0—25/ml的IAA溶液，分别测得吸光度A，然后绘制标准曲线，或计算直线回归方程。
实验22 IAA的生物鉴定（小麦芽鞘切段伸长法）
原 理
将小麦胚芽鞘的延长部分切成段，漂浮在含有生长素IAA的溶液中，这些切段可以继续伸长，在一定浓度范围内，芽鞘切段的伸长与生长素浓度的对数成正比，因而可通过测定切段伸观多少来测定生长素的含量。
仪器药品
25oC暗室 滤纸
旋转器 分析天平
小瓷缸 大瓷缸
培养皿 银试管
移液管 青霉素瓶
刀片 小镊子
尼龙网 刻度尺
半对数座标纸 饱和漂白粉溶液
小麦品种，扬麦1号最好用中农28。
100 ppmIAA母液：称 10 mg IAA溶于少量无水酒精中，再用水稀释至100ml。此溶液在冰箱中可保存一个月。
缓冲液：称取K2HPO4，1.7 94g，柠檬酸1.019g，蔗糖（AR）20g溶于1000ml重蒸馏水中，pH为5.0。
操作步骤
1.挑选大小均匀的小麦种子（必须用前一二年的种子，因当年新收的种子发芽不整齐），用饱和漂白粉溶液灭菌30分钟后，用自来水冲冼半天，放在盛肿湿润滤纸的培养皿中，腹沟朝下，在25oC黑暗条件下萌发24小时。
2.当第一胚根出现后，移于用尼龙网覆盖的小瓷缸中，胚根插入尼龙网眼，如图20所示。
小瓷缸放入盛水的大瓷缸中，以保持湿度或在小瓷缸上罩上烧杯保湿。
3.继续在 25oC黑暗下培养，约40小时后，当胚芽鞘长达3cm左右时，选取 2.8-3.0cm幼苗作为生物鉴定材料，因这样大小的芽鞘对IAA最敏感。
4.切去芽鞘尖端3mm，取下面5mm切段作试验，如图 21所示。
5.将5mm切段漂浮在重蒸馏水中浸洗2—3小时，除去初段中内源激素。
6.配制0.001、0.01、0.1、1.0、10 PPm的IAA的系列标准溶液（配在具塞试管中）。
吸取 100ppmIAA1ml＋9ml缓冲液 10ppm IAA
吸取 10PPmIAA1ml＋9ml缓冲液 1PPm IAA
吸取 1PPmIAA1ml＋9ml缓冲液 0.1PPm IAA
吸取 0.1PPmIAAml＋9ml缓冲液 0.01 PPm IAA
吸取 0.01 PPm IAA1ml＋9ml缓冲液 0.O01 PPm IAA
7．在具塞青霉素瓶中分别吸入上述IAA系列标准溶液（0．001、0．01、1.0、10PPm IAA）2ml，另外吸取2ml缓冲浪作为对照。
8．切段浸泡后，用滤纸将切段表面水分吸干，在上述盛有不同浓度生长素的青霉素瓶中，分别放入芽鞘切段10段（最好放11—12段，以便挑选）加塞，每一浓度重复3次。将青霉素瓶置于旋转器上（旋转速度为16r/min）在 25℃暗室中旋转培养。
9．上述操作均需在暗室中绿光下进行。
10．旋转培养20小时后取出芽鞘切段，在滤纸上吸干，测量芽鞘切段的长度。
11．在半对数坐标纸上，以芽鞘切段增长%*为纵坐标，IAA浓度为横坐标，作出标准曲线。在生长素浓度为 0.001—1.0PPm范围内，切段的伸长与生长素浓度的对数成正比，如需鉴定某一植物提取液中生长素含量，必须与标准的 IAA作对照。
实验23 细胞分裂素对萝卜子叶的保绿作用
原 理
在植物中广泛存在着细胞分裂素，细胞分裂素能够促进细胞分裂，阻止核酸酶和蛋白酶等一些水解酶的产生，因而使得核酸、蛋白质和叶绿素少受破坏，同时具有减少营养物质向外运输的作用。
将植物的离体叶片放在适宜浓度的细胞分裂索溶液中，置于25—30℃黑暗条件下，叶片中叶绿素的分解速度比对照慢，证明细胞分裂素具有保绿作用。生产上可用细胞分裂素延长蔬菜的贮藏时间。
仪器药品
721型分光光度计 合天平
培养皿 量筒
容量瓶 小漏斗
剪刀 研钵
0.lmol/L HCl
6-苄基氨基嘌呤（或玉米素）溶液：称取10mg6-苄基氨基腺嘌呤，先用0.1mol/L HCl溶解，再用蒸馏水稀释成100ml，则浓度为100 ppm再稀释成 5、10、20 ppm，配成的溶pH约为5左右。
操作步骤
取4套培养皿分别加入蒸馏水和 5、10、20 ppm的6-苄基氨基脓瞟吟溶液各20ml，每种浓度处理重复2次。各培养皿中放入苗岭和长势相同的萝卜子叶1g，加盖后放在 25—30℃黑暗的地方培养。
1—2天后取出材料，用吸水纸吸干子叶上的溶液，然后按实验33的方法，测定各处理组子叶中所含的总叶绿素含量(mg叶绿素/g鲜组织)。
实验24 乙烯对棉花子叶脱落的效应
原理
乙烯能增强果胶酶和纤维素酶的活性，加速果胶质和纤维素水解，使得细胞间的结合力减弱，导致离层产生，引起器官的脱落。
乙烯利（2-氯乙基膦酸）在植物细胞液的pH条件下（一般>pH4），缓缓分解放出乙烯，具有与乙烯相同的生理效应。
仪器药品
剪刀 镊子
培养皿 小烧杯
脱脂棉 乙烯利
操作步骤
1．取棉花幼苗植株一棵，剪去叶身留下叶柄，并将叶柄算短，如图24所示（也可以用叶子对生的植物作为材料大于左右两边的叶柄切口上，包上少许脱脂棉，在右边切口棉花上滴1滴乙烯利溶液，左边切口上滴1滴蒸馏水，乙烯利的浓度为10、5、1、0.5、0.05ppm。每一处理作2个重复，将所有处理的材料插在培养皿的湿沙中，24小时后，用镊子轻碰叶柄，看是否脱落。以后每天早晚用镊子检查脱落，记下每个叶柄脱落所需的时间，比较所得结果。
2．取叶子对生的植物枝条，留下三个节位，其余剪去，并将三个节位上的叶子，剪去叶身，留下叶柄。在中间一对叶柄切口包上少许脱脂棉，于右边切口滴上乙烯利，左边切口滴上蒸馏水，乙烯利浓度为 10、5ppm，将材料插在小烧杯蒸馏水中，以后每日用镊子检查三对叶辆的脱落情况，比较所得结果。
3．用不同浓度（10、5、1、0.5、0.05ppm）脱落欧作上述同样的试验，以观察对棉花于叶的脱落效应。脱落敌用少量碳酸氢钠溶解，再用蒸馏水稀释之。
实验25 种子发芽率的快速测定
种子发芽率是指在最适宜条件下，在规定天数内，发芽的种子占供试种子的百分数。它是决定种子品质和实用价值大小的主要依据，与播种的用种量直接有关。但是常规方法（直接发芽）测定发芽率所需时间较长，特别是有时为了应急需要，没有足够的时间来测定发芽率，遇到休眠种子也无法知道。快速测定法则能在较短时间内获得结果。
I 氯化三苯四氮唑法（TTC法）
原 理
凡有生命活力的种子胚部，在呼吸作用过程中都有氧化还原反应，而无生命活力的种胚则无此反应。当TTC渗入种胚的活细胞内，并作为氢受体被脱氢辅酶（NADH2或NADPH2）上的氢还原时，便由无色的TTC变为红色的三苯基甲 （TTE）。
仪器药品
恒温箱 烧坏
培养皿 镊子
刀片 天平
0.5%TTC溶液：称取0.5gTTC放在烧杯中，加入少许95%乙醇使其溶解，然后用蒸馏水稀释至100ml。溶液避光保存，若变红色，即不能再用。
操作步骤
1．浸种
将待测种子在30—35℃温水中浸种（大麦、小麦、籼谷6—8小时，玉米5小时左右，粳谷2小时），以增强种胚的呼吸强度，使显色迅速。
2．显色
取吸胀的种子200粒，用刀片沿种子胚的中心线纵切为二半，将其中的一半置于2只培养皿中，每皿100个半粒，加入适量的0.5%TTC，以覆盖种子为度。然后置于30℃恒温箱中0.5—1小时。观察结果，凡胚被染为红色的是活种子。
将另一半在沸水中煮5分钟杀死胚，作同样染色处理，作为对照观察。
3．计算活种子的百分离，如果可能的话与实际发芽率作一比较，看是否相符？
实验26 谷物种子萌发时淀粉酶活性的测定
原理
种了中的贮藏物质淀粉，在萌发过程中，主要是在淀粉酶水解作用下转变成简单的有机化合物，这些物质是构成新器官的材料。在一定条件下定量淀粉糖化过程时间的长短即可表示酶活力的大小。
仪器药品
天平 恒温水浴锅
研钵 白磁板
漏斗 漏斗架
培养皿 滤纸
1%淀粉溶液 0.2mol/L磷酸缓冲液，Ph6
I-KI溶液：
1．原碘液：I211g，KI22g，定容至500ml。
2．标准稀碘液：取原碘液15ml，加KI8g定容至500ml。
3．比色稀碘液：原碘液2ml加KI20g，定容至500ml。
标准糊精：称取0.12g 糊精，悬浮于少量水中，再移至沸水中，冷却定容至200ml，取其中1ml加3ml标准稀碘液作为比较颜色。
操作步骤
1．实验材料的准备
于实验前6天，采用水培法培养出几种不同环境条件下生长的作物幼苗（水稻、小麦）。
2．淀粉酶溶液的制备
将不同幼苗用水洗净，各种取幼苗胚乳部分0.5g，分别置于研钵中，加5ml pH6的磷酸缓冲液，仔细研磨，滤纸过滤（或离心），用适量缓冲液冲洗，最后定容至10ml。
3．保温糖化
取20ml 1%淀粉液和5ml pH6的磷酸缓冲液于三角烧瓶中，置于35℃水浴中平衡15分钟，加1ml制备好的酶溶液，搅匀，立即记时间。
4．显色、观察及测定
吸上述混合液1滴于白瓷反应板上，加1滴稀碘液，观察颜色，与标准糊精比较颜色，相同即是反应达到终点，记录糖化时间t。
计算：
f为稀释倍数（20）。
Ua为酶活力单位（表示每g材料每小时消化1g淀粉的酶活力为1个单位）。
实验27 植物组织培养
植物组织培养是把植物的器官，组织以到单个细胞，应用无菌操作使其在人工条件下，能够继续生长，甚至分化发育成一完整的植株的过程。植物的组织在培养条件下，原来已经分化停止生长的细胞，又能重新分裂，形成没有组织结构的细胞图，即愈伤组织。这一过程称为“脱分化作用”，已经“脱分化”的愈伤组织，在一定条件下，又能重新分化形成辅导系统以及根和芽等组织和器官，这一过程称为“再分化作用”。植物激素在此过程中起着重要作用，吲哚乙酸和6-苄基氨基腺嘌呤的比例，决定了根和芽的分化。
近年来，组织培养作为一种研究技术，已广泛地应用于许多学科中，它不仅对理论研究有重要意义，并已展现了十分广阔的应用前景。
Ⅰ．愈伤组织培养和分化
原 理
植物组织经过脱分化作用，形成愈伤组织，经过再分化作用，愈伤组织又能重新分化为有结构的组织和器官，最终形成完整的植株。早在1957年Skoog即发现培养基中植物激素的类型和它们的比例，对再分化过程起着重要的作用。
仪器药品
培养室 接种箱或超净工作台
高压灭菌锅 分析天平
水浴锅 长镊子
解剖刀 剪刀
三角饶瓶（100ml） 容量瓶
烧杯 移液管
量简 牛皮纸
培养皿 称量纸
棉线 HgCl2（或次氨酸钠）
乙醇 6-苄基氨基腺嘌呤
IAA或2，4-D MS培养基（见附表16和17）
操作步骤
1．配制培养基
（1）愈伤组织诱导培养基：MS培养基（蔗糖含量为 10g/L，2，4-D含量为2mg/L，琼脂10g/L）。
（2）试验培养基：按下表配制。
吲哚乙酸用少量0.1mol/L NaOH溶解，6苄基氨基腺瞟吟用少量 0.lmol/L HCI溶解。
2．培养基灭菌
将配好的培养基加入琼脂加热溶解，调至 PH5.8，趁热分装于100 ml三角饶瓶中，每瓶约20ml。待培养基冷却凝固后，用一层称量纸和一层牛皮纸包扎瓶（管）口，并用棉线扎牢，然后在高压灭菌锅中（121℃（1kg/cm2）下灭菌20分钟。取出三角烧瓶放在台子上，冷却后备用。接种操作所需的一切用具（如长镊子、解剖刀、剪刀等）及灭菌水，需同时灭菌。
3．诱导产生愈伤组织
（1）取健壮的烟草茎数段，每段约5cm长，于烧杯中用0.1另氯化汞（升汞）浸泡20分钟，取出用无菌水洗3—4次。置于无菌培养皿中，在接种箱中按无菌操作要求剥去外皮（接种箱事先用紫外灯灭菌30分钟），用解剖刀切成5mm厚的圆片（弃去开始一片和最后一片），用长镊子将它接种在诱导培养基上，注意图片的切口朝向培养基，每瓶接种4片，接种后扎好瓶口。
（2）将已接入植物组织（外植体）的三角烧瓶，培养在 25℃温室中，每星期检查1—2次，剔除材料已被杂菌污染的三角烧瓶，3—4周后产生愈伤组织。
（3）选取愈伤组织生长良好的三角烧瓶，用解剖刀将愈伤组织切下，转移到含有不同激素的试验培养基中（也可以连同原来的外植体一起转移），每瓶放1—2块，仍培养在25℃温室中，每周1—2次观察不同处理的三角烧瓶中，愈伤组织分化情况，直至长出根和芽。长成的幼小植株即为“试管苗”，可移栽于花盆中。
Ⅱ 原生质体的分离和培养
原 理
植物细胞在纤维素酶，半纤维素酶和果胶酶的作用下，细胞壁被消化，可以得到裸露的原生质体。原生质体在合适的培养条件下，能再生细胞壁，进行分裂、生长、形成愈伤组织，进一步分化形成根和芽，长成新的植物体，表现了植物细胞的全能性。利用植物原生质体可以进行细胞、生理、生化和遗传等多方面的研究，已成为植物生理学、细胞生物学及遗传学等学科的重要研究方面。要进行原生质体的培养，首先要分离得到具有活力的原生质体，因此，掌握分离植物原生质体的方法，就显得十分重要。
仪器药品
培养室 超净工作合或接种稻
真空系或水泵 高压灭菌锅
离心机 手摇离心机
细菌过滤器 过滤瓶
血球计数器 移液管
培养皿 三角烧瓶
不锈钢网k00—400目） 长镊子
剪刀 漂白精片
70%乙醇
NT琼脂培养基（见附表16和17），另加入1.2%琼脂。
酶液：0.7g纤维素酶（EA3－867）5.5g甘露醇，0.05gCaCl2,配成100ml,PH 5.7，溶解后 4000r/min离心15分钟，取上清液，通过灭菌漏斗过滤消毒（用0.45
m微孔滤膜减压过滤），滤液在超净工作台上分装在灭菌的三角烧瓶中，每瓶约10m1，贮于冰箱中备用。
洗涤液：5.5g甘露醇，0.05g CaCl2用NT培养液配成100ml。
操 作 步 骤
1．材料准备
苗龄在60天以上的烟草植株，取上中部叶子，在灯光或日光下照射2小时左右，使萎蔫。萎蔫后的叶片用清水洗净，浸入吐温溶液中数分钟，移至70%酒精浸数秒钟，再在漂白精溶液中浸15—20分钟，用无菌水冲洗2—3次，再用无菌滤纸吸去表面的水分。以上均按无菌操作要求进行。
2．游离原生质体
用镊子撕去下表皮，切成小块，取1g材料放人盛有10ml酶液的三角烧瓶中，于28℃左右保温1.5—3小时。
3．净化
经过保温的材料，通过带有200—400目不锈钢网的细菌漏斗，滤去未被消化的组织碎片，得到的原生质体悬液移至1Oml离心管中，用翻口塞密封离心管口，手摇离心机离心2分钟，吸去上溶液，加入洗涤液，重新悬浮原生质体，这样重复洗涤2—3次，最后用NT培养液洗1次。
4．培养
（1）将悬浮在NT培养液中的原生质体，用血球计数器计算原生质体的密度，使每ml达到101一105个原生质体。
（2）吸取原生质体悬液1—1.5ml于灭菌的6cm培养皿中，加入熔化的 NT琼脂培养基 1—1.5ml，立即轻经展动培养皿，使原生质体均匀分布在固体培养基中。
（3）待培养基冷却凝固后，将培养皿倒置于9cm培养皿中，皿四周垫有湿润滤纸条，培养皿外用胶布或石蜡纸密封之。
（4）再将培养皿放在有盖搪瓷盘中，于26－28℃保温培养，当原生质体开始变形长大时，可将它连同周围琼脂切成块，移贴到新鲜的 NT培养基上，再进行倒置培养。
（5）当产生愈伤组织后，即可用一般的组织培养方法，如实验I中选用合适的试验培养基，诱导根、芽的分化和再生成植株。
实验28 不良环境对植物的伤害
原 理
植物在遭遇不良环境（如高温、低温等）时，原生质的结构常受到影响，原生质膜的半透性丧失，对物质的透性发生改变，盐类或有机物从细胞中渗出，进入周围环境中。通过电导度的测量和糖的显色反应，可以测知物质的外渗，表明植物受害的情况。
仪器药品
电导仪 电冰箱
温箱 水浴锅
烧杯 量筒
移液管 试管
镊子
蒽酮试剂（参阅实验 52）
操作步骤
1．取玉米或小麦种子，用水吸胀，萌动后移到杯上蒙着的塑料窗纱上，杯中充以水，让根穿过网孔垂直伸入水中（也可以将种于种植于湿沙中）。当苗长 2—3cm时，即可用作材料。
2．取出幼苗，尽量不要伤害根系，用镊子除去幼苗上残留的胚乳，用蒸馏水漂洗数次，以除去伤口上的物质。然后以10株为一组，共3组，分别放在盛有20 ml馏水的小烧杯中，务必将根系浸入蒸馏水中，将一杯放在45℃温箱中，一杯放在0—2℃冰箱中，另一杯留在室温条件下。
3．经过一定时间后，用电导仪测量每一处理小杯中溶液的电导度。另外吸取溶液0.5ml于试管中，加入蒽酮试剂2ml，于沸水浴中加热15分钟，如果溶液变绿，即表明糖类的存在。另以蒸留水作同样测定进行比较。
4．将结果记录于下表中。
实验29 植物缺水程度的鉴定（脯氨酸法）
原理
当植物缺水时体内的脯氨酸含量增加。植株体内脯氨酸含量在一定程度上反映了植株内的水分情况，因而可以作为植物缺水情况的参考性生理指标。
用人造沸石（permutit）在pH1—7范围内振荡溶液，可除去干扰的氨基酸或使不与茚三酮反应（如甘氨酸、谷氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、丙氨酸、缬氨酸、胱氨酸、苯丙氨酸、精氨酸等），脯氨酸与茚三酮试剂呈显色反应，其含量与色度成正相关，可用分光光度计测定。此法有专一性。
仪器药品
721型分光光度计 离心机
水浴锅 烧杯
移液管 研钵
容量瓶 具塞试管
冰醋酸 80%乙醇
脯氨酸 人造沸石
茚三酮试剂：将2.50g茚三酮于60ml冰醋酸和40ml6mol/L磷酸中，加热（70℃）溶解。试剂至少在24小时内稳定。
操作步骤
1．绘制标准曲线
取脯氨溶于80%乙醇中，然后稀释成下列浓度0、1.0、2.5、5.0、7.5、10、15、20、25、30 Pg／ml。分别取标准溶液 2ml，冰醋酸2ml，茚三酮试剂2ml加入试管中，用橡皮塞塞紧，于沸水浴中加热15分钟。用分光光度计于波长515nm下进行比色测定，以浓度0为空白对照。将测定结果以辅氨酸浓度为横坐标，以吸光度为纵坐标作标准曲线。
2．植株样品液的提取
选取植株功能叶片2g，用3ml80%乙醇研磨（放少许石英砂）成浆状。用80%乙醇洗研钵，将提取物和洗液置于试管中。80%乙醇总量为 10ml。加盖置于黑暗中室温下提取24小时。
将提取液在放有活性炭的滤纸大进行过滤，重复过滤一次，除去色素和残渣。将提取液置于试管中，加其重量1/5的人造沸石强烈振荡5分钟。将上层波在离心机上离心 10分钟，取上清液备用。
3．样品溶液之测定
将离心后所得之上层液，取2ml置于试管中，再加入2ml冰醋酸和2ml茚三钢试剂，加盖密封，在沸水浴上加热15分钟 用3ml80%乙醇代替样品液作为对照。在分光光度计上用515nm进行比色测定。读出吸光度后，从标准曲线上求出样品溶液中脯氨酸含量。