检测HBV-DNA临床意义：

一、HBV-DNA与两对半的关系

1、HBsAg（+）、HBeAg（+）提示HBV复制活跃和传染性强。

2、HBsAg（–）、HBeAg（–）、HBsAb、HBeAb出现是机体清除HBV标志，并且提示机体对HBV的免疫力。

3、HBsAg（–）、HBsAb（+）、HBeAb（+）、HBcAb（+）呈不同组合的血清学状态，结果均考虑肝病行肝活检证实为慢性肝炎改变、免疫组化检出HBV抗原。其HBV-DNA阳性率29.0% ，肝内检出率65% 。

4、HBsAg（–）、HBeAg（–）、HBV-DNA（+）是由于HBV S区点突变可能导致HBsAg抗原性改变，使HBsAg不能被检出，而HBV前C区基因变异，使HBsAg不能表达但病毒本身复制不受影响。

5、HBsAg（+）、HBV-DNA（–）可能是HBV-DNA整合于宿主细胞基因组， 或基因变异，所用PCR引物不匹配，未能检出但仍可表达HBsAg

6、HBsAb（+）、HBeAb（+）/（–）、HBcAb（+）表明已进入恢复期或痊愈期，但仍有HBV-DNA（+）可能是病毒突变所致。

二、HBV-DNA拷贝数与临床治疗的关系

1、HBV-DNA拷贝数由高到低表示药物对患者治疗有效和治疗方案的正确。

2、治疗后HBV-DNA拷贝数下降到103-102时停止抗病毒治疗，但应做到2-4 个月复查HBV-DNA和肝功能，以监测HBV复制情况和肝脏是否受损。

3、 抗肝炎病毒药物只能使HBeAg阴转，不能阴转HBsAg，长期抗病毒治疗有可能使HBV-DNA阴性，但HBsAg阳性，是因为HBsAg和HBeAg虽然是与病原体有关的抗原成分，但存在于血液中的HBsAg绝大部分为不含病毒的小圆形颗粒，只有极少部分（0.2%）为丹氏（Dane）颗粒。而乙肝病毒前C区的变异则常常导致HBeAg表达的缺失。至于血清中抗体含量的高低与病原体的含量更没有直接关系，机体免疫应答的滞后性使得即使有高滴度的抗体存在，也可能病原体含量很低或根本就已消失。因此对于乙肝疾病，判断疗效的唯一标志只能是病原体本身的定量检测，如HBV-DNA

第二篇：SCGE法检测DNA损伤(包括DNA单链断裂和DNA交联)revised_1_

SCGE法检测DNA损伤

SCGE的原理（中性电泳液，高盐和变性剂检测双链断裂；碱性检测单链，双链断裂和碱不稳定性） SCGE技术是一种在单细胞水平上检测有核细胞DNA损伤和修复的方法。该技术的原理是基于有核细胞的DNA分子量很大，DNA超螺旋结构附着在核基质中，用琼脂糖凝胶将细胞包埋在载玻片上，在细胞裂解液作用下，细胞膜、核膜及其它生物膜破坏，使细胞内的RNA、蛋白质及其它成分进入凝胶，继而扩散到裂解液中，唯独核DNA仍保持缠绕的环区(Loop)附着在剩余的核骨架上，并留在原位。如果细胞未受损伤，电泳中核DNA因其分子量大停留在核基质中，经荧光染色后呈现圆形的荧光团，无拖尾现象。

若细胞受损，在中性电泳液(pH8)中，核DNA仍保持双螺旋结构，偶有单链断裂(SSBs)并不影响DNA双螺旋大分子的连续性。只有当DNA双链断裂(DSBs)时，其断片进入凝胶中，电泳时断片向阳极迁移，形成荧光拖尾现象，形似彗星。如果在碱性电泳液(pH>13)中，先是DNA双链解螺旋且碱变性为单链，单链断裂的碎片分子量小即可进入凝胶中，在电泳时断链或碎片离开核DNA向阳极迁移，形成拖尾。细胞核DNA受损愈重，产生的断链或碱易变性断片就愈多，其断链或断片也就愈小，在电场作用下迁移的DNA量多，迁移的距离长，表现为尾长增加和尾部荧光强度增强。因此，通过测定DNA迁移部分的光密度或迁移长度就可定量测定单个细胞DNA损伤程度。

1. 仪器及试剂

冰箱，载玻片，水平电泳槽，荧光显微镜。

不含Ca2+、Mg2+的PBS (PH=7.4)；正常溶点琼脂糖（NMA）及低溶点琼脂糖（LMA）（0.6％溶于PBS）；细胞裂解液（2.5 M NaCl, 100 mM Na2EDTA, 10 mM Tris-HCl, 1%肌氨酸钠, PH=10, 用前加1％ TritonX-100, 10% 二甲亚砜（DMSO））；电泳缓冲液（0.3 M NaOH, 1 mM Na2EDTA, PH=13）；0.4 M Tris-HCl（PH=7.5）； 无水乙醇；20-30μg/mL 溴化乙锭（EB）。

2. 样品

在体外实验中,将对数期生长的细胞用0.25%胰蛋白酶消化,收集细胞备用（悬浮细胞直接离心收集）。在体内实验中,取需测试的脏器或组织,用磷酸缓冲液( PBS,PH 7.4) 洗净后,剪至糜状滴加PBS(PH 7.4) 研磨,过300 目筛子,收集细胞,悬浮于PBS(PH 7.4) 中, 细胞密度为（1-5） x 104-6个/ mL （40倍物镜下单个视野内4-8个细胞）。

3. 制胶(当40倍物镜下单个视野内细胞数为4-8个时，细胞液与LMA的比例为1：7.5；可根据细胞密度，适当调整细胞液和LMA的量)

将载玻片用砂纸(粒度No. 380)磨出痕迹, 以便凝胶附着. 将37C正常溶点0.6％琼脂糖液（溶于不含Ca2+、Mg2+的PBS，需要沸水加热3h以上）60-100μl铺展（用玻璃棒轻轻向一端平推）到预热的磨痕载玻片上，作为第一层凝胶。加入制备的细胞悬液45-80μl(10μl细胞悬液和75μl 0.6%的低熔点琼脂糖(LMA) 在37℃混匀)铺展到载玻片上作为第二层, 盖上盖玻片，放在冰袋上 凝固后轻轻揭掉盖玻片，再铺展低溶点0.6％琼脂糖45-80μl作为第三层, 使载玻片上琼脂糖呈“三夹层”式.

（注意：NMA 适宜浓度0. 5 %～1 % ,过高或过低将造成凝固速度过快而不易铺平或粘着力低而脱落,铺胶前载玻片预热,有利于铺植平整。LMA 凝胶浓度直接关系到DNA 迁移长度 ,0. 6 % 较适宜。第3 层LMA 可不铺。微量加样器吸头前端残留凝胶勿吹出,以防形成气泡。移去盖玻片时注意勿损伤胶膜）

4. 裂解（裂解液最好当天配制，一定要在4℃预冷；从这一步开始，动作要尽量轻缓，以防脱胶；一定要避光，所以当玻片浸入裂解液后放入4℃冰箱内裂解2h）

4℃凝固后去掉盖玻片，将载玻片浸人新配制的4℃预冷细胞裂解液（含2.5M NaCl, 100mM Na2EDTA, 10mM

Tris-HCl(PH=10)，用前加1％ TritonX-100, 10% 二甲亚砜（DMSO）），裂解2h。此步骤的目的即是溶解细胞膜及核膜,除去蛋白质、RNA 等,仅存留核骨架。

5. 电泳（电泳液可回收重复利用）

裂解后将玻片并列置于水平电泳槽中，电泳缓冲液(0.3M NaOH、1mM EDTA)盖过胶面，静置20min解链。之后接通电源，电泳条件25V，300mA，时间20-40分钟。通过调节液面来调电压。(电压先调到最大，电流300mA，然后通过液面来调节电压)。

（注意：电泳时电压、电流及时间的长短会直接影响DNA 迁移长度,造成假阳性或假阴性。文献报道为18～50 V ,200～300 mA ,20～40 min。我们采用25 V ,300 mA ,20min ,效果良好。电泳进行中应持续监测,吸出或加入电泳液,调节液面高度,保持电压与电流的恒定）

6． 染色

电泳结束后，将玻片浸入0.4 M Tris-HCl (PH＝7.5)中30min， 每片滴加50μl 20-30μg／ml的EB染色15～20min，盖上盖玻片在荧光显微镜下观察。24小时内检测，时间过长将导致荧光褪色。

（注意：可在染色后4 ℃避光潮湿条件下保存,数日后观察。但我们通过实践得出为防止荧光衰减,尽快阅片较好。阅片过程中,由于淬灭效应,荧光减弱很快,因此操作必须紧凑。结果可直接在荧光显微镜下分析,或先摄影,再进行照片分析。但摄影、相片冲洗条件等较难控制统一,因此应尽量直接分析）

以上除中和及染色外，各步均应在暗处进行，以避免额外的DNA损伤。应尽快阅片，时间过长将导致荧光褪色。

7．观察

使用100W汞灯作为荧光光源，在荧光显微镜（激发波长为549nm,发射波长为590nm）下，损伤的细胞DNA呈现由圆形、致密红色核心（慧头）和朝向阳极的尾端DNA碎片（慧尾）构成的“慧星”。常选用DNA断裂分级和DNA慧星尾长两种观察指标。

DNA彗星头部直径和慧星尾长是在高倍镜下直接测量出“慧头”中心到“慧尾”的长度(单位“格数”)。DNA慧星尾长：每片随机测量25个“慧星”尾长,计算均数。

DNA断裂分级：按彗星尾部与头部直径的比例来判断，共分为5个等级（分别给0-4分值）

零级损伤：无断裂级损伤（即正常的，没有彗尾），计0分

一级损伤：有轻微的彗尾，彗尾短于彗星头部直径的1/4，计1分

二级损伤：彗尾大于彗星头部直径的1/4，小于彗星头部直径，计2分

三级损伤：彗尾长度大于彗星头部直径，计3分

四级损伤：彗星只有很小的头部，计4分

每片随机计数50个“慧星”，统计各级彗星的个数，将各级彗星的细胞数与各级对应分值的乘积累加起来，用累加值与200（50个细胞乘以最大分值4分）的比值来衡量DNA损伤程度（尾部DNA损伤占总DNA损伤的比例）。例如，50个细胞都是4级损伤，则DNA损伤程度=50×4/200×100%=100%；若10个细胞是2级损伤，6个3级损伤，7个4级损伤，则DNA损伤程度=（10×2+6×3+7×4）/200×100%=33%