实验二十五 凯氏定氮法测定生物样品中有机氮的含量
一﹑实验目的
1.学习凯氏定氮法的基本原理和操作；
2.用凯氏定氮法测定生物样品中氮的含量。
二﹑实验原理
凯氏定氮法是使样品经硫酸和催化剂一同加热消化，使有机氮分解，其中有机氮素转化为氮，与硫酸化合为硫酸铵。然后加碱蒸馏，使铵游离出来，用硼酸吸收，再用标准硫酸或盐酸滴定，根据标准酸的消耗量，即可计算有机氮的含量。
三﹑主要仪器及试剂
1.凯氏定氮瓶及蒸馏装置 2.硫酸铜
3.硫酸钾 4.硫酸
5.2%硼酸溶液 6.40%氢氧化钠溶液
7.0.2%甲基红 8.0.2%溴甲酚绿
9.0.2%甲基红及0.2%溴甲酚绿的1+5混合指示剂
10.0.1mol/L的标准盐酸溶液(或1/2硫酸溶液)：
0.1mol/LHCl的配制及标定：吸取9mL浓HCl注入大约1000mL无二氧化碳蒸馏水中，此溶液浓度约为0.1mol/L，用下述方法进行标定：准确称取于180℃烘2小时，并于干燥器内冷至室温的无水碳酸钠1～1.5g，置于250mL容量瓶中，定容后摇匀，用移液管吸取25mL放入锥形瓶内，加入无二氧化碳蒸馏水至100mL及4滴甲基橙指示剂，用待标的0.1mol/LHCl滴定至淡桔红色，记录用量。同时用无二氧化碳蒸馏水做空白滴定。计算盐酸标准溶液的浓度。
式中： m — 无水Na2CO3的重量，g；
V1— 滴定无水Na2CO3消耗HCl溶液体积，mL；
V0— 滴定无二氧化碳蒸馏水消耗HCl溶液体积，mL；
53.00— M(1/2 Na2CO3),g/mol。
四﹑实验操作步骤
精确称取固体试样1g（含氮总量约30-40mg）于500mL凯氏定氮瓶中，加研细的硫酸铜0.5g，硫酸钾10g，浓硫酸20mL，轻轻摇匀。于瓶口装好小漏斗，将凯氏瓶以45°角斜支于石棉网上，小火加热，使其全部碳化（泡沫消失）后，加强火，使溶液微沸，至液体变为蓝绿色透明再加热30min。冷后加200mL水再放冷。连接蒸馏装置，冷凝管下端插入接收瓶液面下。接收瓶内盛有2%硼酸溶液50mL及混合指示剂2-3滴。从漏斗放入40%氢氧化钠溶液70-80mL，摇动，瓶内物料变为深蓝色或产生黑色，自漏斗再加水100mL。加热蒸馏至氨全部蒸馏出来（250mL），使冷凝管下端离开吸收液，再蒸馏1min，停止加热。用水冲洗冷凝管下端的外部下端。吸收液用标准盐酸滴定至灰色为终点。同时做空白实验。
注意事项
1.消化时若不易呈透明溶液，可将试液放冷后慢慢加入30％过氧化氢2—3mL，以促进氧化。
2.消化过程以微火集中于凯氏瓶底部，保持缓慢沸腾，避免试样溅于瓶壁，难于消化使氨损失。
3.实验中要保证硫酸足量，否则过多的硫酸钾形成硫酸氢钾，而削弱了硫酸的消化作用。硫酸钾的作用是增加溶液的沸点，硫酸铜为催化剂，而且可做蒸氨时加入碱量的指示剂。
五﹑实验结果计算
式中：V1—样品消耗标准酸的体积， mL；
V2—试剂空白消耗标准酸的体积，mL；
C—标准盐酸的物质的量浓度，mol/L；
0.014—每毫升1mol/LHCl相当于氮的克数
W—样品重量（或体积），g（或mL）。
数据列表表示如下：
1.盐酸浓度的标定：
2.样品测定:
六﹑思考题
1.蒸氨时为什么蒸馏瓶内要加浓碱？吸收液为什么要用硼酸溶液？为什么要将冷凝管下端插入接收瓶液面下？能否用其它的酸代替硼酸？
2.试样消化过程中 加入浓硫酸、硫酸铜、硫酸钾的作用是什么？
3．为什么消化完全时试液呈兰绿色，而加入40％NaOH溶液变为深蓝色或棕黑色？
第二篇：01 生物化学实验--凯氏(Kjeldahl)微量定氮法测定血清蛋白质含量
凯氏（ Kjeldahl ）微量定氮法测定血清蛋白质含量
【目的】
1 ．掌握微量凯氏定氮法的操作技术，包括未知样品的消化蒸馏、滴定及其含氮量的计算等。
2 ．熟悉微量凯氏定氮法的原理。
【原理】
凯氏定氮法是蛋白质含量测定的经典方法，它是根据蛋白质分子中含氮量来测定的，各种蛋白质含氮量比较近似，平均约为 16 ％，即 1g 氮相当于 6.25g 蛋白质。由测定出 的氮量即可换算出蛋白质含量。
血清蛋白质或其它有机含氮物与浓硫酸加热进行消化 ( 氧化 ) 时，其中碳、氢、氧元素分别被氧化为二氧化碳和水，而氮原子则转变成氨，后者与硫酸结合生成硫酸铵，留在溶液中，为了加速有机物质的氧化分解，在消化时加入硫酸铜做为催化剂，加入硫酸钾以提高消化液的沸点。硫酸铵与氢氧化钠作用，放出氨，通过水蒸气蒸馏将氨带入接收瓶中被硼酸溶液吸收，使溶液中氢离子浓度降低，指示剂颜色发生改变，用已知浓度的标准盐酸滴定，直至原来溶液中氢离子的浓度恢复，即指示剂变为原来的颜色。根据所消耗的标准盐酸量，即可计算出样品中的总氮量。化学反应式如下：
1 ．消化
含氮化合物 +H 2 SO 4 —→CO 2 ↑+H 2 O +(NH 4 ) 2 SO 4 +SO 2 ↑
2 ．蒸馏
(NH 4 ) 2 SO 4 + 2NaOH—→2NH 4 OH+Na 2 SO 4
NH 4 OH—→NH 3 ↑+ H 2 O
3NH 3 +H 3 BO 3 —→(NH 4 ) 3 BO 3
3 ．滴定
(NH 4 ) 3 BO 3 +3HCl—→3NH 4 Cl+H 3 BO 3
以上测定为样品中的总氮量，由总氮量减去非蛋白氮，即为蛋白质含氮量，再乘以 6 . 25 即为血清蛋白质含量。
【器材】
1 ．电炉
2 ．铁三角架
3 ．酒精灯
4 ．锥形瓶
5 ．消化管（凯氏烧瓶）
6 ．滴定管
7 ．微量凯氏定氮器
8 ．刻度吸量管
9 ．玻璃珠
10 ．漏斗
11 ．血清
【试剂】
1 ．硫酸钾粉末
2 ． 12 . 5 ％硫酸铜水溶液
3 ．浓硫酸
4 ． 2 ％硼酸水溶液
5 ．混合指示剂
取 0 . 1 ％溴甲酚绿乙醇溶液 10ml 与 0 . 1 ％甲基红乙醇溶液 4ml 混合
6 ． 30 ％氢氧化钠溶液
7 ． 0 . 0lmol / L 盐酸标准溶液
【操作】
一、消化
取消化管二支，标明测定管与空白管，按下表进行操作：
混匀，置于电炉上加热消化（图 3-1 ），开始有水蒸气逸出，继而溶液呈现棕色并冒出白烟 (SO 3 ) ，此时火力应减小，并在管口上盖一小漏斗，以免硫酸损失过多，再继续消化至溶液变为澄清的蓝绿色，即消化完毕 ( 此过程约需 25 分钟左右 ) ，冷却后加水 3 . 8ml ，使总量成为 5ml( 内有 1 . 2ml 硫酸 ) ，混匀，准备蒸馏。
图 3-1 消化装置示意图
二、蒸馏
1 ．蒸馏器的结构和用法
蒸馏器有多种，但大同小异。用前需熟悉其使用方法。本实验所用蒸馏器如图 3-2 所示：
图 3-2 微量凯氏定氮器结构示意图
P 1 为出水开关， P 2 为入水开关， A 为蒸气发生室， B 为蒸馏室，与出气管 M 相通。 B 室内有 Y 形管，一端与 A 室相通，另一端经 P 3 与漏斗 D 相连，经此可将样品和试剂加入 B 室， E 为进水管，接水龙头， F 为指形冷凝管， H 为盛有定量硼酸溶液的锥形瓶，以吸收氨。水经 E 、 F 、 G 、 K 而流出，蒸馏时 B 室加入消化好的样品及氢氧化钠，二者反应产生氨， A 室因加热而产生的水蒸气经 Y 管进入 B 室，并将氨一起带出，经冷凝由 M 管进入锥形瓶中被酸吸收。
将洗干净的微量凯氏定氮器安装妥当，把 E 管接水龙头，并关闭 P 1 、 P 2 、 P 3 各塞，打开水源，水则由 E→F→G→K 缓缓流出 ( 水不宜开的过大，以免水从 G 管溢出 ) 。放开 P 2 ，水流入 A 室，并让少量水流入 B 室，然后塞住管口 G ，放开 P 1 ，此时 B 室内水应被吸出，否则应检查各接头处是否漏气。
2 ．蒸馏
（ 1 ） 打开水笼头和 P 2 ，使水经 E→F→G→P 2 进入 A 室，水约至瓶下球形部分的 2 ／ 3 处，即关闭 P 2 。
（ 2 ） 吸取 2 ％硼酸溶液 l0ml ，放人 l00ml 锥形瓶中，加混合指示剂 3 滴 ( 呈灰紫色 ) ，把锥形瓶置于 M 管下，并使管口完全进入硼酸溶液中。
（ 3 ） 打开 P 3 ，吸取消化好的样品溶液 2ml ，由漏斗 D 加入蒸馏室 B 中，用 lml 蒸馏水冲洗漏斗，再加入 30 ％氢氧化钠溶液 5ml ，立即将 P 3 夹紧 ( 可在漏斗中加少量水封闭，以防漏气。
（ 4 ） 用酒精灯加热 A 室，火焰应稳定，以免锥形瓶中的溶液倒吸，待硼酸溶液变为蓝绿色后再继续蒸馏 5min 。
（ 5 ） 将锥形瓶下移，使 M 管离开硼酸液面，再继续蒸馏 1 分钟，最后用蒸馏水 1ml 冲洗 M 管外壁，取下锥形瓶进行滴定。
（ 6 ） 蒸馏完后应立即清洗蒸馏器，其方法是先打开 P 2 ，将 A 室的水充至球形上方，然后塞住 G 口，放开 P l ， B 室内溶液即被吸出，然后再经 D 加蒸馏水入 B 室，如上所述吸出 B 室的水。如此反复洗涤 2 ～ 3 次。
（ 7 ） 空白管溶液也同样进行蒸馏。
三．滴定
用 0 . 01mol/L 的盐酸滴定锥形瓶中收集液，使其由蓝色变为灰紫色 ( 蒸馏前硼酸的颜色 ) ，即为终点，记录滴定所消耗盐酸的数量。
【计算】
1 ． 
式中， A 表示滴定样品用 0 . 01mol ／ L 盐酸的 ml 数； B 表示滴定空白用 0 . 01mol ／ L 盐酸的 ml 数； 0.14 表示 1ml 0 . 01mol ／ L 盐酸 相当于 氮的毫克数。
2 ． 血清蛋白质含量（ g/L ） = 
式中， NPN 表示 非蛋白氮 ， 即制备样品无蛋白滤液中的氮。
【注意事项】
一、样品消化注意事项
1 ．加入样品不要沾附在凯氏烧瓶瓶颈。
2 ．消化开始时不要用强火，要控制好热源，并注意不时转动凯氏烧瓶，以便利用冷凝酸液将附在瓶壁上的固体残渣洗下并促进其消化完全。
3 ．样品中若含脂肪或糖较多，在消化前应加入少量辛醇或液体石蜡或硅油作消泡剂，以防消化过程中产生大量泡沫。
4 ．消化完全后要冷至室温才能稀释或定容。所用试剂溶液应用无氨蒸馏水配制。
二、蒸馏注意事项
1 ．进行蒸馏前必须熟悉仪器特点， P 1 打开 A 室水流出； P 2 打开 G 管水流入； P 3 打开漏斗 D 液体流入 B 室。蒸馏开始后， P 1 、 P 2 、 P 3 均需关闭，定氮处于密闭状态，切不可随意开启。
2 ．下列因素可导致 B 室液体压入 A 室，同时锥形瓶中的硼酸也可能倒吸入 B 室，导致定氮的失败。
（ 1 ） 蒸馏时 P 3 打开， B 室压力增高。
（ 2 ） 蒸馏时酒精灯移开，或火焰时断时续，时大时小， A 室遇冷，压力降低。
（ 3 ） 蒸馏时 P 2 打开，水至 G 管流入 A 室， A 室遇冷压力降低。
3 ．进行蒸馏前必须用水蒸气充分洗涤蒸馏器，以消除可能残存的氨。方法是于 M 管下放一盛有硼酸加指示剂的锥形瓶，若经蒸馏，锥形瓶内颜色不变，即证明蒸馏器内部已经洗涤干净，无氨残留。
4 ．实验室环境忌有碱性雾气，否则影响实验结果。
5 ．溴甲酚绿 - 甲基红指示剂的变色点为 pH5 . 1 ，大于 5 . 1 呈绿色，硼酸加指示剂应为灰紫色，若呈红色，说明硼酸酸性过强，可用 0 . 1mol ／ L 氢氧化钠调整。另外所用仪器不净也会出现红色。
6 ．本法极为灵敏，因此应避免外界氨的干扰，所用试剂及蒸馏水必须无氨。
7 ．一般在操作时，应先蒸馏空白管，然后再蒸馏样品管。
8 ．每次蒸馏完毕，应立即清洗蒸馏器，否则冷却后，清洗困难。
【思考题】
1 ． 消化是否完全与测定结果有何关系？
2 ． 实验室的碱性雾气如何影响实验结果？