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霉菌的培养及形态观察

一、     实验目的：

1、学习并掌握霉菌形态观察法—小室培养。

2、初步了解四类霉菌（青霉、毛霉、根霉、黑曲霉）的基本形态特征。

3、学习并掌握马铃薯培养基的配制方法和载玻片培养的基本技术。

4、巩固显微镜操作技术及无菌操作技术。

二、     实验原理：

1、          霉菌是可产生复杂分枝的菌丝体。霉菌菌丝体由基内菌丝、气生菌丝和繁殖菌丝组成，其菌丝比细菌粗几倍到几十倍，可以采取直接制片和透明胶带法观察，也可以采取载玻片培养观察法，通过无菌操作将薄层培养基琼脂置于载玻片上，接种后盖上盖玻片培养，使菌丝体在盖玻片和载玻片之间的培养基中生长，将培养物直接置于显微镜下可观察到霉菌自然生长状态并可连续观察不同发育期的菌体结构特征变化。

2、          霉菌菌丝体（尤其是繁殖菌丝）及孢子的形态特征是识别不同种类霉菌的重要依据。霉菌与人类的生活息息相关，如：根霉（Rhizopus sp.）是酿造工作中常用糖化菌；毛霉（Mucor sp.）常出现在药酒中，能糖化淀粉并能生成少量乙醇，产生蛋白酶。黑曲霉（Aspergillusniger）是重要的发酵工业菌种，可生产淀粉酶、酸性蛋白酶、纤维素酶等；青霉（Penicillium sp.）在工业上，它可用于生产柠檬酸，延胡索酸，葡萄糖酸等有机酸和酶制剂；最著名的抗生素—青霉素就是从青霉的某些品系中提取出来的。

3、          本实验采用载玻片培养观察法，通过无菌操作将薄层培养基琼脂置于载玻片上，接种后盖上盖玻片培养，使菌丝体在载玻片和盖玻片之间的营养基中生长，将培养物直接放在显微镜下观察霉菌在自然生长下的形态特征。

4、          放线菌的菌落特征：干燥、不透明，表面呈紧密的丝绒状，上有一层色彩鲜艳的干粉；菌落与培养基的连接紧密，难以挑取。其孢子的表面结构、形状及颜色在一定条件下比较稳定，是鉴定菌种的重要依据。放线菌在自然界分布很广，绝大多数为腐生，少数寄生。

三、     实验仪器：

1、          菌种：在马铃薯琼脂斜面上培养7天的根霉、毛霉、黑曲霉和青霉。

2、          培养基：马铃薯培养基（PDA）

3、          仪器和其他用品：载玻片、盖玻片、显微镜、镊子、平皿、接种环、U型玻璃棒、20%甘油、5mL移液管、马铃薯、蔗糖、琼脂、纱布、解剖刀

四、     操作步骤：

1、马铃薯琼脂薄层平板的制备

（1）将马铃薯去皮，称量约40g，切成小块煮沸半个小时。

（2）用纱布过滤，再加入4g蔗糖及4g琼脂，溶化后补足水至200mL。

（3）将配置好的培养基倒入试管中约100mL，塞紧棉塞，用牛皮纸包好并做上记号。

（4）将上述试管置于高压蒸汽灭菌锅内于121°C中灭菌30min。

（5）取出试管，通过无菌操作将培养基倒入已灭菌的平皿中，制成马铃薯琼脂薄层平板。

2、配置20%甘油溶液

（1）用已灭菌的移液管取10mL无水甘油于烧杯中。

（2）加入蒸馏水至50mL即配置好20%的甘油溶液。

3、霉菌制片（载玻片培养观察法）

（1）培养小室准备及灭菌：在平皿底铺一张略小于皿底的圆滤纸片，在其上放一个U型玻棒，在U型玻棒上放一块载玻片和四块盖玻片，盖上皿盖，与121°C灭菌30min，烘干备用。

（2）琼脂块制备：通过无菌操作，用解剖刀由马铃薯琼脂薄层平板上切下1cm²左右的琼脂快，将其移至培养小室的载玻片上，盖玻片之下，每片两块。

（3）接种：通过无菌操作，用接种针从黑曲霉、根霉、毛霉或青霉马铃薯琼脂平板培养物中挑取很少量孢子，接种于培养小室中琼脂块边缘上，将盖玻片覆盖在琼脂块上。每个平皿接种两种不同霉菌并做上标记。

（4）培养：通过无菌操作，在培养小室中圆滤纸片上加2mL灭菌的20%甘油（用于保持湿度），盖上皿盖，于28°C培养。

（5）镜检：根据需要于不同时间取出载玻片用低倍镜镜检，必要时用高倍镜观察，记录观察结果。

五、     实验记录：

                             

 

         毛霉                                 青霉

 

         根霉                               黑曲霉

六、     结果分析:

七、     注意事项：

1、          注意无菌操作，以防杂菌影响所需要观察的霉菌生长，影响实验结果。

2、          接种量要少并尽可能将分散孢子接种在琼脂块边缘，避免培养后菌丝过于密集影响观察。

八、     思考题：

1、          黑曲霉和黑根霉在形态特征有何区别？

答：黑曲霉的营养菌丝具有分隔；气生菌丝的一部分形成长而粗糙的分生孢子梗，顶端膨大成球状顶囊，表面辐射出一层或两层小梗，小梗上着生成串的球形分生孢子。分生孢子梗生于足细胞上，并通过足细胞与营养菌丝相连； 而黑根霉菌丝无隔、分枝状，有匍匐菌丝和假根。在假根的上方直立地生长出一至数根孢囊梗，其顶端膨大成球形孢子囊。囊的基部有囊托，中间有球形或半球形囊轴。囊内产大量孢囊孢子，有性生殖时由不同性别的菌丝或匍匐菌丝上生出配子囊，配子囊双双异宗配合形成接合孢子。

附1：马铃薯培养基配方表：

马铃薯去皮，切成块煮沸半小时，然后用纱布过滤（先一层后六层），再加糖及琼脂，溶化后补足水至200mL。121℃灭菌30min。

附2：霉菌照片

    

黑曲霉                                青霉

            毛霉

第二篇：几种常见酵母菌、霉菌的形态结构观察

                    

微生物实验报告

几种常见酵母菌、霉菌的形态结构观察

                

姓名：             

                    学号：              

                    系别：           

 

                    班级：              

                    日期：           

                    同组成员：       

一、摘要

通过对酵母菌、霉菌形态结构观察，了解酵母菌、霉菌形态结构的形态结构知识。实验结果为：

1、酵母菌一般呈卵圆形、圆形、圆柱形或柠檬性。菌落形态与细菌相似，但较大较 厚，呈乳白色或红色，表面湿润、粘稠，易被挑起。

2、四种霉菌的形态特征。

二、实验目的

1、学习酵母菌、霉菌形态结构。

2、学习酵母菌、霉菌观察方法。

3、了解酵母菌、霉菌在实际中的意义。

三、实验原理

酵母菌：酵母菌多呈圆形、卵圆形，有的呈分支的菌丝状。无性繁殖以出芽生殖为主，少数以分裂方式繁殖；有性生殖是通过不同遗传性的细胞接合产生子囊孢子的方式进行。子囊孢子可用孔雀绿进行染色观察。观察细胞形态和内部结构可采用染色的方法。美蓝是无毒性的染料，新陈代谢旺盛的细胞具有较强的还原能力，使美蓝从蓝色的氧化型变成无色的还原型；而死亡细胞无此还原力，故被染成蓝色。

霉菌：霉菌可产生复合分枝的菌丝体，分基内菌丝、气生菌丝，气生菌丝生长到一定阶段分化产生繁殖菌丝，由繁殖菌丝产生孢子。霉菌菌丝体(尤其是繁殖菌丝)及孢子的形态特征是识别不同种类霉菌的重要依据。霉菌菌丝和孢子的宽度通常比细菌和放线菌粗得多，常是细菌菌体宽度的几倍至几十倍，因此，用低倍/高倍显微镜即可观察。

四、实验材料与仪器

1、  菌种：产黄青霉、黑曲霉、黑根霉、总状毛霉、酿酒酵母、热带假丝酵母斜面菌种。

2、培养基：PDA培养基、0.05%美蓝染液、5%孔雀绿染液、半固体PDA培养基、乳酸苯酚固定液等。

3、仪器及用具：显微镜、载玻片、盖玻片、接种环、酒精灯、镊子、滴管、吸水纸等。

五、实验内容和步骤

酵母菌形态观察

1、酵母菌活体观察及死亡率的鉴定

（1）取酿酒酵母PDA斜面，以无菌水洗下菌苔制成菌悬液。

（2）取洁净载玻片一张，滴加0.05%美蓝染液1滴于载玻片中央，用接种环取酵母菌悬液与染色液混匀，染色2-3min，加盖玻片，在高倍镜下观察酵母菌个体形态。

（3）在一个视野里计数死亡细胞与活细胞，共计数5-6个视野。酵母菌死亡率一般用百分数来表示，以下式来计算：

死亡率=  死亡细胞总数   ×100%

         死活细胞总数  

2、酵母菌子囊孢子的观察

从产孢子培养基上挑取少量菌苔于载玻片的水滴中，经过涂片、干燥和热固定后，加数滴孔雀绿染液，染色1min，水洗去孔雀绿染液；加95%乙醇脱色30s，水洗去乙醇溶液；最后用沙黄染色液复染30s，水洗去沙黄染色液，用吸水纸吸去载玻片上的水分；待制片干燥后镜检。子囊孢子为绿色，子囊为粉红色。

2、  假菌丝的培养与观察

在28℃培养2-3d的假丝酵母PDA培养基中，挑取少量菌苔，放在载玻片上滴一滴清水，制成悬浊液；在空气中自然干燥或置于火焰上方，使酵母菌固定；在高倍显微镜下观察，牙殖酵母可形成藕节状假菌丝，裂殖酵母形成竹节状假菌丝。

霉菌形态观察

1、黑根霉主要观察它的孢囊孢子和假根，取少量黑根霉制成悬浊液，在高倍显微镜下观察；2、黑曲霉的观察方法同黑根霉，主要观察黑曲霉的分生孢子和足细胞；

3、青霉的观察做法同上，观察的是青霉的产孢结构—分生孢子梗；

4、取少量总状毛霉菌苔，在载玻片上加一滴乳酸苯酚油，盖上盖玻片，主要观察的是总状毛霉的孢囊孢子及假根。

六、实验结果与讨论

1、酵母菌死亡率的计算。（如图1）

本实验记录了5组数据，如下表所示

用美兰对新培养的酵母菌进行活体染色后，大多数细胞是被染成蓝色的死细胞，少部分细胞是不被着色的代谢旺盛的活细胞，还有少数为被染成淡蓝色的衰老细胞。这五组实验数据的死亡率有三组数据超过50%，说明大部分细胞是死细胞，少数细胞是活细胞或衰老细胞。造成这一实验结果的可能原因是染色时间过长，导致细胞大部分死亡，从而被染成蓝色细胞。

酵母菌一般呈卵圆形、圆形、圆柱形或柠檬性。菌落形态与细菌相似，但较大较 厚，呈乳白色或红色，表面湿润、粘稠，易被挑起。

2、  通过对酿酒酵母的活体观察可以看到酵母细胞的球形结构以及其出芽生殖产生的孢子，还有其形成的子囊孢子，在盖玻片的挤压下，只能看到三个孢子，实则为四个子囊孢子。

3、  酵母菌子囊孢子为绿色，子囊为粉红色。（见图2 ）

4、   四种霉菌的形态特征。

  

图1酵母菌活体染色图    图2 酵母菌子囊孢子            图3 青霉

  

图4根霉                       图5 曲霉                 图6 毛霉
 

    

七、讨论与分析

1、取菌时，可能取菌数量过多，叠在一起导致观察效果差。

2、我们在进行染色的过程中，多次用染液和水进行冲洗，大部分菌丝估计已脱落，所以无法观察到。

八、参考文献

《微生物学实验指导》（第2版）黄秀梨  辛明秀  高等教育出版社