实验名称:菠菜色素的提取和分离
一、 实验目的
1、通过绿色植物色素的提取和分离，了解天然物质分离提纯方法；
2、通过柱色谱和薄层色谱分离操作，加深了解微量有机物色谱分离鉴定的原理。
二、 实验原理
绿色植物如菠菜叶中含有叶绿素（绿）、胡萝卜素（橙）和叶黄素（黄）等多种天然色素。
叶绿素存在两种结构相似的形式即叶绿素a(C55H72O5N4Mg)和叶绿素b(C55H70O6N4Mg)，其差别仅是叶绿素a中一个甲基被甲酰基所取代从而形成了叶绿素b。它们都是吡咯衍生物与金属镁的络合物，是植物进行光合作用所必需的催化剂。植物中叶绿素a的含量通常是b的3倍。尽管叶绿素分子中含有一些极性基团，但大的烃基结构使它易溶于醚、石油醚等一些非极性的溶剂。
胡萝卜素（C40H56）是具有长链结构的共轭多烯。它有三种异构体，即a-胡萝卜素、β-胡萝卜素和γ-胡萝卜素，其中β-胡萝卜素含量最多，也最重要。在生物体内，β-胡萝卜素受酶催化氧化形成维生素A。目前β-胡萝卜素已可进行工业生产，可作为维生素A使用，也可作为食品工业中的色素。
叶黄素（C40H56O2）是胡萝卜素的羟基衍生物，它在绿叶中的含量通常是胡萝卜素的两倍。与胡萝卜素相比，叶黄素较易溶于醇而在石油醚中溶解度较小。
β-胡萝卜素（R = H） 叶黄素（R = OH）
维生素A
三、 操作步骤
1、菠菜色素的提取
取2g新鲜菠菜叶，与10mL甲醇拌匀研磨5分钟，弃去滤液。残渣用10mL的石油醚-甲醇（3:2）混合液进行提取，共提取两次。合并液用水洗后弃去甲醇层，石油醚层进行干燥、浓缩。
2、薄层层析
将上述的浓缩液点在硅胶G的预制板上，分别用石油醚-丙酮（8:2）和石油醚-乙酸乙酯（6:4）两种溶剂系统展开，经过显色后，进行观察并计算比移值。
3、柱层析
取3g中性氧化铝进行湿法装柱。填料装好后，从柱顶加入上述浓缩液，用石油醚-丙酮（9:1）、石油醚-丙酮（7:3）和正丁醇-乙醇-水（3:1:1）进行洗脱，依次接收个色素带，即得胡萝卜素（橙黄色溶液）、叶黄素（黄色溶液）、叶绿素a（蓝绿色溶液）以及叶绿素b（黄绿色溶液）。
【实验流程】
四、实验关键及注意事项
注意薄层色谱、柱层析实验操作要点的掌握和应用
五、提问纲要
试比较叶绿素、叶黄素和胡萝卜素三种色素的极性，为什么胡萝卜素在层析柱中移动最快？
六、主要试剂用量、规格
新鲜菠菜2g、石油醚、乙酸乙酯、丙酮、甲醇10ml、硅胶G、中性氧化铝
植物细胞质壁分离实验
探究目的：了解一定浓度的不同溶液引起植物细胞质壁分离的效果
实验材料：紫色洋葱鳞片叶
实验试剂：30%的蔗糖溶液，
实验器具：显微镜，载玻片，盖玻片，胶头滴管，吸水纸，刀片，镊子，烧杯
方法步骤：
1.制作洋葱鳞片叶外表皮临时装片；
2.用显微镜观察洋葱鳞片叶表细胞中紫色中央液泡的大小，以及原生质的位置；
3.从盖玻片的一侧滴一滴蔗糖溶液，在盖玻片的另一侧用吸水纸进行吸引，这样重复几次。在开始滴蔗糖溶液时开始观察，马上用手表计时，质壁分离停止时，立即停止计时，记录好时间。质壁分离结束后，观察原生质层和液泡的形态。再在载玻片一侧滴清水，用吸水纸在另一侧吸引，观察细胞质壁复原情况。
4.分别用新的洋葱鳞片叶外表皮装片加实验试剂中的其它试剂，重复3的实验。
5.将观察到的现象记录下来，并分析，得出结论。
观察成熟植物细胞的质壁分离和复原
实验原理：
当外界溶液浓度大于细胞液浓度时，根据扩散作用原理，水分会由细胞液中渗出到外界溶液中，通过渗透作用失水；由于细胞壁和原生质层的伸缩性不同，细胞壁伸缩性较小，而原生质层性较大，从而使二者分开；反之，外界溶液浓度大于细胞液浓度，则细胞通过渗透作用吸水，分离后的质和壁又复原。
目的要求：
1．初步学会观察植物细胞质壁分离和复原的方法；
2．理解植物细胞发生质壁分离和复原的原理。
重点和难点：
1．初步掌握植物细胞质壁分离和复原的实验方法；
2．临时装片的制作；
3．高倍显微镜的使用。
实验器材：
紫色洋葱的鳞片叶、刀子、镊子、滴管、载玻片、盖玻片、吸水纸、显微镜；
质量浓度为0.3g/mL的蔗糖溶液、清水；
方法步骤：
一 临时装片制作：
1选材：
（1）选用紫色特别深的洋葱外表皮；
说明：Ⅰ在实验之前，最好将洋葱放在水中浸泡一下，可以使洋葱吸水多一些，而且代谢也比较旺盛，实验效果明显。Ⅱ将洋葱的外层剥去两层，因为处于最外的可能已经死亡。提问：对实验材料有何要求？什么样的细胞可以发生质壁分离？
（2）取表皮：在洋葱的外表皮上，用刀片划“井”字，用镊子轻轻撕取一小块；
关键：最好撕取单层细胞，如果撕的太厚，则会使细胞重叠，严重影响实验效果；
2制片：
在载玻片中央滴上一滴清水，然后将取下的洋葱表皮放在水中，平展开来；加上盖玻片。
注意：Ⅰ洋葱表皮不能卷曲起来；Ⅱ不能带有气泡；Ⅲ加盖玻片时，要从一侧大约45°角放下，在载玻片和盖玻片之间充满了清水，以便挤出空气。
二 观察：
㈠低倍镜观察：找到洋葱表皮细胞。
㈡高倍镜观察观察正常细胞形态。
在高倍镜下主要要注意以下几个结构：⑴紫色的大液泡，几乎充满了整个细胞；⑵注意观察原生质层和细胞壁紧紧地贴在一起。⑶找到细胞核，它是判断液泡膜还是细胞膜的关键。⑷指导学生绘一个正常状态下的成熟植物细胞结构图应指导学生多移动临时装片，找到呈单层的地方，然后调节清晰；
㈢质壁分离实验：
1．处理：
从载物台上取下装片，在盖玻片的一侧，滴入0.3g/mL的蔗糖溶液，另一侧用吸水纸重复吸引几次。
实验成功关键：最好多重复几次，因为在洋葱表皮周围充满的是清水，如果不多重复几次，洋葱表皮周围的蔗糖溶液浓度太低，质壁分离效果不明显。
拓展提问：对所用的溶液有何要求？
答：Ⅰ不能是对植物细胞有伤害作用的物质，如强酸强碱，因为它们会使细胞致死，而死亡的细胞内的膜便失去了选择透过性，而成了全透性；Ⅱ外界溶液中的物质必须是不可以被植物细胞吸收的物质，如硝酸钾、碳酸铵等等，因为这些物质会被植物细胞所吸收，而使质壁分离后的植物细胞自动发生质壁分离复原；Ⅲ溶液的浓度要适中，太大会使细胞失水过多或过快而导致细胞死亡，而浓度太小又现象不明显；
2．观察：
在高倍镜下观察，可见到本来在各个细胞交界的地方都是紫色的，此时可见在细胞的角落处开始变淡，随着可见液泡变小，颜色变深，慢慢的从边角到四周完全分离开来。
说明：所谓的质壁分离要让学生清楚其真实含义，是指原生质层和细胞壁的分离，不是细胞壁和细胞质分离；
指导学生分析原因：Ⅰ外因：外界的蔗糖溶液浓度大于细胞液的浓度，成熟的植物细胞通过渗透作用失水；Ⅱ内因：细胞壁和原生质层的伸缩性不同，细胞壁的伸缩性较小，而原生质层的伸缩性较大，二者不同步伸缩，从而导致质壁分离；
㈣质壁分离复原实验：
1处理：取下临时装片，在一侧滴入清水，另一侧再用吸水纸重复几次吸引，以确保洋葱表皮细胞完全浸在几乎是清水中；
2观察：先在低倍镜找到一个现象质壁分离比较明显的细胞，然后换用高倍镜观察，可见和刚才相反的现象，中央液泡渐渐变大，颜色变浅，最后原生质层又和细胞壁紧紧地贴在一起。
三 总结：细胞液浓度小于外界溶液浓度时，细胞通过渗透作用吸水，发生质壁分离现象；细胞液浓度大于外界溶液浓度时，细胞通过渗透作用失水，发生质壁分离复原现象；
四用途：证明成熟的植物细胞可以发生渗透作用；还可以证明细胞的死活。
附：紫色洋葱表皮细胞正常形态及质壁分离图
拓展实验：植物质壁分离和复原实验从微观角度证明成熟植物细胞可渗透失水和吸水，如何从宏观角度证明成熟植物细胞可渗透失水和吸水？引导学生从实际生活出发设计实验，并准备一些材料让学生亲自操作。
实验方案一：1.取烧杯2只，装等量的清水和0.3g/mL的蔗糖溶液，2.将新鲜萝卜切成大小一样的萝卜条（如长10厘米，宽1厘米，厚1厘米）放入其中，3.20分钟后，测量萝卜条的长度和质量。
实验方案二：1.取两个大小相同的萝卜，中间挖大小相同的两个洞，2.一个萝卜的洞中加满清水，另一个洞中加满0.3g/mL的蔗糖溶液，3.20分钟后，观察洞中液体量的变化。
第二篇：菠菜中色素的提取与分离
菠菜中的色素提取与分离
食品11—2班 李薇 110424228
一、实验目的
1 、通过对菠菜中色素的提取和分离，了解天然物质分离提纯方法； 2 、通过柱色谱分离操作，加深了解微量有机物色谱分离鉴定的原理。
二、实验原理
绿色植物如菠菜叶中含有叶绿素（绿）、胡萝卜素（橙）和叶黄素（黄）等多种天然色素。
叶绿素存在两种结构相似的形式即叶绿素 a(C55 H72O5N4Mg) 和叶绿素 b(C55H7O6N4Mg)，其差别仅中一个甲基被b中的甲酰基所取代。它们都是吡咯衍生物与金属镁的络合物，是植物进行光合作用所必需的催化剂。植物中叶绿素a的含量通常是b的3倍。尽管叶绿素分子中含有一些极性基团，但大的烃基结构使它易溶于醚、石油醚等一些非极性的溶剂。
胡萝卜素(C40H56 )是具有长链结构的共轭多烯。它有三种异构体，即a-,β -γ-胡萝卜素，其β-异构体含量最多，也最重要。在生物体内，β-体受酶催化氧化即形成维生素A。目β-胡萝卜素已可进行工业生产，可作为维生素A使用，也可作为食品工业中的色素。 叶黄素(C40H56O2 )是胡萝卜素的羟基衍生物，它在绿叶中的含量通常是胡萝卜素的两倍。与胡萝卜素相比，叶黄素较易溶于醇而在石油醚中溶解度较小。
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柱色谱：柱色谱法，又称层析法.是一种以分配平衡为机理的分配方法.色谱体系包含两个相,一个是固定相,一个是流动相.当两相相对运动时,反复多次的利用混合物中所含各组分分配平衡性质的差异,最后达到彼此分离的目的。柱色谱是在一根玻璃管或金属管中迸行的色谱技术，将吸附剂填充到管中而使之成为柱状，这样的管状柱称为吸附色谱柱。使用吸附色谱柱分离混合物的方法，称为吸附柱色谱。这种方法可以用来分离大多数有机化合物，尤其适合于复杂的天然产物的分离。分离容量从几毫克到百毫克级，所以，适用于分离和精制较大量的样品。
1. 装柱 色谱柱的大小规格由待分离样品的量和吸附难易程度来决定。一般柱管的直径为0.5～l.0Cm，长度为直径的10～40倍。填充吸附剂的量约为样品重量的20～50倍，柱体高度应占柱管高度的3/4，柱子过于细长或过于粗短都不好。装柱前，柱子应干净、干燥，并垂直固定在铁架台上，将少量洗脱剂注入柱内，取一小团玻璃毛或脱脂棉用溶剂润湿后塞入管中，用一长玻璃棒轻轻送到底部，适当捣压，赶出棉团中的气泡，但不能压得太紧，以免阻碍溶剂畅流 (如管子带有筛板，则可省略该步操作)。再在上面加入一层约0.5 cm厚的洁净细砂，从对称方向轻轻叩击柱管，使砂面平整。
常用的装柱方法有干装法和湿装法两种:
(1)干装法：在柱内装入2/3溶剂，在管口上放一漏斗，打开活塞，让溶剂慢慢地滴入锥形瓶中，接着把干吸附剂经漏斗以细流状倾泻到管柱内，同时用套在玻璃棒 (或铅笔等)上的橡皮塞轻轻敲击管柱， 2
使吸附剂均匀地向下沉降到底部。填充完毕后，用滴管吸取少量溶剂把粘附在管壁上的吸附剂颗粒冲入柱内，继续敲击管子直到柱体不再下沉为止。柱面上再加盖一薄层洁净细砂，把柱面上液层高度降至0.1～l cm，再把收集的溶剂反复循环通过柱体几次，便可得到沉降得较紧密的柱体。
(2)湿装法：基本方法与干装法类似，所不同的是，装柱前吸附剂需要预先用溶剂调成淤浆状，在倒入淤浆时，应尽可能连续均匀地一次完成。如果柱子较大，应事先将吸附剂泡在一定量的溶剂中，并充分搅拌后过夜 (排除气泡)，然后再装。无论是干装法，还是湿装法，装好的色谱柱应是充填均匀，松紧适宜一致，没有气泡和裂缝，否则会造成洗脱剂流动不规则而形成“沟流”，引起色谱带变形，影响分离效果。
2. 加样 将干燥待分离固体样品称重后，溶解于极性尽可能小的溶剂中使之成为浓溶液。将柱内液面降到与柱面相齐时，关闭柱子。用滴管小心沿色谱柱管壁均匀地加到柱顶上。加完后，用少量溶剂把容器和滴管冲洗净并全部加到柱内，再用溶剂把粘附在管壁上的样品溶液淋洗下去。慢慢打开活塞，调整液面和柱面相平为止，关好活塞。如果样品是液体，可直接加样。
3. 洗脱与检测 将选好的洗脱剂沿柱管内壁缓慢地加入柱内，直到充满为止 (任何时候都不要冲起柱面覆盖物)。打开活塞，让洗脱剂慢慢流经柱体，洗脱开始。在洗脱过程中，注意随时添加洗脱剂，以保持液面的高度恒定，特别应注意不可使柱面暴露于空气中。在进 3
行大柱洗脱时，可在柱顶上架一个装有洗脱剂的带盖塞的分液漏斗或倒置的长颈烧瓶，让漏斗颈口浸入柱内液面下，这样便可以自动加液。如果采用梯度溶剂分段洗脱，则应从极性最小的洗脱剂开始，依次增加极性，并记录每种溶剂的体积和柱子内滞留的溶剂体积，直到最后一个成分流出为止。洗脱的速度也是影响柱色谱分离效果的一个重要因素。大柱一般调节在每小时流出的毫升数等于柱内吸附剂的克数。中小型柱一般以1～5滴/秒的速度为宜。洗脱液的收集，有色物质，按色带分段收集，两色带之间要另收集，可能两组分有重叠。对无色物质的接收，一般采用分等份连续收集，每份流出液的体积毫升数等于吸附剂的克数。若洗脱剂的极性较强，或者各成分结构很相似时，每份收集量就要少一些，具体数额的确定，要通过薄层色谱检测，视分离情况而定。现，多数用分步接受器自动控制接收。洗脱完毕，采用薄层色谱法对各收集液进行鉴定，把含相同组分的收集液合并，除去溶剂，便得到各组分的较纯样品。
吸附剂的要求
（1）对样品组分和洗脱剂都不会发生任何化学反应，在洗脱剂中也不会溶解。
（2）对待分离组分能够进行可逆的吸附，同时具有足够的吸附力，使组分在固定相与流动相之间能最快地达到平衡。
（3）颗粒形状均匀，大小适当，以保证洗脱剂能够以一定的流速 (一般为1.5 mL·min-1)通过色谱柱。
（4）材料易得，价格便宜而且是无色的，以便于观察。可用于吸附 4
剂的物质有氧化铝、硅胶、聚酰胺、硅酸镁、滑石粉、氧化钙 (镁)、淀粉、纤维素、蔗糖和活性炭等。其中有些对几类物质分离效果较好，而对其它大多数化合物不适用。
三、实验试剂和实验仪器
仪器： 层析柱，研钵，蒸馏装置，棉花，天平，烧杯，布氏漏斗，玻璃棒，锥形瓶，分液漏斗，试管 ，铁架台
试剂：无水乙醇，丙酮，石油醚，三氧化二铝，无水硫酸钠，正丁醇
四、实验步骤
1.层析柱的制备
称取10克三氧化二铝于30ml石油醚中搅拌倒入柱内，重复使用石油醚，直至三氧化二铝都倒入柱内。完成后，三氧化二铝应填满柱内的二分之一至三分之二。在柱内倒入少量石油醚，打开活塞，让石油醚流下，使柱内的三氧化二铝均匀。重复使用石油醚。
2.菠菜中色素的浓缩、提取
取10 g 洗净晾干的新鲜菠菜叶用乙醇清洗,再置于研钵内，加入15 mL3∶2石油醚-乙醇混合液, 适当研磨,然后用布氏漏斗抽出提取液，反复三次,每次加入15mL3:2石油醚-乙醇的混合物， 合并提取液，再将提取液转移到分液漏斗中。向分液漏斗内加入少量蒸馏水,待溶液分层后滤出下层溶液，将上层溶液转移到锥形瓶内，加少量无水硫酸钠干燥。
3.色素的分离层析
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待石油醚降至与三氧化二铝的面平齐后，倒入色素提取液。待色素全部进入柱体后, 在柱顶放上棉花后加入适量洗脱剂（9∶1石油醚—丙酮）,打开活塞，层析开始进行，用小烧瓶收集。实验过程中不断加入洗脱剂，不能让柱内干燥。当第一个有色圈将滴出时, 取一支试管收集, 得到胡萝卜素。再用7∶3石油醚—丙酮作洗脱剂,继续用烧瓶收集，待第二个有色圈将要滴出时取另一支试管收集，得到叶黄素。再用3∶1∶1丁醇—乙醇—水作洗脱剂, 用相同的方法收集，得到叶绿素a和叶绿素b。
注意事项
1.为了保持柱子的均一性，必须使整个吸附剂浸泡在溶剂或溶液中，否则当柱中溶剂或溶液流干时，就会使柱身干裂，影响渗透和显色的均一性。因此要保证整个装样过程中石油醚液面要高于三氧化二铝的表面。
2.要在吸附剂上端加入棉花使加样品时不致把吸附剂冲起。
3.层析柱填装紧密与否，对分离效果很有影响，若各部分松紧不匀，会影响渗透速度和显色的均匀。
4.注意洗脱剂的配比，分离出不同的色素后更换洗脱剂。
5.洗脱流速不宜过快，避免因此压紧凝胶，色素分离不开；也不要过慢，使柱装得太松，导致层析过程中，凝胶床高度下降，色素洗脱很慢。
6.样品一定要足够浓缩，加样量不要过大或过小。
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