实验二十一 植物组织培养
实 验 目 的
植物组织培养是60年代以来植物细胞生物学中发展起来的——项生物技术。它是借用无菌操作
方法，培养植物的离体器官、组织或细胞，使其在人工合成的培养基上，通过细胞的分裂、增殖、
分化、发育，最终长成完整再生植株的过程。
植物组织培养技术的研究，不仅具有重大的理论意义，而且在生产实践中也已显示了广阔地
应用前景。组织分化与形态建成问题，快速繁殖与去除病毒，花药培养与单倍体育种、幼胚培养
与试管受精，抗性突变体的筛选与体细胞无性系变异，悬浮细胞培养与次生物质生产以及超低温
种质保存等方面的深人研究和实际应用，都必须借助植物组织培养技术的基本程序和方法，深刻
理解植物细胞的全能性。
实 验 用 品
一、材料
枸杞、烟草等植物的叶片。
二、仪器
高压灭菌锅、超净工作台、烘箱、培养箱或培养室。
三、用具
镊子、解剖刀、接种针、铝饭盒、锡泊纸、玻璃铅笔或记号笔、橡皮筋。
四、玻璃器皿
试剂瓶(50、100、1 000mi)、三角瓶(100mD、刻度吸管(0．5、1、5、10mi)、培养皿(直
径9～llcm)。
五、药品与试剂
1，药品(见表21—1)
2．70％酒精
3．0．1％升汞
实 验 方 法
一、培养基的配制
配制培养基前先要配制母液。母液分大量元素、微量元素、铁盐及有机物质四类。(各类成分、
浓度、用量详见表21—1)。
1．大量元素母液(10倍液)
分别称取10倍用量的各种大量无机盐，依次溶解于大约800mi热的(60～80C)蒸馏水中。
(一种成分完全溶解后再加入下一种，最后加水，定容至)000ml后装入试剂瓶中，冰箱内贮存备
用。
2．微量元素母液(100倍液)
分别称取100倍用量的微量无机盐，依次溶解于800mi重蒸水中，加水定容到l 000mi。
3．铁盐母液(100倍液)
称取100倍用量的Naz—EDTA<乙二胺四乙酸钠)和FeSO，·7H20，溶于800mi重蒸水中，最
后定容到1 000rnl。
4．有机物质母液(100倍液)
分别称取50倍用量的各种有机物质，依次溶解于400mi重蒸水中，定容至1 000mi，装入棕
色试剂瓶中，贮存冰箱备用。
除了上述四种母液外，培养墓中经常附加的各种生长素和细胞分裂素也要配成母液贮存．临
用时按浓度定量吸取加入。
5．生长素
如2，4—D、IAA、NAA等。准确称取20rug，先用2mi 95％乙醇溶解，然后加水，定容至20mi，
浓度为lmg／mi，再放置冰箱内贮存备用。
6．细胞分裂素
如激动素(K()、6—苄基嘌岭(6—BA)。准确称取20rug，先用2ml的1 mol／LHCI或NaOH
溶解，然后加水，定容至20mi，浓度为lmg／mi，再放置冰箱内贮存备用。
(二)培养基的配制与分装
1．取1 000mi烧杯一只，加大量元素10倍母液100ml，微量元素100倍母液10mi，铁盐100
倍母液10ml，有机物质100倍母液l'0ml。此外，根据培养材料和实验目的还要附加一定量的生长
素，细胞分裂素及蔗糖等，然后加水至l 000mi，待蔗糖充分溶解后用l mol／L的NaOH或HCl调
酸碱度为pH5．8，最后加入琼脂粉6．5s，如用琼脂条，则要加8e。
2．将盛有培养基的烧杯放入高压锅中，上盖牛皮纸一张，盖上高压锅盖，蒸煮半小时左右，待
琼脂完全融化后取出，分装到培养用三角瓶中，每只100ml三角瓶约装40inl培养基。分装时要避
免把培养基倒在瓶口上，否则培养时容易引起杂菌污染。
3．把锡泊纸裁成适当大小的长方形，背靠背折起来，使成正方形，紧密裹在瓶口上，随后便
可进行灭菌。
培养基的种类和附加成分是根据培养物的种类，外植体的来源以及具体的实验目的和要求来
确定的。下列经验可作为杞枸叶片培养实验的参考和依据。
1．MS培养基附加2，4—D 0．5mg／L，用于诱导胚性愈伤组织，借以观察体细胞胚的形成和发
生。
2．MS培养基附加6—BA o．1mg／L、NAA o．5mi／L，诱导叶外植体通过体细胞胚发生途径直接
形成幼苗。
3．．MS培养基附加6—BA O．5mg／L、NAA 0．5mi／L，诱导叶外植体通过器官发生途径直接形
成不定芽。
三种培养基中附加的蔗糖浓度均为3％。
(三)培养基的灭菌
把装好培养基的三角瓶放入高压灭菌锅中，盖好锅盖，关闭放气阀和安全阀，接通电源，进
行加温，当锅内压力达到3X10‘Pa(5磅)时打开放气阀，放气5min，使锅内冷空气完全排出。关
上放气阀，等气压升到9．9X104pa(15磅)时，在9．9X104～1．3X10‘Pa(15～20磅)下高压灭
菌15～20rain。断开电源，等高压灭菌锅灭菌后打开放气阀，使锅内蒸气完全放出，打开锅盖，取
出培养瓶，置培养室凝固备用。
二、取材、消毒与接种
(一)取材与消毒
自大田中选取无病、无虫、生长正常的枸杞枝条，带回实验室后用自来水冲洗干净，剪下叶
子，投入300ml带塞磨口三角瓶中。打开超净工作台，在超净工作台内向瓶内加入少量70％酒精，
轻轻摇动15—30s，倒出酒精，加入o．1％升汞液。浸泡消毒8mm。倒去升汞液，用无菌水换诜3
～4次，彻底清除残留叶面和瓶内的升汞液。
(二)接种
先用肥皂洗手，穿上工作服，戴上口罩和工作帽，再用新洁尔灭浸泡过的沙布擦抹工作台台
面。放入培养瓶和接种用具(接种用的镊子、解剖刀、接种针及培养皿等须事前放人铝饭盒，经
150～160C烘箱干热灭菌2—3h)，点燃酒精灯，用酒精棉球擦拭手臂。把镊子、解剖刀，接种针
插入内盛70％酒精的广口瓶中。
用镊子把叶子夹入培养皿内的吸水纸上，吸干水珠，把叶子切成3X 5mm大的小片，f丁开三
角瓶，把叶片投入瓶内，用接种针拨匀，重新盖上锡泊纸，扎上橡皮筋，用玻璃铅笔在瓶壁上写
明培养材料、培养基代号，标明接种日期。
全部接种工作都是在严格无菌条件下进行的，所以要特别认真、仔细、以防杂菌污染。
三、培养与观察
接种完毕后取出培养瓶，置26～28C恒温培养室内，照光条件下培养，定期进行观察。培养
3—4周时可以看到下列情况：
1．MS培养基附加2，4—D 0．5mg／L
沿u卜片切口已长出大量色白、疏松呈颗粒状的愈伤组织。取愈伤组织数块，置实体显微镜下
进行解剖，可发现愈伤组织内含有大量处于不同发育阶段的体细胞胚，如球形胚、心形胚、鱼雷
胚及早子叶胚等。大量的研究认为：体细胞胚来源于愈伤组织内的单个胚性细胞，属于单细胞起
源，因此具有重大的研究价值和应用前景。
2．MS培养基附加6—BA0．1 mol几和NAA 0．5rug／L
愈伤组织为黄绿色，其上已分化出许多小苗，具有两片小子叶，类似于典型的种子苗。显微
切片观察证明，这些小苗来源于愈伤组织中的单个胚性细胞，是通过体细胞胚发生途径形成的。
3．MS培养基附加6—BA 0．5rug／I。和NAA O．5mg几
愈伤组织颜色较绿，质地较为致密，已分化出许多丛生的不定芽，形态特征与2中的情况明
显不同，这是通过器官发生途径形成的。
作 业
1，根据枸杞叶片培养过程中所看到的结果，你认为2，4—D、6—BA和NAA对于形态发生过程
各有何种影响?
2．人工条件下培养的植物离体器官、组织或细胞，经过分裂、增殖，分化、发育，最终长成
完整植株的过程，能够说明什么问题?
实验五十 植物细胞的悬浮培养
将游离的植物细胞或小的细胞团置于液体培养基中进行培养和生长的一种技术，称为植物细
胞悬浮培养。它是从愈伤组织的液体培养基础上发展起来的一种新的培养技术。从50年代起，米
尔(Muir)等便对单细胞培养进行了探讨和研究，得到了万寿菊，烟草单细胞和细胞团的悬浮液。
1958年斯图尔德(F．C．Steward)等进行了胡萝L愈伤组织的悬浮培养，并得到了完整的再生植株。
三十多年来，从试管的悬浮培养发展到大容量的发酵罐培养，从不连续培养发展到半连续和连续培
养。80年代以来，作为生物技术中的一个组成部分，正在发展成为一门新兴的产业体系。悬浮培养
技术为研究植物细胞的生理、生化、遗传和分化的机理提供实验材料，也为利用植物细胞进行次生
代谢物的工业生产提供技术基础。此外，还在育种、快速繁殖、原生质体培养、体细胞杂交以及作为
基因转化的受体等方面均得到了广泛地应用。
由于植物细胞具有聚集在一起的特性，因此，在分裂后，往往不能像细菌细胞那样各自分开，
而是大多以细胞团的形式存在。至今还不能培养完全是单细胞的悬浮液。要进行单细胞培养或选
择细胞无性系，需要进行平板培养，微室培养和看护培养。本实验仅介绍最常用的悬浮培养技
j 术。
实 验 目 的
1．掌握植物悬浮细胞系建立的方法，原理。
2．学会对悬浮细胞培养物进行细胞计数及绘制细胞生长曲线。
实 验 原 理
植物离体培养可产生愈伤组织。将疏松型的愈饬组织悬浮在液体培养基中并在振荡条件下培
养一段时间后，可形成分散的悬浮培养物。良好的悬浮培养物应具备以下特征：(1)主要由单细胞和
小细胞团组成；(2)细胞具有旺盛的生长和分裂能力，增殖速度快：(3)大多数细胞在形态上应具有
分生细胞的特征，它们多呈等径形，核—质比率大，胞质浓厚，无液胞或液胞化程度较低。要建成这样
的悬浮培养体系，首先需要有良好的起始培养物——迅速增殖的疏松型愈伤组织。然后经过培养基
成分和培养条件的选择，并经多次继代培养才能达到。悬浮培养细胞经长期继代培养后，染色体常
有变异现象，细胞的再生能力也有逐渐降低的趋势。然而对于以生产有用代谢物质为目的的大量培 ’
养，这种再生能力的降低不一定有不良影响。
实 验 用 品
一、器材
超净工作台，高压灭菌锅、旋转式摇床、水浴锅、倒置显微镜、镊子、酒精灯、100mi三角瓶、移液
管、pH计、恒温培养室、漏斗、不锈钢网或筛、血细胞计数板等。
二、材料
松软的烟草或胡萝L愈伤组织。
三、试剂
(1)附加2％蔗糖、1％甘露醇、500mg几水解乳蛋白、1．5m1／1。2，4—D的MS培养基，pH调至
5，6～6．2。
(2)8％三氧化铬(Cr03)。
实 验 方 法
1．用镊子央取出生长旺盛的松软愈伤组织，放人三角瓶中并轻轻夹碎。每100mi三角瓶含灭
过菌的MS培养基10一15mi，每瓶接种1～1．5s愈伤组织，以保证最初培养物中有足够量的细
胞。
2．将已接种的三角瓶置于旋转式摇床上。在100r／mm，25～28C条件下，进行振荡培养。
3．经6～10天培养后，若细胞明显增殖，可向培养瓶中加新鲜培养基10mi，必要时，可用大
口移液管将培养物分装成两瓶，继续培养。(若细胞无明显增殖，可能是起始材料不适当，应考虑
用旺盛增殖期的愈伤组织重新接种)。可进行第一次继代培养。
4。悬浮培养物的过滤：按“3”法继代培养几代后，培养液中应主要由单细胞和小细胞团(不多
于20个细胞)组成。若仍含有较大的细胞团，可用适当孔径的金属网筛过滤，再将过滤后的悬浮细
胞继续培养。
5．细胞计数。取，—定体积的细胞悬液，加人2倍体积的8％的三氧化铬(CrO，)，置70C水浴处
理]5min。冷却后，用移液管重复吹打细胞悬液，以使细胞充分分散，混匀后，取一滴悬液置人血细
胞计数板上计数。
6．制作细胞生长曲线：为了解悬浮培养细胞的生长动态，可用以下方法绘制生长曲线
图：
①鲜重法(freshweigh method)
在转代培养的不同时间，取一定体积的悬浮细胞培养物，离心收集后，称量细胞的鲜重，以鲜重
为纵座标，培养时间为横座标，绘制鲜重增长曲线。
②干重法(dryweighmethod)
可在称量鲜重之后，将细胞进行烘干，再称量干重。以干重为纵坐标，培养时间为横坐标，绘制
细胞干重生长曲线。
上述两种方法均需每隔2天取样一次，共取?次，每个样品重复三次，整个实验进行期间不再
往培养瓶中换入新鲜培养液。
7．细胞活力的检查。对于初学者，往往需要检测活细胞的比率。可在培养的不同阶段，吸取一
滴细胞悬液，放在载玻片上，滴一滴o．1％酚藏花红溶液(用培养基配制)染色，在显微镜下观察。凡
活细胞均不着色，而死细胞则很快被染成红色。也可用o．1％荧光双醋酸酯溶液染色，凡活细胞将
在紫外光诱发下显示蓝绿色荧光。有经验的操作者，则可根据细胞形态、胞质环流判别细胞的死活。
8．细胞再生能力的鉴定：
为了解悬浮培养细胞是否仍具有再生能力，可将培养细胞转移到琼脂固化的培养基上，使其再
形成愈伤组织，进而在分化培养基上，诱导植株的分化。
注意事项；
1．上述步骤均灭菌操作，培养基、用具、器皿等要高压灭菌后方可使用。
2。如培养液混浊或呈现乳白色，表明已污染。
3．每次继代培养时，应在倒置显微镜下观察培养物中各类细胞及其它残余物的情况，以有意
识地留下圆细胞，弃去长细胞。
作 业
、计算出你所制作的悬浮培养物的密度，并绘出其细胞生长曲线图。
思 考 题
1．如何将植物细胞悬浮系用于细胞分化规律或机理的研究?
2．对你的实验结果进行描述，分析和总结。
实验五十一 植物原生质体融合与体细胞杂交
I．聚乙二醇法诱导原生质体融合
不同种植物的原生质体可在人工诱导条件下融合。所产生的杂种细胞，即异核体，经过培养可
再生新壁，分裂形成愈伤组织，进而分化产生杂种植株。由于进行融合的原生质体来自体细胞，故该
项技术也叫体细胞杂交。原生质体融合能使有性杂交不亲合的植物种间进行广泛的遗传重组，因而
在农业育种上具有巨大的潜力。在植物遗传操作研究中也是关键技术之一，
人工诱导原生质体融合可使用物理学方法，如运用细胞融合仪，在电场诱导下实现融合。然而
至今广为使用的仍是聚乙二醇和高pH钙溶液相处理的化学方法(Kaa等，1974)。该法应用分子量
为1 500～6 000的聚乙二醇(PEG)溶液引起原生质体的聚集和粘连，然后用高pH的钙溶液稀释
时，就产生了高频率的融合。融合的频率和活力常与所用PEG的分子量、浓度、作用时间，原生质体
的生理状态与密度以及操作者的细心程度有关。
实 验 目 的
了解用聚L---醇(PEG)方法诱导同种植物原生质体融合的技术，并能根据亲本原生质体的形
态标志来鉴别杂种细胞。
实 验 用 品
一、材料
1．烟草或其它植物无菌苗的叶片。
2．胡萝L肉质根诱导的松软愈伤组织或悬浮培养细胞。
二、试剂 ，
1．酶液及洗涤液，同植物原生质体的分离和培养实验。
2．PEG溶液
30％(W／V)PEG (MW：6 000)
CaCl 2·2H20 10 mmol／L
KHzPO‘ 0．7 mmol／L
山梨醇 0．1 mo]门。
pH调至5．8—6．2
3．高pH高钙稀释液
CaClz·2H~O 0．1 mot／L
山梨醇 O．1 mol／L
Tris(缓冲液) 0．05 mol几
pH调至10．5
4．DPD培养基同植物原生质体的分离和培养实验。 ·
三、器材
同植物原生质体的分离与培养
实 验 方 法
所有操作均在超净工作台上进行。
1．原生质体的分离和收集。参看植物原生质体分离和培养实验。
2．将收集的两种不同材料的原生质体分别悬浮在0．16mol／L的CaCl2●2H：O(pH5．8～6．2)
中。原生质体密度调整为2X10‘／mi左右(用血细胞计数板统计原生质体密度)。
3．将两种原生质体悬液等量混合。
4‘用刻度吸管将混合的原生质体悬液滴在直径为60mm的平皿中，每皿滴7～8滴，每滴约
o．1ml。然后静置10min，使原生质体贴在皿底上，形成一薄层。(应有3—5个平皿的重复)。
5．用吸管将等量的PEG溶液缓慢地加在原生质体液滴上，再静置lo～15min。此时可取一个
平皿在倒置显微镜上观察原生质体间的粘连。
6．用刻度吸管向原生质体液滴慢慢地加入高pH、高钙稀释液。第一次加o．5ml，第2次lml，
第3、4次各2ml，每次之间间隔5rain。
7．将平皿稍微倾斜，吸去上清液，再缓缓加入4ml稀释液。5min后，再倾斜平皿，吸去上清液。
意吸去上清液时勿使原生质体漂浮起来。
1 8．用DPD培养基如上法换洗二次。
1 9．每平皿中加培养基2mi，轻轻摇动平皿。
1 10．用蜡膜密封平皿。置26℃下进行24h暗培养，然后转到弱光条件下培养。
I
I 实 验 结 果
1
1 1．在倒置显微镜下观察异源融合。在培养3天以内，可根据双亲原生质体的形态特征来鉴别
p核体。因为来自叶肉组织的原生质体具有明显绿色叶绿粒，而来自培养细胞的原生质体五色，但
阻浓密原生质丝，并可看到显示的核区。
1 2．统计异源融合的频率。
I
[ 作 业
[
[ 1．画出典型的异核体图。
[ 2，统计融合频率(异核体在其中所占比例)。
1 3．说明影响原生质体融合成功的因素有哪些。
[
1 参 考 文 献
I
! 1．李向辉，植物遗传操作技术．科学出版社，1988，177—184
2．孙勇如．遗传学手册．湖南科学技术出版社，1989．447～448
3．Kao K．N and M．R．Michayluk，A Method for High Frequency Intergeneric FusionO{Plant
Protoplasts．Planta，1974．115：355，”367
n．供体—受体原生质体融合与胞质杂种的形成
体细胞杂种有核杂种(nuclear hybrid)和胞质杂种(cybrid)之分。前者指双亲完整原生质体的
融合产物，后者是指一亲本的去核原生质体，(即胞质体cytoplast)与另一亲本完整原生质体融合
的产物。胞质杂种一般只具有一个亲本的细胞核，而具有两个亲本细胞质的遗传物质。胞质杂交可
用未转移细胞质基因所决定的遗传性状，如胞质雄性不育特征，抗除草剂特性，对某些抗生素的抗
性，以及一些与光合作用有关的特性，通过产生胞质杂种来转移这些特性具有明显的优点，因而在
遗传育种中具有特殊重要意义。供体—受体原生质体融合<donor—recipientprotoplastfusion)系统是
产生胞质杂种的有效方法。经过不断的改良，现已普遍采用双失活程序(Menczel，1984)，即将一个
亲本的原生质体经辐射处理使细胞核失活，来作为细胞质供体，另一亲本(受体)用代谢抑制物碘乙
酸盐类处理，使细胞质暂时失活。由于处理后的双亲原生质体均不能生长和分裂，而融合(用PEG
法或电融合均可)以后，由于生理互补效应，杂种细胞可以生长和持续分裂。因而在双失活处理的供
阵—受体原生质体融合系统中，不需要双亲具有选择标志，杂种即可被筛选出来。
实 验 目 的
初步掌握供体—受体原生质体融合产生胞质杂种的方法，了解胞质杂种产生的原理和意义。
实 验 用 品
一、材料
任何两种植物的分离原生质体。本实验可选用叶肉细胞原生质体作胞质供体，而用培养细胞的
原生质体为受体。
二、器材
用于分离、收集和原生质体融合实验的全套设备。参看本实验I。
能提供所需剂量的钴(‘*C。)源。
控温水浴锅
三、试剂
分离原生质体用的全部试剂。 ·
PEG法用于原生质体融合的全部试剂(参考本实验1)。
W，溶液：
CaCI：·HzO 125 mmol／L
NaCl 155 mmol／L
KCl 5 mmol／L
葡萄糖 5 mmol几
碘乙酸(2—iodoaceticacid)或碘乙酰胺(iodoacetamide)溶液：配在W，溶液中，其参考浓度为10
mmol几。
实 验 方 法
1．原生质体的分离和收集，参看植物原生质体的分离和培养实验。
2．将作为胞质供体的原生质体(叶肉组织原生质体)悬浮在W：溶液中，置于离心管中，密度调
整至10‘／ml。
3．60Co—7射线辐射使核失活：将盛原生质体的离心管放在60℃源设备中，达到给定剂量的时
间后取出。
辐射剂量的选择可通过实验来确定。一般在1～10krad之间，但对有些植物来说所用剂量可
高到100～300krad。
4．碘乙酸盐(10A)处理受体原生质体：将受体原生质体悬浮在适当浓度IOA溶液中，其密度
调整为10‘／ml左右。IOA溶液在1—30mmol／L之间，处理20～30min后，用W5溶液离心洗涤二
次，并悬浮在W；中，使密度调整为10s／mi。
S．用PEG方法融合(参考本实验1)。
6．培养融合处理后的原生质体。
实 验 结 果
1．核失活处理结果的观察：辐射处理后，将原生质体进行培养，并镜检受伤害迹象。若能有半
数左右的原生质体不能继续存活，则所用剂量可算核致死剂量。
2．IOA处理结果的观察：IOA作为代谢抑制物，可引起线粒体生理失活，但对核物质不影响。
处理之后的原生质体培养不能持续分裂，但可以存活数日，甚至有少数几次分裂。
3．胞质杂种细胞的观察：需和经处理的二亲本原生质体和正常亲本原生质体培养作比较。经
实验二十二 植物原生质体的分离和培养
实 验 目 的
掌握植物原生质体分离和培养的基本方法，井对培养的结果进行初步观察。
实 验 原 理
原生质体是除去细胞壁的裸露细胞。在适宜的培养条件下，分离的原生质体能合成新壁，进
行细胞分裂，并再生成完整植株。
植物的幼嫩叶片、子叶、下胚轴、未成熟果肉、花粉四分体、培养的愈伤组织和悬浮培养细
胞均可作为分离原生体的材料来源。
分离原生质体常采用酶解法。其原理是根据由纤维素酶、果胶酶和半纤维素酶配制而成的溶
液对细胞壁成分的降解作用，而使原生质体释放出来。原生质体的产率和活力与材料来源、生理
状态、酶液的组成、以及原生质体收集方法有关。酶液通常需要保持较高的渗透压，以使原生质
体在分离前细胞处于质壁分离状态，分离之后不致膨胀破裂。渗透剂常用甘露醇，山梨醇，葡萄
糖或蔗糖。酶液中还应含一定量的钙离子，来稳定原生质膜。游离出来的原生质体可用过筛—低速
离心法收集，用蔗糖漂浮法纯化，然后进行培养。
实 验 用 品
一、材料
1．烟草幼苗的叶片、或向日葵无菌苗的叶片、子叶或下胚轴等。
2．胡萝L根切片诱导的松软愈伤组织。
二、器材
超净工作台、台式离心机或手摇离心机、倒置显微镜、普通显微镜、培养室、灭菌锅、血细
胞计数板、石蜡膜带等。
细菌过滤器和o．45Fim的滤膜、300目不锈钢网筛及配套的小烧杯、解剖刀、尖头镊子、注射
器(5、lOml)和12号长针头、带皮头的刻度移液管(5、10mi，上部管口加棉塞)、培养皿(直
径6cm)或扁平培养瓶(50mi)、大培养皿、吸水纸等、使用前需经过灭菌。
三、试剂
1．?O％酒精。
2．0．1％升汞水溶液，并滴入少许TWeen 80。
3．灭菌蒸馏水。
4．0．16 m01／L和O．20 mol／LCaCl 2·2H20溶液，并加有0，1％MES(2—N—吗啉乙烷磺酸)，
pH5．8—6．2。
5．20跖和12％蔗糖溶液，pH5．8—6．2。
6．酶液A
纤维素酶(cellulase，Onozuka R—10 2％
果胶酶(pectlnase，Serva) l％
(若用国产EA3—867纤维素酶，则果胶酶可省去。)
甘露醇 O．6 m01／L
CaCl 2·2H，O 0．05 m01／I。
ME5 0．1％
pH 5．8～6．2
7．酶液B
纤维素酶(()nozuka R—10) 2％
离析酶(Macerozyrlle R—10) l％
半纤维素酶(hemlcellulase，Slgma) 0．2％
甘露醇 0．4 m01／L
CaCl 2·2H20 0．05 moI／L
MES 0．1％
pH 5．8—6．2
8，DPD培养基(表22—1)
9．C81V培养基(表22—2)
10．o．1％酚藏花红(配在o．4mol／L甘露醇中)。
11．o．01％荧光增白剂(配在o．3mol／L甘露醇中)。
(3、4、5用高压灭菌，6、7、8、9用过滤灭菌。)
实 验 方 法
一、叶肉原生质体的分离和培养
1．取充分展开的叶片，用自来水冲洗干净。<以下步骤均在超净台上进行)。
2．将叶片在o．1％升汞溶液中浸泡灭菌10min，中间摇动几次。取出后用无菌蒸馏水漂洗5
次。 ·
3．将叶片移入大培养皿中，用吸水纸吸去上面的水珠。然后将叶背面朝卜，小心用镊子撕去下
表皮。
4，将撕去下表皮后的叶片放进预先放有酶液A的培养皿或带盖三角瓶中，每10mi酶液约放
28叶片。若叶片不易撕下下表皮，可用锋利的解剖刀将叶片切成约o．5mm宽的小条，放入酶液。
5．将培养皿用石蜡膜带封口，在28C条件下保温3～6h，中间轻轻摇动2～3次。在倒置显微
镜下检查，直到产生足够量的原生质体。
6．将酶解后的原生质体悬浮液用不锈钢网筛过滤到小烧杯中，以除去未酶解完全的组织。
7．将滤液分装在刻度离心管中，用600r／mill的速度离心5rain，使原生质体沉淀—F来。
8．用移液管吸去上清液。将沉淀的原生质体悬浮在2mi o．2 mol／L的CaCl2●2H20巾。
9．用注射器(装上长针头)向离心管底部缓缓注入20％蔗糖溶液6mi，在600r／rain‘／离心
5min。此步完成后，在两相溶液的界面之间将出现—层纯净的完整原生质体带，杂质，碎片将沉到
管底。
lo．用注射器吸出管底杂质和下部的蔗糖溶液及上部的CaCl：·2HzO溶液。
11．离心管中留下的纯净原生质体用8mi o．2mol／LCaCI：·2H20悬浮。离心5min，吸去上清
液。再用培养基如法洗涤一次。
12．将收集的原生质体悬浮在适量DPD培养基中，将其密度调蹩到5X10‘／m1左右<可用血
细胞计数板统计原生质体的密度)。
13．用带皮头的刻度移液管将原生质体悬液分装在培养皿中，每皿放2mi。
14．用石蜡膜带封口。设26℃左右条件下进行暗培养。
二、愈伤组织原生质体的分离和培养
1．胡萝，＼松软愈伤组织的诱导和保存
(1)取田间生长两个月左右的植株的根，用自来水冲洗干净。
(2)在70％酒精中浸泡2mm，取出后放在o．1％升汞溶液中浸泡10min。再用灭菌蒸馏水换洗
5次。
(以下操作在超净工作台上进行)
(3)在大培养皿中用解剖刀切取根中央部分，井切成3～5mm厚的横切片。
(4)将切片摆放在含2mg／L 2，4—D、O．2mg几激动素和500rug／L水解酪蛋白的MS培养基
卜。在26(：左右条件下进行暗培养，诱导愈伤组织。
(5)培养2周以后，用镊子将外植体周围形成的愈伤组织取下转移到新鲜培养基上。
(6)连续继代培养多次，每三周转移一次。待愈伤组织成为松软状态便可用于分离原生质体。
2．取转代培养一周左右，井处于旺盛生长期的愈伤组织，直接放在酶液B中，每10mi酶液放
2z左右。在室温下保温过夜，或26℃下保温6h以上，直到产生足够量的原生质体。
3．将酶解后的原生质体悬液用不锈钢网筛过滤，除去未完全消化的组织。
4．向过滤液中加入等体积的o．16 mol儿CaCl2●2H20溶液，混合之后转移到带盖离心管中。
在600r／rnln速度F离心5～10min，使原生质体充分沉淀。
l吸去上清液，将沉淀的原生质体悬浮在2ml o．16mol／LCaCl2●2H：O溶液中。
6．用注射器向离心管底部缓缓注入12％蔗糖溶液6ml，然后离心5—10rain。两相溶液界面间
应出现纯净原生质体带，管底出现杂质沉淀。
7．将注射器插入管底，吸出沉淀的杂质。并吸出下部蔗糖液及上部钙液。
8．用o．16mol／LCaCI：·2H20悬浮，离心一次，再用C81V培养基如法洗涤一次。
9，用C81V培养基培养，其操作同叶片原生质体培养。
三、培养结果的观察
1．活力检查
凡具活力的原生质体均呈现圆球形，在显微镜下可观察到明显的胞质环流运动。在DL肉原生质
体中由于叶绿体的阻挡，看不清胞质环流。可取一滴原生质体悬液放在载玻片上，加一滴o．1％酚
藏花红溶液，凡生活的原生质体均不着色，而死去的原生质体立即着染成红色。
2．细胞壁再生的观察
培养24—48h后，大部分原生质体己再生新壁。并且体积增大，变成椭圆形。可用以下方法鉴
别细胞壁的再生。
(1)取一滴原生质体培养悬液放在载玻片上，加一滴高浓度(25％)蔗糖溶液，有壁的细胞将发
生质壁分离。
(2)取一滴原生质体培养悬液放在载玻片上，加—滴o．ol％荧光增白剂溶液。在荧光显微镜
下，当用366nm波长的紫外光照射时，细胞壁将发黄绿色荧光。
3。细胞分裂的观察
培养4天以后，将出现第一·次分裂，可在倒置显微镜下观察。在培养8～lQ天后，应统计分裂频
率，即出现分裂的原生质体占成活原生质体的百分率。
一般在细胞团形成后(大约在培养的¨～20天)，应向培养瓶中补加渗透剂减半的新鲜培养
基，以促进细胞团的增殖。待小愈伤组织形成后，转移到固体培养基上，进行植株分化的条件试验。
思 考 题
1‘酶解液以及原生质体起始培养基中，为何要保持较高渗透压?
2，为何在培养一段时间后，需向培养瓶补加降低渗透压的新鲜培养基?
3．如何判断分离原生质体的活力和新壁再生?
实验二十三 细胞电融合方法
实 验 目 的
动物的游离细胞以及植物或微生物去壁后的原生质体，在电刺激下可进行细胞融合，且融合率
高、无毒性、操作简便及融合后的细胞继续培养成活率高等特点，是细胞工程手段的又一进展。
本实验使学生在了解电融合原理的基础上，学会掌握各种细胞悬液的制备及电融合过程的操
作方法。
实 验 原 理
将制备的游离细胞或原生质体，置于电融合室中，在高频交流电场的作用下，细胞被极化，成为
偶极子，造成细胞之间相互连接，如果施加的高频交流电压(即正弦波的P—P值)过高或作用时间
过长，则细胞连接成串珠状，应适当控制以上条件，尽量使两细胞处于点接触状态；然后施加方波脉
冲予以刺激，由于电脉冲的瞬间作用，可击破两细胞接触点部位的质膜，此时质膜的脂类分子发生
重组，同时由于细胞表面的张力作用，使两细胞融合逐步完成。
实 验 用 品
一、仪器及器材
JCF—l型细胞电融合仪、细胞融合池、苷通离心机、倒置显微镜(或研究用显微镜)、刻度离心
管、不锈钢网(200目)、镊子、解剖刀、解剖剪、注射器、毛细吸管、刻度吸管、小烧杯(10m1)、滴瓶、培
养皿、毛笔等。
二、药品
甘露醇、蔗糖、氯化钠、纤维素酶(Onozura R—10)、离析酶(Macerozyme R—10)、蜗牛酶(中科院
生物物理所产)、CaCl2●2H：O、MES(2—N—吗啉乙烷磺酸)、葡聚糖硫酸钾等。
三、材料
植物材料：甜菜、烟草或菠菜等。
动物材料：鸡或人等的红细胞、白细胞、骨髓瘤或腹水瘤等各种瘤细胞。
实 验 方 法
如果只观察细胞的融合过程和掌握电融合方法，奉实验所有步骤均可在有菌条件下操作。
一、植物原生质体的制备
1．取幼嫩的叶片或充分展开的子叶，先用水洗净并吸去表面的水份，再置人小烧杯中将叶片
剪成碎块。
2．将碎块放人1．5％纤维素酶、0．3％离析酶、o．5％蜗牛酶、o．6 mol儿甘霹醇、5 mmol／L(：a—
O：·2H：O、MES 3 mmol／T。、葡聚糖硫酸钾0，3％，pH5．6的酶液中，置于25C暗处游离5h(或
“C过夜)，游离时间结束时，可镜检原生质体分离情况，如果大多数原生质体还未从组织中释放出
来，需增加在酶液中的游离时间。新出厂的酶在5h内一般就可将原生质体游离出来，但因药品质量
问题或存放时间过长，致使酶活力下降，要适当延长酶解时间。
3．将酶解出来的原生质体用不锈钢网过滤，以除去未被酶解的组织，过滤后再用o．6M的蔗
糖冲洗网上残留的原生质体，然后以200 r／rnln进行离心处理5min。
4．用带长针头的注射器吸去上清液，然后加入1～1．5ml O．2 mol／L的CaCl2●2H：O，将原生
质体混匀。
5．用细头滴管或带长针头的注射器向管底慢慢注人20％的蔗糖液，再以300 r／mln离心
10min，此时可见到在上下两液体间的界面处有一层乳白质的带状物，即为纯净的原生质体，其破
碎的部份及其它杂质都沉降到离心管底部，用长针头注射器或毛细吸管分别吸去管底的杂质和蔗
糖液以及原生质体上层的CaCI：液。
6．向离心管加入2mi 0，2mol／L的CaCIz·2H20溶液，混匀后以300r／mln离心5min，去掉
上清液，最后用o．6 mol／L的甘露醇溶液稀释并调整每毫升含5X104个原生质体。
二、动物细胞的制备
用灭菌的注射器先吸人ALsver液(葡萄糖2．05g，枸橼酸钠0．88，NaCl 0．42g，加重蒸水至
100mi)1ml，再从鸡的翼下静脉取血0．5～lml，取出后放人刻度离心管中，再加人2～3ml ALsver
液，使总量为4～5mi，混匀并封口，置于4；C冰箱内可供一周内使用，实验时取贮备的鸡血细胞
lml，加入4m10．85％生理盐水，混匀后以1 200 r／mln离心5min，去上清液后，再加入0．6 mol／L
的甘露醇液(或o．6 mol／L蔗糖溶液)混匀后以上述离心条件洗涤两次，最后用o．6 mol／L的甘露
醇液将鸡细胞稀释并调整成每毫升含2X10‘个。
如采用传代培养的骨髓瘤或腹水瘤细胞，可先用o，9％的生理盐水洗涤两次，离心速度为800
～l 000 r／mm，每次5min，再用0．6 mol／L的甘露醇或蔗糖液洗涤两次，每次600～800 r／Illin，离
心5min，最后用甘露醇调整成每毫升含瘤细胞1X10’个。
三、细胞电融合方法
1．仪器结构和使用方法
JCF—型细胞电融合仪的各项技术参数是通过大量的融合实验数据，并参考岛津公司(日)SSH
型电融合装置的参数值而设计的(图23—1)。当打开电源，指示灯亮，并拨通输出开关和正弦输出开
关，再选择和按下正弦频率按键(共分为o．6、o．8、1、1．3、1．5MHz五档)，此时将输出电缆与示波
器相接，在示波器上即出现高频正弦波形，当左右旋转正弦幅度旋钮，则正弦电压的P—P值，也随
之降低和升高，如果将输出电缆与电融合室相接，则细胞相互连接。此时再旋动正弦幅度(即正弦电
压)旋扭，则仪器上电压表指针随之升高和降低。如果币弦电压过高，则细胞连接速度加快，并呈串
珠状，不利于两细胞融合。
将正弦输出开关搬至“复合输出”档，根据所需功率大小选择复合输出I或n档，I档为低功
率，1档为高功率；再根据实验要求，选择并按下你所需要的“脉冲宽度”按键(分lms、o．2ms、
0．1ms、10p-s、1Ps五档)和“脉冲幅度”按键(分50V、100V、150V、200V、250V五档)，还配有脉冲幅
度旋扭(细调)，调整范围o～50V，可使每档增值50V。
施加脉冲刺激可分为“自控”和“手控”两档，当使用“自控”输出脉冲时，先将开关搬向自控档，
然后根据需要选择并按下“脉冲频率按键(分为2s1次及每秒1次、2次、5次、10次共五档)，即可
自动发送电脉冲；如果将开关搬至“手控”档，需按动“手控”按扭，每按动一次发送一个脉冲。无论自
控或手控输出，每个脉冲输出都伴有报鸣音响，将输出端与脉冲示波器连接，则可观察到由脉冲宽
度、幅度及脉冲间隔所构成的示波图像，当改变以上有关参数值时，其图像亦发生变化；把开关搬向
反向，则产生负脉冲，当脉宽和幅度等值不变时，其图像与正脉冲波形相同，但方向相反，上下对称。
将电缆输出端与电融合室的两电极相接，并按上述要求发送一定的方波脉冲，细胞受到电刺激后，
可产生融合。
2．电融合操作
植物原生质体融合
(1)开启电源，关闭“输出开关”，将开关搬向正弦输出档，此时可根据实验需要，将正弦频率选
择在1一1．3MHz，脉冲宽度为0．1ms或10gs，脉冲幅度为150V，脉冲频率为1次／s，并依次按下各
标定按键，最后调整正弦电压(即正弦幅度)旋扭，使电压表处于5—10V处。
(2)将电融合池内两电极距离调整成1～1．5mm，并用毛细吸管吸取制备的原生质体悬液约
o．1一o．2ml置融合池中，盖上盖片，注意在融合池中，特别是在两电极间不能容有气泡。
(3)将融合池置于显微镜载物台上，并将两电极的输出端与仪器的输出电缆接通，然后用低倍
镜(10X10)找出融合室中央两电极间的焦面，此时可观察到原生质体呈平均分布状态，互不接触。
(4)打开输出开关，原生质体在高频交流电场作用下，迅速按电极垂直方向排列，此时应控制正
弦电压大小，如果原生质体接触缓慢，可适当提高正弦电压；如果原生质体间接触过快，应立即降低
电压，否则相互接触的原生质体很快会连接成串珠状。
(5)选择两个相互接触的原生质体，并转向高倍镜(10X 40)观察(图23-2—A)，将开关搬向复合
输出，然后将控制开关搬向“自控”档，此时会按给定的频率发出连续脉冲，每一脉冲都伴有报鸣音
响，两原生质体每接受一次脉冲刺激后，在视野中可观察到产生轻微颤动，当连续发送5～10个脉
冲刺激后，约30s内可观察到两原生质体接触点处的质膜被击破穿，并开始融合(图23—2—B)，经过
?至lo几分钟，原生质体逐步融合(图23—2—E)，当融合的两细胞变成一个圆球形，融合过程结束
(图23—2—F)，如果此时再观察电融合室中两电极间其它部位，由于原生质体大小的不同决定其表
面张力及其膜特性的差异，可观察到有的已融合完毕，有的正在融合之中，即两原生质体有的呈亚
铃状，有的早氏圆形或卯圆形
动物细胞融合的融合方法及条件基本同上，但困动物细胞的膜结构(特别是红细胞膜)比原生
质体具有更大的电刺激耐受性，因此要造成细胞接触点处的膜击穿，需要适当加大脉冲电压、脉冲
宽度或增加刺激次数，通常在做动物细融合时，当电极距离在1—1，5mm范围，可将脉冲电压调到
200～250V，脉冲宽度调至o．1ms，电刺激次数为10～15次；如果以鸡红细胞为融合材料，当施加
以上电刺激参数后，可在显微镜下观察到很多的双核体细胞。
附一 影响细胞电融合的因素
一、用于供原生质体或动物细胞悬浮的介质，必须满足两个条件：一是为了保持细胞的生物活
性，使融合后的细胞能继续存活，并通过培养能继续分裂和分化，其介质要求与细胞本身具有等渗
性；二是为了保证融合之前所施加的各项电参数充分发挥作用，其介质应具有高纯度的非离子溶
液，如果在溶液中存在Na+、K’、Ca”等金属离子或Cl—离子，将使介质的导电性增加，当施加脉冲
波刺激时，椐报导，其总能量Q将通过离子的传导作用损失80％以上，而直接通过细胞，用I：击穿
膜接触点使其细胞融合的能量仅占10％～20％，当有离子存在并使电脉冲能量高度损失的情况
下，将不能保证细胞进行融合。
在介质中有金屑离子存在，当施加高频正弦波电场时，不能将细胞极化成偶极子，从而不能使
细胞间相互接触和连接，更谈不上细胞间相互融合。
为了解决以上存在的问题，一是采用高纯度的蒸馏水(三蒸水或四蒸水)来配制介质，二是选用
适当的非电介质溶质，如甘露醇、山梨醇或蔗糖等来配制供细胞悬浮的等渗溶液，另外，在清洗电融
合室时，也要以高纯度的蒸馏水用毛笔擦净。
二、在做原生质体融合时，其原生质体游离的状况对完成细胞融合至关重要，游离出好的原生
质体应具有折光性强，呈饱满的球状体，质膜与细胞质无明显界限，此种原生质体在电刺激下很易
融合。当观察到原生质体不呈现球状体，且折光性差，呈暗褐色，细胞的质膜部位有—一层较厚的膜状
物，这与游离过程脱壁不净有关，此种原生质体在电刺激下很难产生融合，如果继续加大各项电参
数刺激，则细胞被击破。
三、根据近几年国外报导，在细胞悬液中加入链霉蛋白酶E(pronase E)，可改变细胞膜结构，
井增强膜活性，按每毫升l～3mg配制，能使细胞融合率增高，我们利用o．6 mol／I。的甘露醇液配
制成每毫升含pronase E lmg做为细胞悬液，然后按每毫升含鸡红细胞2X10s个，在37C下温育
30min，然后按原定各项电参数进行电融合，其融合率比未被酶处理的大幅度提高。
另外，在应用化学融合剂PEG进行细胞融合时，通常以GXN液作为稀释剂，一·般使用浓度都
在50％左右，对细胞的毒性作用较大，虽然在融合后马上进行洗涤，但融合后经过培养阶段，融合
细胞的存活率仍熬很低。我们的实验证明，如果以o．6mol／L的甘露醇作溶剂，配制成6％一8％的
PEG(Mw＝4 000)作为细胞悬液，再按上述条件进行电融合实验，其融合速度和融合率与不加
PEG相比都有提高。