分子免疫学 实验报告（一）2005.12.28
小鼠巨噬细胞功能的检测
伍国强
（兰州大学草业学院 兰州 730020）
摘要：本实验用CFA免疫小鼠后，检测小鼠腹腔巨噬细胞的数目以及用中性红检测巨噬细胞的吞噬能力。结果表明，免疫小鼠的腹腔巨噬细胞的数目和吞噬能力均有所提高。
关键词：巨噬细胞；功能；检测
1 前言
巨噬细胞是一种多功能免疫细胞,在机体的特异性和非特异性免疫反应中发挥重要功能。主要作用有：（1）吞噬杀伤作用：直接吞噬、调理吞噬作用。（2）抗原提呈作用：即外来的抗原性异物通过巨噬细胞的捕获、加工和处理后，与胞内合成的MHC-1/II类分子形成抗原肽－MHC分子复合物，并被呈递到细胞膜表面，被TCR识别的作用。具有此作用的细胞叫抗原呈递细胞（antigen presenting cell,APC)。此外，巨噬细胞表面还表达多种共刺激分子，如B7、ICAM-1、LFA-1,3等分别与T细胞上的CD28、LFA -1(CD11)、LFA-2(CD2)等相互作用，为T细胞的活化提供第二信号。（3）抗肿瘤作用：M?被某些细胞因子如IFN-?激活后能有效杀伤肿瘤等靶细胞，其吞噬杀菌能力也显著提高。（4）分泌生物活性介质，产生免疫应答和其它免疫效应：如IL-1,12、IFN、TNF、PGE等;以及某些补体成份和凝血因子、组织修复因子等。为了检测巨噬细胞的吞噬功能，我们用CFA免疫的小白鼠作为实验材料检测其腹腔巨噬细胞吞噬中性红的作用。
2 材料与方法
2．1 材料
2．1．1 药品：生理盐水、0.6%环磷酰胺、Hank’s溶液、1640培养基、细胞裂解液、中性红等。
2．1．2 仪器：血球计数板、细胞培养箱、分光光度计等。
2．1．3 动物：小白鼠2只，由兰大医学院动物实验中心提供。
2.2、方法
2．2．1 小鼠腹腔巨噬细胞制备 取小白鼠2只，分为对照组和实验组，对照组注射0.1ml生理盐水，试验组注射0.1mlcFA。48小时后，小鼠眼眶放血，断颈处死。腹腔注射3ml预冷的生理盐水。吸取腹腔渗出液5ml离心管（冰浴）。1600rpm离心10分钟，弃上清，4℃生理盐水定容至5ml。血球计数板镜下巨噬细胞计数。用生理盐水
6调mΦ浓度为1×10，取4ml 1600rpm 离心10分钟，弃上清加4ml 1640定悬。将mΦ加
入24孔板，每组4孔，每孔1ml。37℃，5%CO2细胞培养箱贴壁培养纯化2小时。
2．2．2 巨噬细胞吞噬中性红试验 将贴壁纯化好的mΦ弃1640培养液，对照孔加0.5ml生理盐水，其余每孔加0.5ml0.075%中性红,继续培养1小时。倾去上清液,用温PBS 洗细胞3 次,每孔加入细胞溶解液(为体积分数50 %的乙酸和体积分数50 %的无水乙醇) 2ml ,室温下放置30分钟,待细胞溶解后,即用分光光度计测定OD值。以OD 值表示巨噬细胞功能的强弱。
3 结果与讨论 表：mΦ的浓度及吸光值
mΦ细胞mΦ浓度 0D值 个数 （个/ml)
对照组 256 6.4×100.252
试验组 2176 5.44×106 0.283
3．1 免疫小鼠腹腔巨噬细胞浓度 从上表可以看出，用cFA免疫的小鼠腹腔巨噬 1
分子免疫学 实验报告（一）2005.12.28 细胞浓度较对照大，说明了CFA可以刺激巨噬细胞的大量产生。
3．2 免疫小鼠腹腔巨噬细胞的吞噬功能增 从上表可以看出，试验组的OD值较对照高，说明了免疫小鼠的腹腔巨噬细胞的吞噬能力增强了。
2
第二篇：巨噬细胞功能检测
单核－巨噬细胞吞噬功能测定
单核－巨噬细胞在机体免疫反应中起着重要作用，因此，检测单核－巨噬细胞功能对于了解机体的免疫功能状态具有重要意义。
小鼠巨噬细胞吞噬功能试验（体外法）
1、原理
巨噬细胞具有吞噬异物的功能，将巨噬细胞与被吞噬物(鸡红细胞、白色念珠菌、白色葡萄球菌等)共同温育，染色，在油镜下计数吞噬异物的巨噬细胞的吞噬百分率和吞噬指数，以此判断巨噬细胞的吞噬功能，从而评价机体的免疫状态。
2、方法
(1)．小鼠巨噬细胞制备 实验前三天每只小鼠腹腔注射1％可溶性淀粉1 ml。实验时眼球放血、断椎处死小鼠，碘酒、洒精消毒皮肤，剪开腹部皮肤，暴露腹膜，用镊子夹起腹膜剪开一小口(注意避开血管)用生理盐水(或1640)灌注腹腔，收集腹腔液于试管中(约4 ml)，1500 r/min，离心10 min，去上清，沉积细胞用生理盐水(或1640)洗二次，离心转速、时间同上。最后沉积细胞用含10％小牛血清1640配成适当
浓度备用(1~2×106／ml)。
(2)被吞噬物的制备
1）．鸡红细胞制备 从鸡翼下抽取静脉血，加入5倍量Alsever液(2.05 g葡萄糖，0.42 g NaCl，0.8 g枸橼酸钠5H2O、0.55 g枸椽酸，加双蒸水到100 ml，加热溶解后过滤分装，8磅高压灭菌，4℃保存)，置4℃可以保存1个月。用前取适量鸡红细胞悬液，用PBS洗涤二次后配成1％的浓度备用。
2）．白色念珠菌制备 将白色念珠菌接种于沙氏平皿培养基中，培养48小时，收集菌，用适量生理盐水配成悬液，100℃，煮沸30 min灭活，离心去掉上清，再用1％美兰染色30 min，用生理盐水洗涤二次，用生理盐水配成1×108／ml菌悬液，4℃冰箱保存备用。
3、操作
取巨噬细胞0.5 ml加1％鸡红细胞或l×l08／ml白色念珠菌悬液0.5ml，置37℃温育30min。取2滴混合液置玻片上加盖玻片，在高倍镜下观察计数，或离心1000r／min,10min，取细胞沉淀混悬液制成涂片，甲醇固定，姬姆萨染色、油镜观察计数。
吞噬率％=(吞噬鸡红细胞的巨噬细胞数/100个巨噬细胞)×100％
吞噬指数％=100个巨噬细胞中吞噬鸡红细胞总数/100个巨噬细胞 **(吞噬指数式中巨噬细胞为阳性吞噬细胞)
（三）小鼠巨噬细胞吞噬功能试验（体内法）
[原理]
巨噬细胞具有吞噬大颗粒异物的特性，通常选用鸡红细胞作为吞噬颗粒，将其注入小鼠腹腔中，腹腔中巨噬细胞则将鸡红细胞吞入。取小鼠腹腔液涂片、染色后可见鸡红细胞被吞噬的现象，计数100个吞噬细胞中吞噬鸡红细胞的细胞数可判断其吞噬功能。
[材料]
1．1％鸡红细胞悬液。
2．小白鼠。
3．6％可溶性淀粉肉汤 肉汤培养液100 m1加入可溶性淀粉6 g，混匀后煮沸灭菌
4．瑞氏染液。
5．解剖小器械一套、无菌注射器、显微镜等。
[方法]
1．试验前3天，于小白鼠腹腔内注射6％可溶性淀粉肉汤1 ml。
2．试验当天于每只小鼠腹腔内注射0.5 ml 1％鸡红细胞悬液，并轻揉腹部。
3. 注射后30 min，将小鼠处死、取腹腔液涂片并行瑞氏染色。
4．油镜观察涂片。
[结果观察]
镜下可见吞噬细胞细胞核呈蓝色，被吞噬的鸡红细胞胞浆呈红色，而核则染成蓝色(鸡红细胞有细胞核)。计数100个吞噬细胞，并计算吞噬阳性细胞的百分率。
[注意事项]
1．小白鼠腹腔注射时注意不要刺伤内脏。
2．如小鼠腹腔液过少时，可注入适量的生理盐水。
3．被吞噬的鸡红细胞时间过长可被消化，时间过短则尚未被吞噬，因此须掌握好时间。