《生物技术实验》教学大纲
课程编码: B08000037 实验学时:18 实验学分:1
一、本实验课的性质、任务与目的
本课程是一门专业基础实验课，综合了生物化学技术、微生物技术、细胞工程、生化工程、微生物工程等方面的实验内容，在注重专业基础性和可操作性的前提下突出先进性和系统性，加强教学内容的选择性。通过本课程的学习和实践，要求学生掌握细胞工程技术、微生物学技术以及相关领域的实验原理和方法，提高分析问题和解决问题的能力，开拓创新能力，为从事生物技术以及相关领域的科学研究工作打下基础。
二、实验基本要求
调动教学双方的主观能动性，组织学生参加实验准备、设计具体实验方案，适时组织学生外出自取实验材料，让学生和教师共同讨论理论和实验问题。成绩评定要把学生的实际动手能力和创新精神放在重要地位。实行课堂讲授指导辅以多媒体演示。指导学生分析总结实验结果，学会正确书写科学论文。
本课程可根据实验设备等具体情况，安排下列实验中的6-8个实验，每个实验3学时。
三、实验项目与要求：
注：1、项目要求：必修、选修、其他；2、项目类型：演示、操作、模拟；3、项目性质：验证、综合、设计、研究。
四、成绩考核方式及评分标准
平时实验报告50％，期未实验操作考试25％，期未实验理论考试25%。
五、主要实验教材（指导书）及参考用书
生物技术实验与仪器操作指南，李多伟等编 西北大学出版社，1996年
细胞生物学实验 杨汉民 主编 高等教育出版社 1997年7月第二版
撰稿人：王沛政 审稿人： 系主管领导：
系办盖章：
年 月 日
试验一、PCR基本原理和方法
试验目的: 了解PCR技术的基本原理，设备，药品，过程。
试验内容：
RAPD是随机扩增多态性DNA（Random Amplification Polymorphic DNA）的英文缩写,是Williams等人(1990)发展起来的一种新型遗传标记，尽管这一技术比较年轻，但由于其独特的检测DNA多态性的方式即极快速、简捷、高效等优点，使得RAPD技术已渗透于有关基因研究的各个领域。RAPD是建立于PCR基础之上的，利用随机的脱氧核节酸序列作引物(一般9~10碱基对)，对所研究的基因组DNA体外扩增，扩增产物经电泳分离染色后，来检测其多态性，这些扩增DNA片段多态性便反映了基因组相应区域的DNA多态性。RAPD标记特点是：（1）RAPD扩增引物没有物种的限制，一套引物可用于不同物种基因组分析;（2）RAPD扩增引物没有数量上限制，可以囊括基因组中所有位点;（3）RAPD技术简捷方便，可进行大量样品的筛选。
RAPD是指随机扩增的多态性DNA，它以一个10碱基的任意序列的寡核苷酸片段为引物在未知序列的基因组DNA上进行随机的PCR扩增。
RAPD反应并不要求特别纯的DNA摸板，重要的是在每一个反应中DNA的终浓度，一般认为在每个反应中，5-500ng范围的摸板能提供最好的结果。最佳的模板浓度范围取决于研究的类群与模板的纯度，在DNA模板不很纯的时候下，宁可用使用有效浓度范围内的最低限度，使抑制聚合酶活性的因子的影响因素降到最小。PCR（Polymerase Chain Reaction）即聚合酶链式反应，是指在DNA聚合酶催化下，以母链DNA为模板，以特定引物为延伸起点，通过变性、退火、延伸等步骤，体外复制出与母链模板DNA互补的子链DNA的过程。是一项DNA体外合成放大技术，能快速特异地在体外扩增任何目的DNA。可用于基因分离克隆，序列分析，基因表达调控，基因多态性研究等许多方面。
PCR技术的基本原理
一.PCR反应成分：
1.模板DNA；2.引物；3.四种脱氧核糖核苷酸；
4.DNA聚合酶；5.反应缓冲液、Mg2+等。
二.PCR反应基本步骤：
1.变性：高温使双链DNA解离形成单链（94℃，30s）。
2.退火：低温下，引物与模板DNA互补区结合（55℃，30s）。
3.延伸：中温延伸。DNA聚合酶催化以引物为起始点的DNA链延伸反应（70～72℃，30～60s）
1.变性(denaturation)：通过加热使模板DNA的双链之间的氢键断裂，双链分开而成单链的过程。
2.退火(annealling)：当温度降低时，引物与模板DNA中互补区域结合成杂交分子。
3.延伸(extension)：在DNA聚合酶、dNTPs、 Mg2+存在下，DNA聚合酶催化引物按5’→3’方向延伸，合成出与模板DNA链互补的DNA子链。
以上述三个步骤为一个循环，每一循环的产物均可作为下一个循环的模板，经过n次循环后，目的DNA以2n的形式增加。
总反应体系为25 μl，随机引物使用S80(ACTTCGCCAC)和S90（AGGGCCGTCT）两种。PCR扩增程序为94℃预变性3min；94℃变性50 s；38℃退火1 min；72延伸2 min；40个循环；72延伸5 min后4℃保存。在25 μl PCR反应终产物中，吸取10 μl反应液与2 μl 6×加样缓冲液混合，在1.8%琼脂糖凝胶中电泳，电泳缓冲液为0.5×TBE，电泳电场强度为5V/cm，电泳结束后把凝胶浸泡在0.5 μg·μl-1 溴化乙锭(EB)溶液里，染色10～20 min，凝胶成像系统下观察拍照。
需要购买的试剂和耗材：
1ml的枪头1包（500个）；200ul枪头1包（1000个）；10ul枪头2包（2000个）；1.5ml离心管1包（500个）200ulPCR反应管（96孔PCR仪用）。
RAPD反应用：四种脱氧核糖核苷酸（10管）；高温DNA聚合酶（TAQ）（10管，5单位/管)
合成RAPD引物10条（任意适合植物的，5单位/管)）
准备仪器： 移液枪10把。离心机1台，试剂瓶20个，PCR扩增仪1台。蒸馏水1桶。水浴锅1台。
试验三、DNA提取
一、目的：了解DNA提取过程和相关试剂。
二、试验内容和过程：
（1）取适量叶片放入离心管并加入提取缓冲液，电钻研磨至糊状。
（2）上述液态样品在4-12℃，10000rpm离心15min。
（3）弃上清，于沉淀中加入600µL，65℃预热过的裂解缓冲液，并用牙签混匀。
（4）65℃温浴40min。
（5）加入等体积的氯仿:异戊醇（24:1）混合液，翻转50次左右，4℃将上清液转入新的离心管中，加入2/3体积的预冷的异丙醇，慢慢翻转不可用力过猛，直到析出絮状DNA沉淀，静置10min，10000rpm，离心15min。
（6）倒掉上清液，加600µL 70%的乙醇清洗，然后风干DNA，可见小团DNA晶体物。
（7）加50µL TE缓冲液4℃下溶解DNA小团，最后保存于-20℃备用。
裂解缓冲液配制
注：室温可保存1-2周，用前加β-Me（巯基乙醇），CTAB溶解要数小时。
配制方法：
1M Tris.HCl 方法：121Tris+水1L （加大约100 ml浓盐酸，调PH为8.0）
0.5 mM Na.EDTA 方法： 186.1gNa.EDTA水1L （加大约50 mlNaOH10M，调PH为8.0）
三、总结与讨论
1、实验中为什么要把实验材料充分切碎？
3、乙醇的作用是什么？
试剂准备：
1ml的枪头1包（500个）；200ul枪头1包（1000个）；1.5ml离心管1包（500个）。
准备仪器： 移液枪10把。离心机1台，试剂瓶20个，PCR扩增仪1台。蒸馏水1桶。水浴锅1台。
试验四、DNA 的琼脂糖凝胶电泳
一、实验目的
（1） 学习琼脂糖凝胶电泳的基本原理；
（2） 掌握使用水平式电泳仪的方法；
（3） 学习在含有甲醛的凝胶上进行RNA电泳的方法。
二、实验原理
琼脂糖凝胶电泳是基因工程实验室中分离鉴定核酸的常规方法。核酸是两性电解质，其等电点为pH2-2.5，在常规的电泳缓冲液中（pH约8.5），核酸分子带负电荷，在电场中向正极移动。核酸分子在琼脂糖凝胶中泳动时，具有电荷效应和分子筛效应，但主要为分子筛效应。因此，核酸分子的迁移率由下列几种因素决定：
（1）DNA的分子大小。线状双链DNA分子在一定浓度琼脂糖凝胶中的迁移速率与DNA分子量对数成反比，分子越大则所受阻力越大，也越难于在凝胶孔隙中移动，因而迁移得越慢。
（2）DNA分子的构象。当DNA分子处于不同构象时,它在电场中移动距离不仅和分子量有关,还和它本身构象有关。相同分子量的线状、开环和超螺旋质粒DNA在琼脂糖凝胶中移动的速度是不一样的，超螺旋DNA移动得最快，而开环状DNA移动最慢。如在电泳鉴定质粒纯度时发现凝胶上有数条DNA带难以确定是质粒DNA不同构象引起还是因为含有其他DNA引起时，可从琼脂糖凝胶上将DNA带逐个回收，用同一种限制性内切酶分别水解，然后电泳，如在凝胶上出现相同的DNA图谱，则为同一种DNA。
（3）电源电压。在低电压时，线状DNA片段的迁移速率与所加电压成正比。但是随着电场强度的增加，不同分子量的DNA片段的迁移率将以不同的幅度增长，片段越大，因场强升高引起的迁移率升高幅度也越大，因此电压增加，琼脂糖凝胶的有效分离范围将缩小。要使大于2kb 的DNA 片段的分辨率达到最大，所加电压不得超过5v/cm。
（4）离子强度影响。电泳缓冲液的组成及其离子强度影响DNA的电泳迁移率。在没有离子存在时（如误用蒸馏水配制凝胶），电导率最小，DNA几乎不移动；在高离子强度的缓冲液中（如误加10×电泳缓冲液），则电导很高并明显产热，严重时会引起凝胶熔化或DNA变性。
溴化乙啶(Ethidium bromide, EB)（1） 能插入DNA分子中形成复合物，在波长为254nm紫外光照射下EB能发射荧光，而且荧光的强度正比于核酸的含量，如将已知浓度的标准样品作电泳对照，就可估算出待测样品的浓度。由于溴化乙啶有致癌的嫌疑， 所以现在也开发出了安全的染料，如Sybergreen。
常规的水平式琼脂糖凝胶电泳适合于DNA和RNA的分离鉴定；但经甲醛进行变性处理的琼脂糖电泳更适用于RNA的分离鉴定和Northern 杂交，因为变性后的RNA是单链，其泳动速度与相同大小的DNA分子量一样，因而可以进行RNA分子大小的测定，而且染色后条带更为锐利，也更牢固结合于硝酸纤维素膜上，与放射性或非放射性标记的探针发生高效杂交。
三、试剂与器材
（一）材料
电泳仪、水平电泳槽、样品梳子、琼脂糖等
（二）试剂
50×TAE Buffer 配制方法：
1. 称量Tris 242g，Na2EDTA·2H2O 37.2g 于1L烧杯中；
2.向烧杯中加入约800ml去离子水，充分搅拌均匀；
3加入57.1ml的冰乙酸，充分溶解；
4.加去离子水定容至1L后，室温保存
试剂的相对分子量：Tris（121.14）、乙酸（60.05）、EDTA（292.25）、
EDTA-Na2（336.21） 、Na2EDTA·2H2O （372.21）
冰乙酸的密度：1.049g/ml
2、 EB溶液：100mL水中加入1g溴化乙啶，磁力搅拌数小时以确保其完全溶解，分装，室温避光保存。
3、 DNA加样缓冲液：0.25%溴酚蓝，0.25%二甲苯青，40克蔗糖
四、操作方法
（一）常规的水平式琼脂糖电泳
制备琼脂糖凝胶：按照被分离DNA分子的大小，决定凝胶中琼脂糖的百分含量；一般情况下，可参考下表：
琼脂糖的含量（%） 分离线状DNA分子的有效范围（Kb）
0.3 60-5
0.6 20-1
0.7 10-0.8
0.9 7-0.5
1.2 6-0.4
1.5 4-0.2
2.0 3-0.1
1．制备琼脂糖凝胶：称取琼脂糖，加入1x电泳缓冲液，待水合数分钟后，置微波炉中将琼脂糖融化均匀。在加热过程中要不时摇动,使附于瓶壁上的琼脂糖颗粒进入溶液；加热时应盖上封口膜,以减少水份蒸发。
2．胶板的制备：将胶槽置于制胶板上,插上样品梳子,注意观察梳子齿下缘应与胶槽底面保持1mm左右的间隙，待胶溶液冷却至50℃左右时，加入最终浓度为0.5微克/毫升的EB(也可不把EB加入凝胶中,而是电泳后再用0.5μg/ml的EB溶液浸泡染色15分钟)，摇匀，轻轻倒入电泳制胶板上，除掉气泡；待凝胶冷却凝固后，垂直轻拔梳子；将凝胶放入电泳槽内，加入1x电泳缓冲液，使电泳缓冲液液面刚高出琼脂糖凝胶面；
3．加样：点样板或薄膜上混合DNA样品和上样缓冲液，上样缓冲液的最终稀释倍数应不小于1X。用10 μL微量移液器分别将样品加入胶板的样品小槽内，每加完一个样品，应更换一个加样头，以防污染，加样时勿碰坏样品孔周围的凝胶面。（注意：加样前要先记下加样的顺序和点样量）。
4．电泳：加样后的凝胶板立即通电进行电泳，DNA的迁移速度与电压成正比，最高电压不超过5V/cm。当琼脂糖浓度低于0.5%，电泳温度不能太高。样品由负极（黑色）向正极（红色）方向移动。电压升高，琼脂糖凝胶的有效分离范围降低。当溴酚蓝移动到距离胶板下沿约1cm处时，停止电泳。
5．观察和拍照：电泳完毕，取出凝胶。在波长为254nm的紫外灯下观察染色后（2）的或已加有EB的电泳胶板。DNA存在处显示出肉眼可辨的桔红色荧光条带。于凝胶成像系统中拍照并保存之。
六、 注意事项与提示
（1）EB是强诱变剂并有中等毒性，易挥发，配制和使用时都应戴手套，并且不要把EB洒到桌面或地面上。凡是沾污了EB的容器或物品必须经专门处理后才能清洗或丢弃。简单处理方法为：加入大量的水进行稀释（达到0.5mg/mL以下），然后加入0.2倍体积新鲜配制的5%次磷酸（由50%次磷酸配制而成）和0.12倍体积新鲜配制的0.5mol/L 的亚硝酸钠，混匀，放置1天后，加入过量的1mol/L碳酸氢钠。如此处理后的EB的诱变活性可降至原来的1/200左右。
（2）由于EB会嵌入到堆积的碱基对之间并拉长线状和带缺口的环状DNA，使DNA迁移率降低。因此，如果要准确地测定DNA的分子量，应该采用跑完电泳后再用0.5μg/ml的EB溶液浸泡染色的方法。
七、 实验安排
只需一天：上午配试剂倒胶，下午跑电泳并观察拍照。
八、实验报告要求与思考题
1、附上电泳结果的图片并进行正确的标注（如下图）
2、琼脂糖凝胶电泳中DNA分子迁移率受哪些因素的影响？
3、如果样品电泳后很久都没有跑出点样孔，你认为有哪几方面的原因？
实验准备：
购买材料：Tris1瓶500g，Na2EDTA·2H2O1瓶500g，冰乙酸2瓶，溴化乙啶10g（或替代物），琼脂糖，10g溴酚蓝，10g二甲苯青，1000克蔗糖.
电泳仪、水平电泳槽、样品梳子、等
试验五、甜酒酿的制作
一、试验目的：了解甜酒发酵过程，及影响因素。
试验原理：利用糯米饭让酵母菌进行发酵，先好氧发酵使其菌体大量繁殖抑制其他杂菌生长，同时代谢过程中产生大量水，最后使酵母菌处于缺氧环境，无氧呼吸产生酒精。酵母菌代谢产物很多，在菌体对数生长期所产生的产物，如氨基酸、核苷酸、蛋白质、核酸、糖类等，是菌体生长所必需的。这些产物叫初级代谢产物，许多初级代谢产物在经济上具有相当的重要性。
二、试验方法：
1、 浸泡：将糯米洗净，浸泡12到16小时，至可以用手碾粹即可
2、蒸饭：在蒸锅里放上水，蒸屉上垫一层白布，烧水沸腾至有蒸汽。将沥干的糯米放在布上蒸熟，约一小时。自己尝一下就知道了。没有这层布，糯米会将 蒸屉的孔堵死，怎么也蒸不熟。这有失败的经验。尝一尝糯米的口感，如果饭粒偏硬，就洒些水拌一下再蒸一会。
3、淋饭：将蒸好的糯米端离蒸锅，冷却至室温。间或用筷子翻翻以加快冷却。在桌子上铺上几张铝箔，将糯米在上面摊成两三寸厚的一层，凉透。在冷却好的糯米上洒少许凉开水，用手将糯米弄散摊匀，用水要尽量少。
4落缸搭窝：将酒曲均匀的拌在糯米中,转入容器, 压实,中间扒一个小窝,然后用保鲜膜或纱布密封.
5、培养成熟：将盆置于30--32度左右的恒温箱中培养24到48小时，如果米饭变软，表示已糖化好；有水有酒香味，表示已有酒精和乳酸，即可停止保温。最好再蒸一下，杀死其中的微生物和酶停止其活动。这样，甜酒酿就制作成功。
三、 学习讨论
1、一周后，品尝甜酒酿。先品尝本小组酿制的酒，把酒的颜色、味道等现象记录下来。
2、小组汇报：教师引导各小组进行交流、讨论。
（1）各组展示制作成果，简要阐述制作过程。（2）各组交流成果，品尝、作出评价
（3）交换意见：说说成功之处，失败原因（4）自由讨论保存甜酒酿的方法。
引导学生进行总结：（１）酿制酒酿的原理。（２）酿制酒酿的过程。（３）制作过程中的体会、收获。
设计目的：强化学生的体验，对学生进行情感教育。
实验准备：
糯米10斤和相应的酒曲。
微生物的单细胞分离纯化
一、目的要求
掌握倒平板的方法和几种常用的微生物分离纯化的基本操作技术。
二、基本原理
从混杂的微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的过程称为微生物的分离与纯化。
三、器材
1．菌种：
2．培养基：淀粉琼脂培养基。(200g马铃薯+ 1L水+12琼脂）。
3．溶液或试剂：1盛9ml无菌水的试管，盛90ml无菌水并带有玻璃珠的三角烧瓶，4％水琼脂。
4．仪器或其他用具：无菌玻璃涂棒，无菌吸管，接种环，无菌培养皿，显微镜，血细胞计数板等。
四、操作步骤
1．稀释涂布平板法
² 倒平板
² 制备土壤稀释液
² 涂布
² 培养：平板倒置于27℃培养2～3d。
² 挑菌落：将培养出的单菌落进行斜面接种，并分别置于25℃和28℃下培养，此后镜检是否为单一微生物。若有杂菌，继续分离纯化。
2． 平板划线分离法
²倒平板
² 划线
² 挑菌：挑取单个菌落接种到斜面上培养，此后镜检是否为单一微生物。若有杂菌，继续分离纯化。
五、思考题
1．如何确定平板上某单个菌落是否为纯培养？请写出实验的主要步骤。
2．用斜面检测微生物的培养特征接种时，为什么不要划多条线或蛇形，而只要划一条直线？
3．接种环（针）接种前后烧灼的目的是什么？为什么在接种前一定要将其冷却？如何判断烧灼过的接种环已冷却？