DMEM细胞培养液的配制及贴壁细胞的传代

一．实验目的

1.熟练掌握DMEM细胞培养液的配制

2.熟练掌握贴壁细胞的传代过程以及倒置显微镜的使用

二．实验原理

     培养基既是培养细胞中供给细胞营养和促使细胞生殖增殖的基础物质，也是培养细胞生长和繁殖的生存环境。培养基的种类很多，按其物质状态分为半 固体培养基和液体培养基两类；按其来源分为合成培养基和天然培养基。

(1) 合成培养基：合成培养基是根据细胞所需物质的种类和数量严格配制而成的。内含碳水化合物、氨基酸、脂类、无机盐、维生素、微量无素和细胞生长因子等。单独使用细胞虽有生存但不能很好的生长增殖。

(2) 天然培养基：使用最普遍的天然培养基是血清，基本以小牛血清最普遍。血清由于含有多种细胞生长因子、促贴附因子及多种活性物质。与合成培养基合用，能使细胞顺利增殖生长。常见使用为5-20%。

根据细胞生长的恃点，传代方法有3种

1、 悬浮生长细胞传代

    1）离心法传代：离心（1000转/分）去上清，沉淀物加新培养液后再混匀传代。

    2）直接传代法：悬浮细胞沉淀在瓶壁时，将上清培养液去除l／2一2／3，然后用吸管直接吹打形成细胞悬液再传代。

2、 半悬浮生长细胞传代（Hela细胞）

    此类细胞部分呈现贴壁生长现象，但贴壁不牢，可用直接吹打法使细胞从瓶壁脱落下来，进行传代。

3、 贴壁生长细胞传代

    采用酶消化法传代。常用的消化液有0.25％的胰蛋白酶液。

三．实验材料

MDBK细胞  0.25％的胰酶  1000mL大烧杯   玻璃棒   250mL盐水瓶   酸度计   50mL小烧杯3个   孔0.22μ微孔滤膜      去离子水   灭活的小牛血清   DMEM干粉      NaHCO3   超净工作台      电子天平   药匙 玻璃棒   废液缸  一次性手套   20ml注射器   移液器   1ml枪头 

四．实验过程

DMEM培养液的配制

1.取清洗干净的500mL大烧杯一个，加入新鲜制备的三蒸水约300mL，加热至15~30℃；

2.将DMEM干粉袋竖立轻弹，使袋中粉下沉，剪开袋口，将干粉倒入500mL的大烧杯中，用超纯水冲洗袋2~3次；

3.玻璃棒充分搅拌，以确保培养基干粉充分溶解；

4.根据配方要求，加入准确称取的NaHCO31.85g，L-谷氨酰胺0.1g，充分摇匀至完全溶解；

5.加入培养基总体积约10％的已灭活的小牛血清；

6.用浓度为7.4％的NaHCO3溶液调整溶液的pH值为7.2~7.4，加超纯水定容，并将培养液转入盐水瓶；

7.一次性滤器过滤上述培养液到灭菌的盐水瓶，封口，4℃保存备用。

贴壁细胞的传代

1 吸光培养瓶中的培养液

2 PBS冲洗3遍

3 加入1-2 ml 0.25％的胰蛋白酶液(以消化液能覆盖整个瓶底为准）静置2-10 min（显微镜下动态监测）。

4 吸去胰蛋白酶液，加入培养液。

5 用吸管吸取瓶内培养液，反复吹打瓶壁细胞，形成细胞悬液。

6 吸取1/3—1/10细胞悬液，接种于新的培养瓶内。

7 加适量新鲜培养液于接种了细胞悬液的新培养瓶内。

8 将后者放入培养箱中培养。

五．实验结果

植物原生质体融合

      

一、实验目的
了解植物原生质体融合的基本原理及其过程。
二、实验原理

植物原生质体融合在理论和实践上都有很大的意义，在植物遗传工程和育种研究上具有广阔的应用前景。它是植物同源、异源多倍体获得的途径之一，它不仅能克服远源杂交有性不亲和障碍，也可克服传统的通过有性杂交诱导多倍体植株的麻烦，最终将野生种的远源基因导入栽培种中。原生质体融合技术可望成为作物改良的有力工具之一。
许多化学、物理学和生物学方法可诱导原生质体融合。现在被广泛采用并证明行之有效的融合方法是聚乙二烯（PEG）法、高Ca高pH法和电融合法。
PEG作为一种高分子化合物，20～50％的浓度能对原生质体产生瞬间冲击效应，原生质体很快发生收缩与粘连，随和用高Ca高pH法进行清洗，使原生质体融合得以完成。
PEG诱导融合的机理：PEG由于含有醚键而具负极性，与水、蛋白质和碳水化合物等一些正极化集团能形成氢键。当PEG分子足够长时，可作为邻近原生质表面之间的分子桥而使之粘连。PEG也能连接Ca2＋等阳离子。Ca2＋可在一些负极化基才和PEG之间形成桥，因而促进粘连。在洗涤过程中，连接在原生质体膜上的PEG分子可被洗脱，这样将引起电荷的紊乱和再分布，从而引起原生质体融合。高Ca高pH由于增加了质膜的流动性，因而也大大提高了融合频率。洗涤时的渗透压冲击对融合也可能起作用。

三．实验材料

新鲜的植物材料 移液器 离心管 枪头 离心机 水浴锅  剪刀 镊子 载玻片 盖玻片 显微镜  300目滤网  PEG融合液  20%蔗糖溶液  酶液  13%CPW洗液
四、实验步骤
1.溶液的配制
（1）酶液
1％纤维素酶
1％果胶酶
0.7mol甘露醇
0.7m mol碳酸二氢钾
10m mol二水合氯化钙
pH6.8~7.0
（2） PEG融合液
40% PEG (MW1500－6000) 0.3 mol 葡萄糖 3.5m mol 二水合氯化钙
0.7mol 碳酸二氢钾
(3) 13%CPW洗液
27.2 mg/L碳酸二氢钾101.0 mg/L硝酸钾
1480.0 mg/L二水合氯化钙
246.0 mg/L七水合硫酸镁
0.16 mg/L碘化钾
0.025 mg/L五水合硫酸铜
13% W/V甘露醇
pH 6.0
（4） 20％蔗糖溶液
2.原生质体的分离
将撕去表皮的植物叶片或花瓣置于酶液（去表皮面接触酶液），在25℃黑暗条件下，酶解2～3小时。用300目网过滤除去未完全消化的叶片等残渣。在1000rpm条件下离心5分钟，弃上清液。加入3～4ml13%CPW洗液，相同条件下离心2分钟，弃上清，留1ml洗液。用滴管将20％蔗糖溶液注入离心管，在1000rpm条件下离心5～10分钟，由于密度梯度离心的作用，生活力强状态好的原生质体悬浮在20％蔗糖溶液与13％CPW溶液之间，破碎的细胞残渣沉于管底。
分别用用移液器轻轻将两管状态好的原生质体吸出（注意尽可能不要吸入下层的蔗糖溶液），放入另一干净的离心管中，加入等量的PEG融合液

3. 原生质体融合
将离心管放入提前准备好的水浴锅，放置15分钟，去除吸出放在载玻片上观察记录

五．实验结果

第二篇：实验报告

《学校卫生学》

教育学院 20##级 小学教育 刘玲艳 112062012084

实验二 立诚1-308教室卫生调查与测评

一、实验目的：通过学校教室卫生调查与测评，了解福建师范大学教室卫生情况并提出合理建议，同时掌握对教室进行卫生监测和评价的方法。

二、实验内容

（1）对教室一般情况的调查和评价。

（2）对教室自然采光情况的调查和评价。

（3）对教室人工照明情况的调查和评价。

（4）对桌椅卫生情况的调查和评价。

三、实验器材：直尺、皮尺、钢卷尺、计算工具等。

四、实验方法与步骤

 步骤一（1）检查教室的一般情况，其内容包括：

1)   教室可容纳的人数（即座位数），教室的楼层、方位，长、宽及净高，人均面积和容积。

2)   教室门窗的设置及通风换气情况。

3)   黑板材料及长、宽，黑板下缘距地面高度，黑板颜色及反光状况，前排桌至黑板距离。

（2）检查教室的自然采光情况，其内容包括：教室朝向（主要采光窗方向）及采光方式教室朝向（单侧、双侧、左侧、右侧采光）。

（3）检查教室人工照明情况，其内容包括：

1)   教室灯具种类、数量及配置情况（纵向或横向排列、悬挂高度）

2)   灯的使用状况，是否需清拭或更换。

（4）桌椅的卫生情况检查，其内容包括：

1)   课桌椅的形式（单人或双人，连式或分离式）。

2)   课桌的长、宽和桌面（平面或倾斜，能否翻转），课桌椅排列情况，每列桌椅间的间距。

3)   抽屉设置情况（封闭或揭盖式）。

4)   各套课桌椅的桌高、椅高和桌椅高差。

步骤二：计算相关物理量，得出数据。

步骤三：查阅相关资料，了解教室一般情况的合格要求。

步骤四：进行比照，发现问题，分析问题，提出建议。

五、实验结果

六、分析与讨论

（一）教室人均面积及座位分布情况

教室呈方形，教室面积较小，适合人数较少的班级上课。教室共有81个座位。总面积约为92平方米，假定教室可容纳的最多人数为教室的总座位数，则教室中学生人均面积为1.14m²。而实际上被安排在此教室的教学课堂人数一般少于81人，因此学生的人均面积大于1.14m² ，有较适宜的活动空间。但教室处于整齐和美观起见，左右侧两列皆为连着的三个座位，靠墙的那个座位离墙面较近，空间过于狭窄，这使得在三个人都坐满的情况下，坐在靠墙的两位同学活动空间较小且出行不便。

所调查教室的座位分三个部分，三大列，都是三个人为一排，每列共有九排，各部分间通过过道隔开，过道宽度都在1m左右。左右侧两部分靠墙也留有过道，空间较小不方便靠边同学通行。

 （二）教室位置、门窗的设置、通风换气及采光情况

该教学楼（立诚楼）大致一字排开，其教室分布在分布第二栋教学楼，所调查的教室（立诚1-308）处在教学楼的一个角上。教室位置坐西朝东，采光良好，课桌面有较大的照度，教室采光窗的面积要适当加大，窗上缘应尽可能高。教室外墙墙面上采用较大面积的玻璃窗户装置，共有0.42m²，内侧墙也留有较大面积的窗户和两个门，窗上缘也比较高，增加了教室的采光，使课桌面有较大的照度，有利于保护学生视力，同时也有利于通风换气，但由于两个门外是教学楼的通道而非敞开式的走廊，前面有另一栋教学楼挡住，可能会有所影响，但影响不会太大。教室装有4个风扇和为老师准备的1个小风扇，在夏天温度较高时可改善教室的通风条件。

（三）教室黑板设置情况

教室黑板采用墨绿色磁性平面非升降翻转式。黑板表面材料耐磨、无光泽，符合要求。宽 1.21m，长4.34m，黑板下缘距地面高度 1.00m，前排桌至黑板距离2.5m，符合教室第一排课桌前沿与黑板的水平距离不宜小于2m的要求。前排边座的学生与黑板远端形成的水平视角不应小于30°。黑板左上部分的教室顶部 挂有投影幕布，学校采用投影授课，弥补黑板板书缺陷，并且在教室墙上配有两个音箱，以此满足后排同学的视听要求。

（四）教室前设有讲台，面积为1.06cm²。作为教师的活动空间和交流联系部分，讲台离第一排作为的距离近1m，可保证通行。

（五）冬天，特别是临近期末，由于自习人数多，教室换气不是特别好，里面空气流通较差。

七、建议

（一）冬天，学生经常为了抵御寒冷而紧闭教室门窗，在教室自习人数多的情况下造成教室空气质量较差，影响学生大脑清醒，建议学生注意开窗通风。

（二）由于本教室投影幕布处遮挡了黑板的近二分之一部分，剩余空间较有限，建议可使用推拉式黑板，方便教师书写更多内容，也可以使板书内容保持时间相对长些。

（三）第一排两侧的位置，由于与黑板及投影幕布的远端形成的水平视角小于30°，可建议学生不坐该位置。

（四）该教室在空间设计上，看起来过于狭窄，主要感觉是座位过多，而上课的学生一般不会超过81位，所以可以撤出一些桌椅，扩大空间，更有利于师生间的学习与交流。