本科学生实验报告

学号： 124120463      姓     名：          

学院： 生命科学学院   专业、班级：  12级生物技术班           

实验课程名称：        酶工程实验一                        

教       师：         吴倩                           

云南师范大学教务处编印

实验一  淀粉酶产生菌的分离及酶活性测定

一、目的要求

1、掌握从土壤中分离酶产生菌的方法，学会应用微生物生态知识分离产酶微生物。

2、掌握淀粉酶活性测定的原理，学会淀粉酶活性的测定方法。

二、基本原理

（一）淀粉酶产生菌的分离

1.菌种的采集

①要获得产生某种酶的菌种，可从富含该酶作用底物的场所去采集。

②胞外酶的稳定性和最适反应条件通常和菌的最适生长条件一致，因此要筛选具有某一特性的酶时，只要到相应的环境中采样即可。

2.富集培养

①原理：采集到的样品中如果所需的菌很少，需要先经过富集培养，使所需的菌大量繁殖，而不需要的菌则不生长或少生长，以利于筛选。

②富集的方法：控制培养的温度、pH和营养成分等。

3.菌种的分离

①淀粉与碘液反应会形成蓝色化合物。

②淀粉酶能使淀粉分解为葡萄糖，而葡萄糖与碘反应不会形成蓝色化合物，结果可使淀粉酶产生菌周围形成透明圈，从而筛选出淀粉酶产生菌。

（二）淀粉酶产生菌的发酵及葡萄糖标准曲线绘制

1.原理：根据淀粉酶水解淀粉生成还原性糖，还原糖与3，5 -二硝基水杨酸共热后被还原成棕红色的氨基化合物，在一定的范围内，还原糖的量和反应液的颜色呈比例关系，可利用比色法在540nm进行测定。

2.酶活定义：在一定pH5.5、 37℃条件下，每分钟内从底物溶液中分解释放1μmol葡萄糖所需要的酶量为一个酶活单位U/g。

酶活计算公式：酶活（U/g）=A×5×K×N×1000/（T×W）

A:样品的OD值(平均值)         K:标准曲线的斜率

 N:稀释倍数                    5:0.2毫升反应液转换为1毫升体积       

 T:反应时间（min）             1000:转换因子1mmol=1000μmol

 W:葡萄糖的分子量（180.2g/mol）

3绘制标准曲线

①先配制一系列浓度不同的标准溶液，用选定的显色剂进行显色，在一定波长下分别测定它们的吸光度A。

②以A为横坐标，浓度c为纵坐标，则得到一条拟合度较好的直线，称为标准曲线。

③然后使用用完全相同的方法和步骤测定被测溶液的吸光度，便可从标准曲线上找出对应的被测溶液浓度或含量

三、器材

1试剂:

可溶性淀粉、碘、碘化钾、HCl、柠檬酸、Na2HPO4·12H2O等

2培养基:

分离、纯化培养基

3仪器:

①平皿、 三角瓶、大试管、 1mL和10mL移液枪、涂棒；

②天平、超净工作台、培养箱、电冰箱、恒温调速摇瓶柜、离心机、恒温水浴锅、紫外分光光度计、比色皿、记时器、高压灭菌锅。

四、操作步骤

（一）淀粉酶产生菌的分离

1.培养基的配制及灭菌

倒平板配制分离培养基        高压灭菌30min        冷却至约50℃

倒7块平板/140mL        冷却备用

2.制备土壤稀释液

①称取土样1g，放入9mL无菌水试管中，摇动10min，静置10min,制备得到10-1土壤稀释液；

②用无菌吸管吸出1mL土壤悬液，加入盛有9mL无菌水的大试管中，充分混匀，制备得到10-2土壤稀释液；

③再从中吸出1mL加入盛有9mL无菌水的大试管中，混匀后得到10-3土壤稀释液；

④以此类推，分别制备得到10-4、10-5、10-6、10-7土壤稀释液。

3.涂布

用无菌吸管分别吸取10-3、10-4、10-5 、10-6  和10-7土壤稀释液各0.1mL，对号放入已经写好记号的平板中央，用无菌玻璃涂棒涂匀。

4.培养纯化

挑取其中透明圈较大的单菌落，划线于平板，37℃倒置培养2～3d(如发现杂菌需再一次进行纯化直到获得纯培养)。

5.产淀粉酶微生物的鉴定

向平板内加入稀碘液数滴后进行观察

（二）淀粉酶产生菌的发酵及葡萄糖标准曲线绘制

1.淀粉酶产生菌的发酵

①分离培养基（140mL）的配制：

可溶性淀粉：0.7g     蛋白胨：0.7g           酵母膏：0.7g

KH2PO4    : 0.07g    MgSO4?7H2O :0.02g      CaCl2?2H2O : 0.08g

琼脂      : 2.8g

②配置发酵培养基200mL/组（40mL/瓶）       将纯培养得到的（透明圈最大的）      菌落接种于发酵培养基中30℃       150r/min摇瓶发酵约72h。

2.葡萄糖标准曲线的制作

①精确称取0.100g葡萄糖，用缓冲溶液定容至100ml，制得浓度为1mg/ml的葡萄糖的标准溶液。标准曲线如下图表所示：

②待测酶液的制备：

a.将发酵液倒入离心管中离心，离心条件4000转/5分钟，将离心后的上清液倾入试管中，稀释一定倍数测定其酶活力

    b.底物溶液—2%淀粉溶液（需当天配置）

称取2.0克可溶性淀粉，用约80mL缓冲液调匀，加热煮沸直到淀粉完全溶解；冷却，并用缓冲液定容至100mL。

    注：如果测定所得OD值不在有效值（0.2-0.8）范围内，则相应地降低或增大稀释倍数后再进行测定。

 ③淀粉酶酶活测定方法

五、酶活测定注意事项注：

1.试管上编号：贴上用圆珠笔写上编号的胶布，以防止保温或沸水加热时脱落；

2.移液枪的使用：向试管内加入待测酶液或DNS时，枪头不要触碰管壁，也不要伸入液面下，连续吸取同一种溶液时可以不用更换枪头！

3.精确记时：每一管加入酶液的时间要做记录，每管之间间隔的时间要合理；

4.避免试管进水：煮沸和用流水冲洗时；

5.实验结果的记录与分析

六、实验报告

（一）淀粉酶产生菌的分离结果

（二）葡萄糖标准曲线绘制

①葡萄糖标准曲线的制作

②糖化酶活力测定结果

③糖化酶活力的计算

OD的平均值=（A+B）/2=(0.332+0.289)/2=0.3105

根据酶活计算公式：

酶活（U/g）=（(A×K+b)×N×1000/（T×W））×5

   A:样品的OD值(平均值)         K:标准曲线的斜率

   N:稀释倍数                    5:0.2毫升反应液转换为1毫升体积       

   T:反应时间（min）             1000:转换因子1mmol=1000μmol

   W:葡萄糖的分子量（180.2g/mol）

代入数据可得：

酶活（U/g）=（(A×K+b)×N×1000/（T×W））×5

           =((0.3105×0.9479+0.126）×1×1000/(15×180.2)) ×5

           = 0.7775

3、思考题：请你建立一个“筛子”，从土壤中筛选出能产生植酸酶的微生物。

答：采集土样(除土层表面枯枝、 杂草和砂石， 收集距表层5cm~10cm土壤)

将采集的土样进行10 -1 ~10 -6 梯度稀释后，分别涂布于改良的含溴甲酚绿的植酸钙平板初筛培养基上，在30℃的恒温箱中培养3d，然后观察菌落周围是否

形成透明水解圈。

因为培养集中含有水溶性较差的植酸钙，因而含植酸钙的平板上会呈现浑浊态。若菌株代谢产生植酸酶，植酸钙被酶降解，在菌落周围形成透明水解圈，可起到一定指示作用。此外可选取溴甲酚绿、溴甲酚紫、中性红及刚果红等4种常用染色剂添加至平板初筛培养基中，在加深培养基背景色的同时，以增强植酸钙水解后形成的透明圈可见性。

第二篇：高产淀粉酶菌株的分离与酶活性检测 2(1) 2

高产淀粉酶菌株的分离与酶活性检测

西南大学生命科学学院 20##级5班第3小组自主实验

摘要：土壤是微生物的良好生境，土壤中有多种类群的微生物，它们对自然界物质的转化和循环起着极为重要的作用，对农业生产和环境保护有着不可忽视的影响。目的:从土壤中分离筛选高产淀粉酶菌株,方法:通过碘比色法比较水解圈的直径大小测酶活性高低,从而从土壤中分离筛选到高产淀粉酶的菌株

关键词：土壤  淀粉酶  分离  水解圈  碘液

淀粉酶是催化淀粉水解的一类酶的总称，广泛存在于动物、植物和微生物中，是用途最广、产量最大的酶制剂产品之一。本实验从土壤中分离高产淀粉酶菌株并通过碘比色法比较水解圈的直径大小测酶活性高低。

一、实验材料

1.1、实验取材

从学校枯叶堆积处取土层下5-10cm处的土壤

1.2、培养基配方

淀粉培养基: 称取牛肉膏5 g、蛋白胨10 g、NaC l 5 g、可溶性淀粉2 g 溶于900 m l蒸馏水中, 再加入25 g琼脂粉并搅拌至充分溶解, 调pH 至7. 2, 最后加蒸馏水定容至1000 m ,l 高压蒸汽灭菌;

种子培养基( LB): 除不加琼脂粉外, 其它成分和淀粉培养基配置相同。

1.3、试剂与仪器

碘液、烧杯（500ml）、锥形瓶（250ml）、酒精灯、培养皿、涂布棒、移液枪、无菌枪头、试管、超净工作台、高压蒸汽灭菌锅、摇床培养箱、接种环、记号笔等

二、实验方法

2.1、样品稀释

    称取酒曲样品10g溶于90mL 无菌水中,在37摄氏度摇床（200r/min）培养箱中培养2-3个小时，使菌体充分扩散到无菌水中。静置，取上清至富集培养基的锥形瓶中。在37摄氏度摇床（200r/min）培养箱中培养一天，使菌体富集。将富集后的菌液分别用无菌水梯度稀释至 1 ×10 ^-6倍。

2.2、分离

    分别取10^-2 、10^-3、10^-4 、10^-5 、10^-6菌液0.2ml均匀涂布在10个淀粉培养基上，在37摄氏度培养箱培养2天，平板培养基表面便形成了若干菌落。

2.3、筛选

    用滴管将碘液均匀滴洒在培养基上，菌落周围形成水解圈的菌株即是产淀粉酶的菌株，根据淀粉遇碘变蓝的原理，有明显淀粉水解圈则说明该菌产酶能力强，蓝色越深说明产酶活力越弱，进而挑取出产酶能力高的菌株接种到淀粉培养基试管斜面上，在37摄氏度条件下培养2天。

2.4、酶活力检测

   用接种环挑取一环菌到液体培养基中进行摇床发酵培养（250ml

三角瓶内装50ml液体培养基，统一采用28℃，< /font>150r/min）24小时后将菌液进行离心，再在超净工作台上倒两个平板，待培养基凝固后在每个平板上放上3个牛津杯并用移液枪取0.1ml上清液加入到每个牛津杯中。24小时后，用滴管把碘液滴洒到平板中观察水解圈的大小，水解圈越大就说明淀粉酶的活性越高，取活性最高的菌株作为目的菌株，对其进行培养,即得到高产淀粉酶的菌株。

三、实验结果

3.1、筛选结果

    利用筛选培养基从土样中筛选产淀粉酶的菌株。其菌落在滴加碘液后出现水解圈。即淀粉被水解成了不被碘液着色的物质，如糊精、麦芽糖和葡萄糖。水解圈的大小在一定程度上反映了菌株产生淀粉酶的能力，水解圈越大产说明淀粉酶越多。用接种环从平板上挑取出来2种不同的产淀粉酶的菌（一种产色素，一种不产色素）。

 

 

3.2、酶活力检测结果

将筛选到的有水解圈的2株高产淀粉酶菌作发酵培养试验,通过碘比色法用牛津杯测量其所产淀粉酶的活力。

 

四、实验总结

通过本次试验，我们成功地从土壤中分离出来高产淀粉酶的菌株并测定了其所产淀粉酶的活力大小。虽然结果还算理想，但在实验过程中我们也遭受了很多失败。比如培养基的配置失误，操作行为不恰当导致杂菌污染等使得我们组的实验进程一度停滞不前。所以在做实验时要有严谨性，操作要得当，尤其是微生物的实验接触的都是细菌、真菌、病毒等微生物更是要操作小心。与此同时，在做实验时也更应该加强团队合作的意识。

参考文献：

[1]徐琛.产淀粉酶芽孢杆菌的筛选和分离[J].齐鲁师范学院学报,2011.

[2]唐丽江,王振华,王迪.高产淀粉酶芽孢杆菌菌株的筛选[J].安徽农业科学,2009.

[3]楼超,刘铁帅,贾博深.高产淀粉酶菌株的筛选及产酶条件优化的探究[J].中

国卫生检验杂志,2010.