编 号 项 目 分 类 重大攻关项目 □
普通攻关项目 □
软科学项目 □
河 南 省 医 学 科 技 攻 关
计划项目申请书
项 目 名 称 药物活性优化经脐静脉治疗HCC+PVTT作用机制的研究
研 究 领 域 基础□ 临床 □ 预防 □ 药学 □ 其它 □
所属学科名称 普通外科 研究起止时间 20xx年10`月-20xx年10月
承担单位（公章） 河南大学第一附属医院
课题负责人 夏荣龙
河南省卫生厅
河南省医学科学院
二O O 八 年 四 月
说明
1、 本申请书各项内容必须实事求是，逐项认真填写。表达要明确、严谨、详细、具体，内容请务必打印，必要时另附详
细技术材料。凡填写内容不符合要求、手续不完备、字迹潦草者，不予受理和评审。
2、 申请者和协作者所在单位及其所属学术委员会必须认真评审，对项目的价值和可行性等提出具体意见，共同签章后方
可上报。
3、 “创新项目”填写“研究领域”，“引进项目”填写“技术类别”。
4、 所有栏目如页面不够，均可自行加页。
中华人民共和国国家标准
学 科 分 类 与 代 码
Classification and code of disciplines
(GB/T 13745--92)
代码 学科名称 代码 学科名称 代码 学科名称
310〃11 医学生物化学 320〃2440 内分泌学 330〃14 毒理学
310〃14 人体解剖学 320〃2445 风湿病学与自体免疫病学 330〃21 流行病学
310〃17 医学细胞生物学 320〃2450 变态反应学 330〃24 传染病学
310〃21 人体生理学 320〃2499 内科学其他学科 330〃31 环境医学
310〃24 人体组织胚胎学 320〃27 外科学 330〃34 职业病学
310〃27 医学遗传学 320〃2710 普通外科学 330〃37 地方病学
310〃31 放射医学 320〃2715 显微外科学 330 . 41 社会医学
310〃34 人体免疫学 320〃2720 神经外科学 330〃47 食品卫生学
310〃37 医学寄生虫学 320〃2725 颅脑外科学 330〃51 儿少卫生学
310〃41 医学微生物学 320〃2730 胸外科学 330〃54 妇幼卫生学
310〃44 病理学 320〃2735 心血管外科学 330〃57 环境卫生学
310〃47 药理学 320〃2740 泌尿外科学 330〃61 劳动卫生学
310〃51 医学实验动物学 320〃2745 骨外科学 330〃64 放射卫生学
310〃54 医学心理学 320〃2750 烧伤外科学 330〃67 卫生工程学
310〃57 医学统计学 320〃2755 整形外科学 330〃71 卫生经济学
310〃61 生物医学工程学 320〃2760 器官移植外科学 330 · 81 卫生管理学
310〃99 基础医学其他学科 320〃2765 实验外科学 340 · 20 特种医学
320 临床医学 320〃2799 外科学其他学科 350 药学
320〃11 临床诊断学 320〃31 妇产科学 350 · 10 药物化学
320〃1140 医学影像学 320〃34 儿科学 350 · 20 生物药物学
320〃14 保健医学 320〃37 眼科学 350 · 35 药剂学
320〃1420 运动医学 320〃41 耳鼻咽喉科学 350 · 40 药效学
320〃1430 老年医学 320〃44 口腔医学 520 · 60 计算机应用
320〃17 理疗学 320〃47 皮肤病学 840〃7170 计划生育学
320〃21 麻醉学 320〃51 性医学 870 图书馆、情报与文献学 320〃24 内科学 320〃54 神经病学 880 教育学
320〃2410 心血管病学 320〃57 精神病学 910 · 4030 卫生统计学
320〃2415 呼吸病学 320〃64 核医学
320〃2420 结核病学 320〃67 肿瘤学
320〃2425 胃肠病学 320〃71 护理学
320〃2430 血液病学 330 预防医学与卫生学
简 表
编号：
- 2 -
- 3 -
研究人员
- 4 -
研究内容和意义（包括学术思想、立论依据、攻关目标和具体内容；理论意义和应用价值分析）
肝细胞癌(HCC)经门静脉转移易产生门静脉癌栓(PVTT)，发生率约为34%-40%［1、2］,预后恶劣。临床上HCC+PVTT易出现消化道大出血、肝功能衰竭、顽固性腹水、肿瘤自发性破裂等严重并发症,导致病人病情急剧恶化，乃至死亡。患者的中位生存率仅为2.7个月。目前临床实践多积极采用以手术为主的综合治疗，因治疗方案不统一，疗效依然较差[3]。探讨有效地预防及治疗HCC+PVTT的新策略，是目前肝癌研究的关键课题。
1、 HCC+PVTT形成的机制: 我国HCC的特点大多伴有不同程度的肝硬化。一方面HCC
［4］无限增殖能力（PCNA）和凋亡的障碍［5］，使肿瘤细胞过度增殖，并分泌大量的VEGF，促
进大量结构和功能异常肿瘤血管的形成，向癌组织周围血管化浸润、转移［6］。HCC细胞间与血管内皮细胞间粘附分子（ICAM-1）异常表达［7］，有利于癌性血栓的形成。另一方面肝硬化假小叶形成将无序分隔压迫肝静脉造成肝内血液动力学改变，产生门静脉高压和逆肝血流，使脱落的癌性血栓容易在门静脉内停留、着床。门静脉回流血液富含消化吸收的营养物质和胰腺内分泌所产生胰岛素、胰高血糖素和生长抑素等,为癌性血栓的肿瘤细胞增殖提供了丰富的营养物质。此外,门静脉内微环境免疫细胞活性抑制，肿瘤细胞可逃避机体免疫监视，最终形成PVTT［8］。
2、 HCC+PVTT的治疗的现状: 肝癌切除并门静脉取癌栓病人,术后1、3、5年生存率分别提高为67.7%、40.3%和20.9%。即使对肿瘤不能切除的病人，行门静脉取栓病人的生存率也高于非手术病人［9］。表明门静脉取栓， 能切实延长生存时间。而非手术组中, 行介入治疗组的疗效又要优于保守治疗组。因此，对HCC+PVTT应采取积极有效的治疗措施。影响HCC+PVTT疗效的主要因素有:治疗方式、肿瘤数目、肿瘤大小、PVTT病理类型。就术后生存率而言，主瘤切除并门静脉切开取栓组优于单纯比较门静脉切开取栓组；单发肿瘤组优于多发肿瘤组；主瘤10cm以上组明显低于主瘤小于10 cm组；机化型组低于增生型、坏死型、混合型组主要原因就是癌栓不易清除,易早期复发。对HCC+PVTT手术后定期行门静脉或肝动脉化疗可杀灭肝内、门静脉内的残余癌细胞,延缓术后复发。其术后1、3、5年生存率明显高于非化疗组，但术后采用何种治疗方法最佳有待进一步探讨。
3、本课题研究内容：设计肝癌切除+门静脉切开取癌栓术联合亚砷酸+派罗欣+丹参 药物活性优化经脐静脉治疗HCC+PVTT基础和临床系列实验，研究规范治疗HCC+PVTT的新策略。通过人肝癌细胞株BEL-7402的体外细胞实验，探讨亚砷酸+派罗欣+丹参的药物活性优化方案的抗HCC细胞效果；通过高转移人肝癌裸鼠模型LCI—D20， 探讨药物活性优化对HCC发展的影响；通过HCC+PVTT临床分组对照实验，揭示手术联合药物活性优化 - 5 -
经脐静脉治疗HCC+PVTT的分子作用机制。
4、课题研究理论意义和应用价值：本课题通过基础和临床系列研究，从细胞学、药效学、肿瘤分子生物学、基因学等方面，多角度、多层次地，揭示手术联合药物活性优化经脐静脉灌注治疗HCC+ PVTT治疗作用的机制，探讨有效地预防及治疗HCC+PVTT的新策略，达到规范化治疗，易于推广，可转化为成果，有效地降低治疗原发性肝癌综合医疗费用，势必产生不可估量经济效益和社会效益。
- 6 -
国内外研究现状、水平及发展趋势（包括有何国家、单位曾经或正在从事类似的研究，已经达到的水平，存在的主要问题以及发展趋势。本课题的技术关键，有无创新和特色）
肝细胞癌(HCC)经门静脉转移，易产生门静脉癌栓(PVTT)，发生率约为34%-40%,预后恶劣。目前临床实践因治疗方案不统一，疗效依然较差。患者的中位生存率仅为2.7个月。探讨有效地预防及治疗HCC+PVTT的新策略，为医学界所关注的热点和难点问题。
1、探索有效治疗HCC+PVTT的新策略，显得刻不容缓。本课题通过临床应用研究，致力于采用手术联合药物活性优化经脐静脉植泵灌注治疗HCC+PVTT新模式。
① 治疗途径创新的研究：目前HCC+PVTT的治疗多采取以肝癌切除+门静脉切开取癌 栓术为主综合治疗。据国内外文献记载以往HCC+PVTT的术后采用诸如静脉化疗、肝动脉及门静脉置泵灌注化疗等方法，临床应用颇有争议［10、11、13］。静脉化疗副作用大，全身反应严重，国内外学者倾向于局部化疗方案。肝动脉置泵化疗目前较为通行局部化疗技术，但国内外进一步研究表明：其难以防治HCC门静脉系转移特点，形成HCC+PVTT。门静脉置泵灌注化疗，容易形成血栓，可能造成医源性肝衰，在医学界达成共识。本课题组研究经脐静脉(门静脉系统的终末枝)置泵灌注化疗技术，一方面增加了肝脏局部的药物浓度，封杀了HCC经门静脉转移易产生PVTT特点；另一方面克服了门静脉置泵化疗容易形成血栓的缺点，又解除了患者因传统化疗带来痛苦，为HCC+PVTT治疗开拓了一条崭新的途径。
② 药物活性优化的研究：亚砷酸（三氧化二砷、As2O3）是我国开发研制的二类抗肿
瘤新药，其治疗白血病在临床上取得较满意的疗效。近年来积极尝试实体瘤治疗，特别是HCC的治疗已取得突破［11］。派罗欣（聚乙二醇化干扰素）具有抑制肿瘤细胞增殖、调节机体免疫、诱导细胞分化和抗肿瘤血管形成；长期应用可降低与病毒持续状态相关的HCC发生率和HCC+PVTT术后的复发［12］。丹参脂溶性成分丹参酮可促进肝癌细胞凋亡、干扰肿癌血管的形成；丹参水溶性成分成分丹参素可抗血小板凝集作用，阻止肿瘤细胞凝集成癌性血栓，抑制PVTT的形成［13］。前期预实验研究表明：通过人肝癌细胞株BEL-7402体外细胞实验，探讨亚砷酸+派罗欣+丹参的药物活性优化方案的抗肿瘤细胞效果。通过高转移人肝癌裸鼠模型LCI—D20，探讨亚砷酸+派罗欣+丹参的药物活性优化抗肿瘤的机制。预实验已取得成效，预实验小样本与临床应用研究复杂性的干扰，可能造成偏差，故有待于本课题进一步证实。
2、 拟解决的关键问题及关键技术：
① 脐静脉置泵灌注治疗HCC+PVTT技术：脐静脉属门静脉系统的终末枝，出生后闭锁。20xx年本课题组采用肝癌切除+脐静脉植泵灌注化疗的治疗原发性肝癌获得成功。术 - 7 -
中将静脉灌注管放置脐静脉中，药泵埋于皮下，术后经皮经脐静脉泵灌注药物化疗。其特点：一方面增加了肝脏局部的药物浓度，封杀了HCC经门静脉转移易产生PVTT特点；另一方面克服了门静脉置泵化疗容易形成血栓的缺点，又解除了患者因传统化疗带来痛苦。通过预实验多次改进，又开展了超声定位下脐静脉置泵灌注亚砷酸治疗原发性肝癌的研究”以及 “基因芯片对亚砷酸经脐静脉灌注治疗原发性肝癌及分子机制的研究” 取得阶段性成果。目前已完成上百例手术，脐静脉置泵技术悉已成熟，已逐步形成规模优势。
② 抗癌药物活性优化的方案： 20xx年以“肝癌切除加脐静脉植泵灌注治疗原发性肝癌临床研究”成功申请到河南省科技厅的科技攻关项目。20xx年又以“超声定位下，脐静脉置泵灌注亚砷酸治疗原发性肝癌临床研究” 申请到河南省教育厅科技攻关项目。20xx年再以“基因芯片对亚砷酸经脐静脉灌注治疗原发性肝癌及分子机制的研究” 申请到河南省卫生厅医学科技攻关计划项目。使其以脐静脉植泵灌注治疗HCC实验成为系列研究，逐步完善HCC+ PVTT综合治疗研究体系。
③ 利用基因芯片技术：高通量检测凋亡基因、癌基因、抑癌基因、肿瘤转移抑制基因及细胞信号等相关基因谱表达，分析基因谱差异。通过河南大学天然药物研究所、河南大学医学分子生物学实验室和河南大学植物逆境重点实验室进行交叉学科协作。
3、本课题组的创新和特色
① 治疗途径创新：课题组在完成河南省科委“肝癌切除联合脐静脉植泵灌注治疗原发性肝癌的临床研究”项目的基础上，采用“超声定位下脐静脉置泵灌注亚砷酸治疗原发性肝癌的研究”以及 “基因芯片对亚砷酸经脐静脉灌注治疗原发性肝癌及分子机制的研究” 取得阶段性成果。初步研究表明：1、3年生存率明显提高，肿瘤复发率降低，二期手术切除率提高及负作用反应率明显降低。为临床治疗更加规范，研究其治疗机制，形成治疗体系，便于推广。
② 药物活性优化特色：在“基因芯片对亚砷酸经脐静脉灌注治疗原发性肝癌及分子机制的研究”的基础上，设计手术联合药物活性优化经脐静脉植泵灌注治疗HCC+PVTT新模式基础和临床系列研究，通过人肝癌细胞BEL-7402体外细胞实验、高转移人肝癌裸鼠模型LCI—D20的肿瘤学研究实验、HCC+ PVTT临床分组对照实验的基础和临床系列研究，从细胞学、药效学、肿瘤分子生物学、基因学等方面，多角度、多层次地揭示手术联合药物活性优化经脐静脉灌注治疗HCC+ PVTT治疗作用的机制。
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预期研究的阶段性成果、最终成果、经济社会效益及其推广应用（包括总目标和分阶段目标。成果应写明推广应用或转让的可能性及社会、经济效益预测）
㈠ 研究目标
通过人肝癌细胞株BEL-7402体外细胞实验、高转移人肝癌裸鼠模型LCI—D20实验和HCC+ PVTT临床分组对照实验的基础和临床系列研究，从细胞学、药效学、肿瘤分子生物学、基因学等方面，多角度、多层次地揭示肝癌切除+门静脉切开取癌栓术联合亚砷酸+派罗欣+丹参的药物活性优化经脐静脉植泵灌注治疗HCC+PVTT的作用机制，研究规范治疗HCC+PVTT的新策略。
㈡ 本课题研究内容
1、通过人肝癌细胞株BEL-7402体外细胞实验，对空白实验组、亚砷酸组、派罗欣组、丹参组和药物活性优化组的施行分组对照，检测各实验组对人肝癌细胞株BEL-7402的细胞增殖、凋亡和细胞分化等指标，探讨亚砷酸+派罗欣+丹参的药物活性优化方案的抗肿瘤细胞效果。
2、通过高转移人肝癌裸鼠模型LCI—D20，对空白对照组、5-Fu阳性对照组和药物活性优化治疗组施行分组对照，从形态学角度观察肿瘤体积、抑癌率、抑转移率和从分子学角度对肝癌的增殖能力、肝癌细胞凋亡、肿瘤血管的形成和肝癌转移倾向进行研究，探讨亚砷酸+派罗欣+丹参的药物活性优化抗肿瘤的机制。
3、通过HCC+ PVTT临床分组对照实验，对肝动脉灌注药物活性优化组、脐静脉灌注阿霉素组和脐静脉灌注药物活性优化组施行前瞻性分组对照，从治疗学角度研究其显效率，1、3年生存率，二期手术切除率及负作用反应率和从基因学角度运用基因芯片技术高通量观察肿瘤相关基因谱差异性表达，探讨手术联合药物活性优化经脐静脉治疗HCC+PVTT的作用机制。
㈢ 应用成果与社会、经济效益预测
肝癌切除+门静脉切开取癌栓术联合药物活性优化经脐静脉治疗HCC+PVTT新模式，临床上已取得阶段性成果。初步研究表明：1、3年生存率明显提高，肿瘤复发率降低，二期手术切除率提高及负作用反应率明显降低。为HCC+PVTT治疗开拓了一条崭新的途径。
积极深入研究，形成新治疗体系，可转化为成果，势必产生良好临床疗效、易于推广，有效地降低治疗原发性肝癌综合医疗费用，产生不可估量经济效益和社会效益。
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拟采用的研究方法、技术路线（包括研究工作的总体安排、理论计算、实验设计、实验方法和步骤、工艺流程及其可行性论证，预计可能遇到的问题与解决方案）
一、研究方案
第一部分：体外细胞实验
1、目的：通过人肝癌细胞株BEL-7402体外细胞实验，对空白实验组、亚砷酸组、派罗欣组、丹参组和药物活性优化组的施行分组对照，检测各实验组对人肝癌细胞株BEL-7402的细胞增殖、凋亡和细胞周期分析等，探讨亚砷酸+派罗欣+丹参的药物活性优化方案的抗肿瘤细胞效果。
2、材料与方法
2-1研究对象:人肝癌细胞株BEL-7402(中国科学院上海细胞生物学研究所提供) 2-2主要试剂:亚砷酸注射液为哈尔滨伊达药业有限公司生产。派罗欣注射液（聚乙二醇化干扰素-a）购自Hoffman Roche 公司上海分公司，丹参注射液有上海第九制药厂生产。RPMI1640:购自GIBCO RBL公司。 MTT购自华美公司。细胞凋亡测试剂盒:购自武汉博士德生物工程有限公司。
3、研究方法
3-1细胞培养:常规复苏人肝癌细胞株BEL-7402，在含有100u/ml青霉素、100u/ml链霉素和10%新生小牛血清的RPMI-1640培养液内，置37 C0 , 5% C02孵箱中传代培养，
每2-3天传代一次，取对数生长期细胞用于试验。
3-2、随机分组原则
①亚砷酸治疗组： 亚砷酸注射液，浓度10μmol/L，观察 3天
②派罗欣治疗组： 派罗欣注射液，浓度10μg/L， 观察 3天
③丹 参治疗组： 丹 参注射液，浓度0.5mg/L， 观察 3天
④药物活性优化组： 亚砷酸浓度10μmol/L+派罗欣浓度10μg/L
+丹参浓度0.5mg/L，观察 3天
3-3、 MTT法(四甲基偶氮哇盐比色法)检测各组对BEL-7402细胞增殖抑制情况、计算细胞抑制率和药物的联合作用指数。
采用MTT法观察不同浓度亚砷酸组、派罗欣组、丹参组单独或联合应用的药物活性优化组对BEL-7402细胞生长的抑制作用。取对数生长期BEL-7402细胞，用0.15胰酶分散细胞后计数，调整浓度为5×104/ml，置入96孔细胞培养板，200ul/孔，待细胞贴壁后，分别加入亚砷酸治疗组、派罗欣治疗组、丹参治疗组和药物活性优化组，同时设一组不加药物的细胞组，作为实验对照组，每组均含4个平行孔，置5 % C02孵箱内分别培
养24h,48h, 72h， 结束前4-6小时，每孔加入MTT (5mg/ml) lO ul，小心去除上清液， - 10 -
加入DMSOl00u1，轻轻震荡至MTT沉淀完全溶解，在多孔扫描分光光度计上，测定570nm波长下吸光度A值。取4孔A值平均数。
① 按公式计算药物对细胞的抑制率：
细胞抑制率(%)=(1一实验组平均吸光度值/对照组平均吸光度值)×100%。
各药物单独应用时,对BEL-7402细胞的抑制作用是否呈现明显的剂量效应依赖关系，计算各药物的中效浓度(IC50)。应用中效原理分析和计算两种药物的联合作用指数。
② 两种药物的联合作用指数(combination index,CI)的计算公式为：
CI=(D)1/(Dx)1+(D)2/(Dx)2+α×(D)1×(D)2/(Dx)1×(Dx)2
(Dx)1和(Dx)2为两种药物单独应用产生x%细胞IR时所需的浓度,(D)1和(D)2为两种药
物合用产生相同的x%细胞IR时各自所需要的浓度。
两种药物的相互作用为非排斥性,取α=1。如果CI<1,认为两种药物的联合作用为协 同效应;如果CI>1,认为两种药物呈现拮抗作用;如果CI=1,则认为两种药物的联合作用为相加作用。亚砷酸+派罗欣、亚砷酸+丹参和派罗欣+丹参的两两药物合用均为CI≤1，可推断亚砷酸+派罗欣 +丹参的抗肿瘤细胞的药物活性优化效应。
3-4、原位末端转移酶技术(TUNEL)检测细胞凋亡，计算凋亡率。
⑴ 细胞准备:将多聚赖氨酸粘片置6孔细胞培养板，取对数生长
BEL-7402细胞，调至5×104/ml，将细胞加入培养板内，2m1/孔，分别加入亚砷酸治疗组、派罗欣治疗组、丹参治疗组和药物活性优化组，培养48h。取出爬片，PBS洗涤2次，室温下4%多聚甲醛固定 30min。
⑵ TUNEL检测:参照试剂盒说明书按下列步骤进行。
⑶ 结果判断:细胞核中或核团有蓝紫色颗粒者为阳性细胞，即凋亡细
胞，每片爬片随机计数500个细胞，计算凋亡阳性细胞百分率。
3-5流式细胞仪检测凋亡阳性细胞比率和DNA细胞周期分析。
⑴ 在已准备好的BEL-7402细胞瓶中分别加入亚砷酸治疗组、派罗欣治疗组、丹参治疗组和药物活性优化组，另设一瓶不加药物为对照，5% C02孵箱中培养48h.
⑵ 用0.15%胰酶将细胞消化脱壁，PBS洗涤2次，用冷PBS制备细胞悬液O.5ml，加5m1 75%冷乙醇固定，加RNA酶及碘化丙淀，闭光染色30 mm。
⑶ 将样品用FAC scan型流式细胞仪检测细胞核DNA含量，数据用multicycle分析软件处理。
4、统计学方法
实验结果以x士s表示，组间比较用单因素方差分析，以a =0.05为检验水平，P<0.05 - 11 -
有统计学意义。
第二部分: 肝癌裸鼠动物模型实验
1、目的：通过高转移人肝癌裸鼠模型LCI—D20，对空白对照组、5-Fu阳性对照组和药物活性优化治疗组施行分组对照，从形态学角度观察肿瘤体积、抑癌率、抑转移率和从分子学角度对肝癌的增殖能力、肝癌细胞凋亡、肿瘤血管的形成和肝癌转移倾向进行研究，探讨亚砷酸+派罗欣+丹参的药物活性优化抗肿瘤的机制。
2、材料与方法
2-1、材料
亚砷酸注射液为哈尔滨伊达药业有限公司生产。派罗欣注射液（聚乙二醇化干扰素-a）购自Hoffman Roche 公司上海分公司，丹参注射液有上海第九制药厂生产。高转移人肝癌裸鼠模型LCI—D20购自复旦大学肝癌研究所。鼠龄5周,体重17-20g,在SPF条件下裸鼠室内饲养。免疫组织化学试剂购自武汉博士德生物工程有限公司。
2-2、方法
利用复旦大学肝癌研究所建立的高转移人肝癌裸鼠模型LCI—D20，将瘤源原位接种于36只裸鼠肝内，随机分为3组:
① 空白对照组：12只，等体积生理盐水，腹腔注射，连续给药14天。
② 阳性对照组：12只，5-Fu注射液，剂量2.5mg/kg, 腹腔注射，连续给药14天。 ③ 药物活性优化治疗组：12只，亚砷酸注射液，剂量2.5mg/ kg ，腹腔注射；派罗欣注射液1.5×107U/ kg，颈部注射；丹参注射液，剂量2ml/ kg，联合用药，腹腔注射，连续给药14天。
停药后，用40g/L多聚甲醛（0.1mol/L）PB固定液全身灌注固定法获取肝脏、肺脏标本。
2-3、肝癌生长转移情况：肉眼观察：记录肿瘤体积，肝内转移灶数目、转移灶累及肝叶数以及全身各器官转移情况。肝内转移灶数目及肺转移情况，并计算相应肿瘤体积=长径×短径2÷2，抑癌率(抑癌率=（对照组平均瘤体—实验组平均瘤体）÷对照组平均瘤体×100%)和抑转移率(抑转移率=（对照组平均转移率—实验组平均转移率）÷对照组平均转移率×100%)。
2-4、病理形态学及组织免疫组化检查：将选取肝瘤组织、瘤周组织、邻近肝近肝叶（左内叶）及肺组织行HE染色和免疫组化检查。从分子生物学角度观察肝癌的四个指标：①细胞增殖能力指标--增殖细胞核抗原（PCNA)，②肿瘤血管形成指标--血管内皮因子（VEGF），③肝癌转移倾向指标--细胞间黏附分子-1(ICAM-1），④促肝癌细胞凋亡指标-- - 12 -
凋亡指数（Apoptosis Index）。
2-5、统计学方法
计量资料以χ±S表示，使用 SPSS 10.0统计软件，对计量资料进行t检验，对计数资料进行R?C表χ2检验，P?0.05认为差异有统计学意义。
第三部分：HCC+PVTT的临床分组对照实验
1、目的：通过HCC+ PVTT临床分组对照实验，对肝动脉灌注药物活性优化组、脐静脉灌注阿霉素组和脐静脉灌注药物活性优化组施行前瞻性分组对照，从治疗学角度研究其显效率，1、3年生存率，二期手术切除率及负作用反应率和从基因学角度运用基因芯片技术高通量观察肿瘤相关基因谱差异性表达。探讨药物活性优化经脐静脉治疗HCC+PVTT的作用机制。
2、病例收集、选择和分组
2-1、病例选择：90名病例，来源于河南大学第一附属医院在20xx年—20xx年收治的住院病人，病理确诊为HCC+ PVTT；年龄30—65岁、性别不限。（一期手术行肝癌切除+门静脉切开取癌栓术后，术后药物治疗3个疗程，一期不能手术，术前药物治疗1个疗程后，二期手术行肝癌切除+门静脉切开取癌栓术，术后药物治疗2个疗程，并计算二期手术切除率）。
2-2、病例分组为随机分组原则
①肝动脉灌注药物活性优化治疗组：30例；亚砷酸注射液，剂量10mg/d，；派罗欣
注射液180μg/d；丹参注射液，剂量10ml/d。联合用药qd×21天，间隔4
周重复，总共3个疗程。
②脐静脉灌注阿霉素治疗组：30例；阿霉素注射液，10mg/d，qd×21。间隔4周
重复，总共3个疗程。
③脐静脉灌注药物活性优化治疗组：30例，亚砷酸注射液，剂量10mg/d；派罗欣
注射液180μg/d；丹参注射液，剂量10ml/d。联合用药qd×21天，间隔4
周重复，总共3个疗程。
3、肿瘤学研究数据分析
3-1、治疗学角度：研究显效率，1、3年生存率，手术切除率、二期手术切除率、负作用反应率。
3-2、从形态学角度：观察肿瘤体积、抑癌率、抑转移率
3-3、基因芯片技术分析：运用肿瘤基因芯片（Biostar-Ⅰ）技术，高通量观察高通 - 13 -
量观察肿瘤凋亡相关基因、癌基因、抑癌基因、肿瘤转移抑制基因等相关基因谱表达，分析差异表达，研究亚砷酸+派罗欣+丹参经脐静脉灌注治疗HCC+ PVTT作用的分子机制。
4、统计学分析
计量资料以χ±S表示，使用 SPSS 10.0统计软件，对计量资料进行他t检验，对计数资料进行R?C表χ2检验，P?0.05认为差异有统计学意义。
二、可行性分析
本课题基于大量临床治疗HCC+ PVTT病例、结合目前本领域研究动向的基础上，采用手术联合药物活性优化经脐静脉贯序治疗HCC+ PVTT新模式，已取得较好的临床疗效（初步得出“HCC+ PVTT临床分组对照实验”的患者的1、3年生存率提高12.4%、7.8%以上）。
为研究规范治疗HCC+PVTT的新策略，通过人肝癌细胞株BEL-7402体外细胞实验、高转移人肝癌裸鼠模型LCI—D20实验和HCC+ PVTT临床分组对照实验的基础和临床系列研究，揭示其治疗作用的机制。针对课题关键问题，在前期预实验中进行研究和解决。通过预实验对BEL-7402细胞的抑制作用呈现明显的剂量效应依赖关系。分析观察两种药物联用在很宽的效应范围内存在协同效应与药物应用的先后顺序是否无关。增加应用IC50法来判定两种药物的联合作用。计算亚砷酸+派罗欣、亚砷酸+丹参和派罗欣+丹参的两两药物合用联合作用指数，均为CI≤1，可推断亚砷酸+派罗欣 +丹参的抗肿瘤细胞的药物活性优化效应。对脐静脉置泵技术进行研究：改进经历手术直视脐静脉植泵，到腹腔镜下辅助脐静脉植泵，再到超声定位下微创脐静脉置泵技术改进。从脐静脉泵皮下留置时间1年，到改进后2年，再到导丝引导下脐静脉泵更换技术后3-5年。从脐静脉再通技术，脐静脉灌注化疗门脉系血流动力学改变等一系列问题进行预实验研究，解决经脐静脉植泵的治疗途径的问题。
总之，通过预实验，对通过人肝癌细胞株BEL-7402体外细胞实验、高转移人肝癌裸鼠模型LCI—D20和临床分组对照实验，基本解决课题关键问题和修改课题研究方案，使课题的研究内容充实、实验方法可靠、技术路线清晰、确保本课题顺利完成的可行性。
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研究进度及完成期限（课题总进度、年度计划进度）
5-1、年度研究计划
1、实验阶段：（20xx年1月—20xx年9月）
第一部分（20xx年1月—20xx年4月）：人肝癌细胞株BEL-7402体外细胞实验，探讨亚砷酸+派罗欣+丹参的药物活性优化方案的抗肿瘤细胞效果。
第二部分（20xx年6月—20xx年8月）：高转移人肝癌裸鼠模型LCI—D20实验，探讨亚砷酸+派罗欣+丹参的药物活性优化抗肿瘤的机制。
第三部分（20xx年度-20xx年9月）：HCC+ PVTT临床分组对照实验，探讨药物活性优化经脐静脉治疗HCC+PVTT的治疗作用的机制。
2、统计分析研究阶段：（20xx年9月-20xx年12月）
数据以X±S表示，使用 SPSS 13.0统计软件处理。阐述本课题采用手术联合药物活性优化经脐静脉贯序治疗HCC+ PVTT新模式的作用机制。
实现本课题目标已具备的条件和基础（1.过去的研究工作基础；2.已有或可否借用的主要实验设备；3.已经或可能进行的预试验或实验；4.现有研究技术力量）
1、工作基础
1-1、前期研究：近年来在“恶性梗阻性黄疸模型的建立及评价”研究的基础上，开展“丹参在肝癌致梗阻性黄疸时对肿瘤血管形成作用的研究”，发表了“肝癌浸润转移机制研究的新进展” 等国家级核心刊物论文12篇，因“丹参对肝癌致恶性梗阻性黄疸治疗作用实验研究”课题，获20xx年度全国医学优秀学术成果一等奖。
20xx年采用肝癌切除+脐静脉植泵灌注治疗原发性肝癌获得成功（健康报20xx年6月2日第三版登载），随即开展超声定位下脐静脉置泵灌注治疗原发性肝癌以及亚砷酸经脐静脉灌注治疗肝癌方面取得成效。20xx年主持河南省科技厅的科技攻关项目“肝癌切除加脐静脉植泵灌注治疗原发性肝癌的临床研究”。20xx年主持省教育厅科技攻关项目“超声定位下脐静脉置泵灌注亚砷酸治疗原发性肝癌临床研究”。20xx年主持河南省卫生厅医学科技攻关计划项目“基因芯片对亚砷酸经脐静脉灌注治疗原发性肝癌分子机制的研究”。
1-2、本课题研究的预实验：解决课题的关键问题。调整了“人肝癌细胞株BEL-7402体外细胞实验”各实验组药物剂量浓度，亚砷酸治疗组的浓度为10μmol/L、派罗欣治疗组的浓度10μg/L、丹参治疗组浓度0.5mg/L和药物活性优化组的浓度，初步得知亚砷酸+派罗欣+丹参联合可达到抗癌药物活性的优化。确定了“高转移人肝癌裸鼠模型LCI—D20”的各实验组药物剂量和研究肿瘤发展影响的四个检测指标PCNA、VEGF、ICAM-1 - 15 - —
和 Apoptosis Index和检测的方法；初步得出“HCC+ PVTT临床分组对照实验”的患者的1、3年生存率提高12.4%、7.8%以上；同时减少了全身化疗反应，负作用反应率明显降低的。预实验检测数据与基本符合临床实践的结果，预实验阶段已取得成效，为本课题实验顺利实施提供有力保证。
2、工作条件
以河南大学消化疾病研究所、肿瘤实验室以及病理实验室的公共实验设备为平台。通过河南大学天然药物研究所、医学分子生物学实验室和河南大学植物逆境重点实验室进行交叉学科协作。已具备各类病理学和实验技术，陆续开展免疫组化检查，ELISA法检测血液中VEGF及ICAM-1的含量，流式细胞仪检测凋亡细胞技术等。熟练掌握细胞体外培养技术和动物实验模型制作。
完成本课题尚缺乏的主要条件和基础
点样仪（Cartesion）、扫描仪（Scanarray 4000）和图像处理软件（Gene Pix Pro3）均有河南大学植物逆境重点实验室提供。
DNA抽取，探针的制备，芯片杂交及洗涤，扫描分析结果均有河南大学医学分子生物学实验室和河南大学消化疾病研究所完成。肿瘤基因芯片（Biostar-Ⅰ）有上海博星基因芯片责任有限公司购进。
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申请者和主要合作者情况（1.申请者和主要合作者已承担其它研究任务、经费来源以及能用于本课题的时间；2.申请者和主要合作者近3年内发表的与本课题有关的主要论文、著作和科研成果名称。按人填写，注明发表于何时、何刊物）
1、申请人简历
夏荣龙副教授、医学博士、主任医师、硕士生导师。国际肝胆胰协会中国分会外科委员，河南省微创外科学会学术委员，开封市医学会普外科专业副主任委员，中国现代外科学杂志编委。
19xx年毕业于宁夏医学院医疗系，获学士学位。20xx年毕业于西安交通大学医学院肝胆外科专业，获外科学硕士学位。 20xx年毕业于华中科技大学同济医学院肝胆外科专业，获外科学博士学位。
近年来开展“恶性梗阻性黄疸模型的建立及评价”的基础上，完成“丹参在肝癌致梗阻性黄疸时对肿瘤血管形成作用的研究”科研项目，发表了“肝癌浸润转移机制研究的新进展” 等国家级核心刊物论文12篇。针对豫东地区肝炎、肝硬化和肝癌相对高发的特点，目前致力于利用多学科协作综合治疗肝癌和药物活性优化经脐静脉治疗HCC+PVTT的基础与临床研究，并获得省部级科研项目2项，省卫生厅和教育厅科研项目3项。
㈠ 代表性论文
［1］XIA RongLong , CHEN XiaoPing . The effects of Danshen injection on the
malignant obstructive jaundice in the SD rat model ［J］.Journal of Huazhong University of Science and Technology ［Med Sci］2006，26 (5): 436-439 ［2］夏荣龙，陈孝平.丹参在大鼠恶性梗阻性黄疸时对肿瘤细胞凋亡的作用［J］.第四
军医大学学报2006，27（19）：1802-1804.
［3］夏荣龙，陈孝平.丹参对肝癌致梗阻性黄疸对VEGF表达的影响［J］.第四军医大学
学报.2005，26（18）：1673-1676
［4］夏荣龙，刘青光，潘承恩.肝癌致梗阻性黄疸时丹参ICAM-1表达的影响［J］.第四
军医大学学报. 2005，26（13）：1216-1218.
［5］夏荣龙，刘青光，潘承恩.丹参对肝癌致鼠梗阻性黄疸对PCNA表达的影响 ［J］.
西安交通大学学报(医学版).2004，25（3）：247-249
㈡ 代表性科研
［1］“肝癌原位切除+脐静脉灌注治疗原发性肝癌的临床研究”（NO：0524410077），河南 - 17 -
省科技厅科技攻关项目，夏荣龙主持。
［2］“超声定位下，脐静脉置泵灌注亚砷酸治疗原发性肝癌临床研究”（NO：2006320003）
河南省教育厅自然科学基金项目立项，夏荣龙主持。
［3］“基因芯片对亚砷酸经脐静脉灌注治疗原发性肝癌及分子机制的研究” 河南省卫生
厅医学科技攻关计划项目（NO：2006100），夏荣龙主持。
［4］丹参在肝癌致梗阻性黄疸时对肿瘤血管形成作用的研究，河南大学重点项目（NO：
042DZR011），夏荣龙主持。
㈢ 代表性获奖成果
［1］丹参对恶性梗阻性黄疸治疗作用的试验研究（20xx年度全国医学优秀学术成果一等
奖，主持人）
［2］胃粘膜延长成型食管与胃吻合动物实验和临床研究（20xx年度河南省科技进步二等
奖，主持人）
2、主要合作者
段永建、副主任医师、硕士生导师，现任河南大学第一附属医院肿瘤科、放疗科主任 中华医学会河南省肿瘤放疗学会委员。
㈠ 代表性论文
［1］介入治疗加三维适行放射治疗原发性肝癌的探讨 中国现代医学杂志，2005，15（13）
2015~2017
［2］食管癌后程加速超分割放射治疗同步化疗的远期疗效 第四军医大学学报，2007，
28（18）1690~1692
［3］三维适行放射治疗食管癌的临床研究 中国现代医学杂志，2006，16（23）3580~3582
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项目考核目标（预期达到的技术、经济指标）
㈠ 预期达到的目标
1、通过体外细胞实验，检测肝癌细胞增殖、凋亡和细胞分化等指标，探讨亚砷酸+派罗欣+丹参的抗HCC细胞药物活性优化的效果。
2、通过裸鼠肝癌的模型，从形态学观察肿瘤体积、抑癌率、抑转移率和从肿瘤学研究肝癌增殖能力、肝癌细胞凋亡、肿瘤血管形成和肝癌转移倾向, 探讨药物活性优化对HCC发展的影响。
3、通过临床分组实验，从治疗学研究其显效率，1、3年生存率，二期手术切除率及负作用反应率和从基因学角度运用基因芯片技术高通量观察肿瘤相关基因谱差异性表达，揭示手术联合药物活性优化经脐静脉治疗HCC+PVTT的作用机制
总之，本课题采用手术联合药物活性优化经脐静脉植泵治疗HCC+ PVTT新模式，研究规范治疗HCC+PVTT的新策略。
㈡ 预期研究结果
1、肝癌切除+门静脉切开取癌栓术联合药物活性优化经脐静脉治疗HCC+PVTT的作用机制；
2、发表国家级核心期刊3篇，申报省级科技进步奖1项，积极转化科研成果；
3、培养研究生2名。
项目实施的组织管理措施
1、本项目实行项目负责人责任制，分工协作，统一管理。
2、采用预实验研究，制定规范、标准的研究计划。遴选病例的临床手术，临床检查，标本的病理，采用统一标准。
3、实施病人治疗知情同意书制度，加强医疗规范化管理。
4、成立项目专家组，定期复查、及时修正研究计划，确保项目实施完成。
5、多方努力，保证对研究计划实施所需的人力、财力和工作时间等条件的要求。
6、加强学术交流，确保本项目的原创性、科学性和发展性。
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申请经费预算 金额单位：万元
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查新报告、参考文献目录
一、查新报告结论：
1.已检出采用静脉滴注亚砷酸或经肝动脉灌注化疗的方法治疗原发性肝癌和亚砷酸促
使肝癌细胞凋亡的文献报道。
2. 已检出运用基因芯片技术观察原发性肝癌细胞基因谱表达以深入研究作用机制的
文献报道。
3.未检出亚砷酸经脐静脉灌注治疗原发性肝癌并观察肿瘤体积、肝脏生化指标、肝癌标志物和肝癌组织中PCNA表达的文献报道。
4.未检出应用基因芯片技术对亚砷酸经脐静脉灌注治疗原发性肝癌机制研究的文献报
道。
二、参考文献目录
［1］ Sugimoto C, Saito A, Kikuzato M, et al. Angioechographic evaluation of tumor thrombi and
the effect of transcatheter arterial embolization in patients with hepatocellular carcinoma［J］. Gastroenterol,2002,37:363-368.
［2］ Minagawa M, Makuuchi M, Takayama T, et al. Selection criteria for hepatectomy in patients
with hepatocellular carcinoma and portal vein tumor thrombus［J］.Ann Surg,2001,233:379-384.
［3］Smyrniotis V, Theodoraki K, Arkadopoulos N, et al . Ischemic preconditioning versus
intermittent vascular occlusion in liver resections performed under selective vascular exclusion: a prospective randomized study. Am J Surg［J］. 2006 Nov;192(5):669-74. ［4］Qin HX, Nan KJ,Yang G,et al. Expression and clinical significance of TAp73alpha, p53, PCNA
and apoptosis in hepatocellular carcinoma. World J Gastroenterol［J］. 2005, May 14;11(18):2709-13.
［5］Shiraki K, Fujikawa K, Sugimoto K, et al. Cellular apoptosis susceptibility protein and
proliferation in human hepatocellular carcinoma.Int J Mol Med［J］. 2006, 18(1):77-81. ［6］Yancopoulos GD, Davis S, Gale NW, et al. Vascular-specific growth factors and blood vessel
formation［J］. Nature,2000,407:242-248.
［7］Moriyama M, Matsumura H, Shioda J, et al . Measurement of human intercellular adhesion
molecule 1 in the blood is useful for predicting the occurrence of hepatocellular carcinomas from chronic hepatitis C and liver cirrhosis. Intervirology［J］. 2006, 49(6):327-38. ［8］Kida Y, Tsuji-Kawahara S, Ostapenko V, et al . Increased liver temperature efficiently
augments human cellular immune response: T-cell activation and possible monocyte translocation. Cancer Immunol Immunother［J］. 2006 Dec;55(12):1459-69.
［9］陈孝平、裘法祖、吴在德等，肝细胞癌门静脉癌栓形成的分子生物学机制研究。中华实验外科杂志［J］，2005，22（9）：1056-1058
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［10］Chen XP, Huang ZY. Surgical treatment of hepatocellular carcinoma in china Surgical
techniques, indications, and outcomes［J］. Langenbecks Arch Surg, 2005,390:259-265. ［11］Lin CC, Hsu C, Hsu CH, et al. Arsenic trioxide in patients with hepatocellular carcinoma:
a phase II trial. Invest New Drugs［J］. 2007, 25(1):77-84.
［12］Bukowski RW, Tendler C, Cutler D, ae al.Treating cancer with PEG- Intron: Pharmacokinetic
profile and dosing guidelines for an improved interferon-alpha-2b formulation［J］.Cancer 2002,95:389-396
［13］ XIA RongLong , CHEN XiaoPing . The effects of Danshen injection on the malignant
obstructive jaundice in the SD rat model ［J］.Journal of Huazhong University of Science and Technology ［Med Sci］2006，26 (5): 436-439
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申请者所在单位学术委员会意见（包括学术意义、应用价值、学术思想有何创新、研究技术路线是否可行、研究实力是否具备、预期目标能否达到等）
实验课题立意新颖，研究内容充实、实验方法可靠、设计严密、技术路线清晰，密切结合临床，属原创性科研，具有独到之处。
探讨有效地预防及治疗HCC+PVTT的新策略，预期临床意义深远。易于推广，可转化为成果，势必产生不可估量经济效益和社会效益。
课题组前期研究内容充分，预实验对课题有大量修改和论证，确保本课题顺利完成的可行性。
本项目组主要成员知识结构良好，临床经验丰富，，科研水平高，人员组成合理。从事医、教、研工作十多年，合作完成多项科研任务，能达到预期目标。
学术委员会主任委员（签章）
年 月 日
申请者所在单位意见（包括经费预算是否合理、有无其它经费来源、能否保证人力、物力、工作时间等基本条件并监督研究计划的实施）
已对申请人进行了资格审查，对申请书内容进行了审核，同意学术委员会的审查意见，并保证在项目获得资助后做到以下几点：
1、 保证对研究计划实施所需的人力、物力和工作时间等条件给予支持；
2、 严格遵守河南省医学科技攻关项目管理、财务等各项规定；
3、 督促项目负责人和本单位项目管理部门按河南省医学科技攻关项目的规定及时报送有关报表和材料。
单位（盖章）
负责人（签章）
年 月 日
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省辖市卫生局意见（医学高等院校、厅直医疗卫生单位不填此栏）
单位（盖章）
负责人（签章）
年 月 日
协作单位意见（应说明是否同意参加协作，能否保证协作人员工作时间和提供必要的条件）
协作单位（盖章）
负责人（签章）
年 月 日
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学术评审委员会或同行评审意见
（盖章）
年 月 日
河南省卫生厅审核意见
（盖章）
年 月 日
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