柱层析知识总结
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柱层析
利用层析柱将混合物各组分分离开来的操作过程称为柱层析。柱层析是层析技术中的一类，依据其作用原理又可分为吸附柱层析、分配柱层和离子交换柱层析等。其中以吸附柱层析应用最广。以下只介绍吸附柱层析的相关问题，其操作方法也可作为其他类型柱层析的参考。
1.吸附柱层析的器材
(1)层析柱
实验室中所用的玻璃层析柱有两种形式：一是下部带有活塞的玻璃管，活塞的芯最好是聚四氟乙烯制作的，这样可以不涂真空油脂，以免污染产品。如果使用普通的玻璃活塞，则真空油脂要小心地涂薄涂匀。另一种是将玻璃管下端拉细，套上一段弹性良好的管子。这段管子必须是不能被淋洗剂溶解的，普通橡皮管一般不可充作此用，因为橡皮易被氯仿、苯、THF等溶剂溶胀，而聚乙烯管子对大多数溶剂是惰性的，所以常常使用。用一只螺旋夹控制流速，此外，薄膜塑料柱因使用方便、节省淋洗剂、减少蒸发量等优点，应用日趋广泛。薄膜塑料柱总是以扁平成卷保存的，两侧常有很深的折痕。使用前需将裁取的一段薄膜管一端扎紧，另一端套在一段玻璃管上并用棉线扎紧。将这段玻璃管穿过一个单孔塞。然后将薄膜管放进一根又粗又长，下端拉细了的玻璃管内，使塞子塞紧大玻璃管的口。用水泵自大玻璃管下端抽气，薄膜柱即因内部压强大于外部而自行展圆。待装入吸附剂后在其下部扎几个小孔即可使用。
层析柱的尺寸根据被分离物的量来确定，其直径与高度之比则根据被分离混合物的分离难易而定，一般在1∶8到1∶50之间。柱身细长，分离效果好，但可分离的量小，且分离所需时间长；柱身短粗，分离效果较差，但一次可以分离较多的样品，且所需时间短。如果待分离物各组分较难分离，宜选用细长的柱子，如果要处理大量的较易分离的或对分离纯度要求较低的混合物，则可选用粗而短的柱子。最常使用的层析柱，直径与长度之比在1∶8 到1∶15 之间。
(2)吸附剂
柱层析中最常使用的吸附剂是氧化铝或硅胶。其用量为被分离样品的30～50倍，对于难以分离的混合物，吸附剂的用量可达100倍或更高。对于吸附剂应综合考虑其种类、酸碱性、粒度及活性等因素，最后用实验方法选择和确定。
市售氧化铝有酸性、碱性和中性之分。酸性氧化铝是用1%盐酸浸泡后，用蒸馏水洗到其浸出液的pH值为4，适用于分离酸性物质；碱性氧化铝浸出液的pH值为9～10，用以分离胺类、生物碱及其他有机碱性化合物。中性氧化铝的相应pH值为7.5，适合于醛、酮、醌、酯等类化合物的分离以及对酸、碱敏感的其他类型化合物的分离。硅胶没有酸碱性之分，可适用于各类有机物的分离。
柱层析所用氧化铝的粒度一般为100～150目，硅胶为60～100目，如果颗粒太小，淋洗剂在其中流动太慢，甚至流不出来。
氧化铝和硅胶的活性各分五个等级。哪个活性级别分离效果最好，要用实验方法确定，而不是盲目选择高的活性级别，最常使用的是Ⅱ～Ⅲ级。如果吸附剂活性太低，分离效果不好，可通过“活化”来提高其活性。所谓“活化”就是指用加热的方法除去吸附剂所含的水分，提高其吸附活性的过程。通常是将吸附剂装在瓷盘里放进烘箱中恒温加热。“活化”的温度和时间应根据分离需要而定。氧化铝一般在200℃恒温4h，硅胶在105～110℃恒温0.5～1h。“活化”完毕，切断电源，待温度降至接近室温时，从烘箱中取出放进干燥器中备用。有的样品在活性高的吸附剂中分离效果不好，可将吸附剂放在空气中让其吸收一些水分，分离效果反而好一些。
此外，一些天然产物带有多种官能团，对微弱的酸碱性都很敏感，则可用纤维素、淀粉或糖类作吸附剂。活性碳是一种吸附能力很高的吸附剂，但因粒度太小而不常用。
(3)淋洗剂
淋洗剂是将被分离物从吸附剂上洗脱下来所用的溶剂，所以也称为洗脱剂或简称溶剂。其极性大小和对被分离物各组分的溶解度大小对于分离效果非常重要。如果淋洗剂的极性远大于被分离物的极性，则淋洗剂将受到吸附剂的强烈吸附，从而将原来被吸附的待分离物“顶替”下来，随多余的淋洗剂冲下而起不到分离作用；如果淋洗剂的极性远小于各组分的极性，则各组分被吸附剂强烈吸附而留在固定相中，不能随流动相向下移动，也不能达到分离的目的。如果淋洗剂对于被分离物各组分溶解度太大，被分离物将会过多、过快地溶解于其中并被迅速洗脱而不能很好地分离；如果溶解度太小，则会造成谱带分散，甚至完全不能分开。常用溶剂的极性大小次序也因所用吸附剂的种类不同而不尽相同，很多资料给出了在硅胶和氧化铝柱中常用溶剂所表现出的极性次序，可作为选择溶剂的参考，首先在薄层层析板上试选，初步确定后再上柱分离。如果所有色带都行进甚慢则应改用极性较大溶解性能也较大的溶剂，反之则改用极性和溶解性都较小的溶剂，直至获得满意的分离效果。
除了分离效果外还应当考虑：①在常温至沸点的温度范围内可与被分离物长期共存不发生任何化学反应，也不被吸附剂或被分离物催化而发生自身的化学反应；②沸点较低以利回收；③毒性较小，操作安全；④适当考虑价格是否合算，来源是否方便；⑤回收溶剂一般不应作为最终纯化产物的淋洗剂。
淋洗剂的用量往往较大，故最好使用单一溶剂以利回收。只有在选不出合适的单一溶剂时才使用混合溶剂。混合溶剂一般由两种可以无限混溶的溶剂组成，先以不同的配比在薄层板上试验，选出最佳配比，再按该比例配制好，像单一溶剂一样使用。如果必须在层析过程中改变淋洗剂的极性，不能把一种溶剂迅速换成另一种溶剂，而应当将极性稍大的溶剂按一定的百分率逐渐加到正在使用的溶剂中去，逐步提高其比例，直至所需要的配比。一条经验规律称为“幂指数增加”，例如，原淋洗剂为环己烷，如欲加入二氯甲烷以增加其极性，则不应立即换为二氯甲烷，而应使用这两种溶剂的混合液，其中二氯甲烷的比例依次为5%，15%，45%，最后再换为纯净的二氯甲烷。每次加大比例后，须待流出液量为吸附剂装载体积的3倍时再进一步加大比例。这只是一般方法，其目的在于避免后面的色带行进过快，追上前面的色带，造成交叉带。但如果两色带间有很宽阔的空白带，不会造成交叉，则亦可直
接换成后一种溶剂，所以应根据具体情况灵活运用。
(4)被分离的混合物
在实际工作中，被分离的样品是不能选择的，但认真考察各个组分的分子结构，估计其吸附能力，对于正确选择吸附剂和淋洗剂都是有益的。若化合物的极性较大，或含有极性较大的基团，则易被吸附而较难被洗脱，宜选用吸附力较弱的吸附剂和极性较大的淋洗剂。反之，对于极性较小的样品则选用极性较强的吸附剂和弱极性或非极性淋洗剂。若各组分极性差别较大，则易于分离，可选用较为短粗的柱子，使用较少的吸附剂；若各组分极性相差甚微，则难于分离，宜选用细长的柱子并使用较大量的吸附剂。
(5)其他物品
储存淋洗剂的分液漏斗一只，接收洗出液的锥形瓶若干只，其容积大小根据淋洗剂的体积确定。玻璃毛少量，白沙少量，各自洗净烘干。若层析柱很小，也可用少量脱脂棉代替玻璃毛。
2.吸附柱层析的操作
(1)装柱
装柱的方法分湿法和干法两种。
湿法装柱时，将柱竖直固定在铁支架上，关闭活塞，加入选定的淋洗剂至柱容积的1/4 ，用一支干净的玻璃棒将少量玻璃毛(或脱脂棉)轻轻推入柱底狭窄部位，小心挤出其中的气泡，但不要压得太紧密，否则淋洗剂将流出太慢或根本流不出来。将准备好的白沙加入柱中，使在玻璃毛上均匀沉积成约5mm厚的一层。将需要量的吸附剂置烧杯中，加淋洗剂浸润，溶胀并调成糊状。打开柱下活塞调节流出速度为每秒钟1滴，将调好的吸附剂在搅拌下自柱顶缓缓注入柱中，同时用套有橡皮管的玻璃棒轻轻敲击柱身，使吸附剂在淋洗剂中均匀沉降，形成均匀紧密的吸附剂柱。吸附剂最好一次加完。若分数次加，则会沉积为数层，各层交接处的吸附剂颗粒甚细，在分离时易被误认为是一个色层。全部吸附剂加完后，在吸附剂沉积面上盖一层白沙(如柱很小，也可不用白沙而盖上一张直径与柱内径相当的滤纸片)，关闭活塞。在全部装柱过程及装完柱后，都需始终保持吸附剂上面有一段液柱，否则将会有空气进入吸附剂，在其中形成气泡而影响分离效果。如果发现柱中已经形成了气泡，应设法排除，若不能排除，则应倒出重装。装好的吸附柱各层材料的分布见图3-36。
干法装柱时，先将柱竖直固定在铁支架上，关闭活塞。加入溶剂至柱容积的3/4，打开活塞控制溶剂流速为1滴/秒，然后将所需量的吸附剂通过一支短颈玻璃漏斗慢慢加入柱中，同时，轻轻敲柱身使柱填充紧密。干法装柱的缺点是容易使柱中混有气泡。特别是使用硅胶为吸附剂时，最好不用干法装柱，因为硅胶在溶剂中有一溶胀过程，若采用干法装柱，硅胶会在柱中溶胀，往往留下缝隙和气泡，影响分离效果，甚至需要重新装柱。
装填薄膜塑料柱时，可先用抽气法将薄膜展开成圆柱形，在底部装入一段玻璃毛，吸附剂通过一个粗颈漏斗自柱顶装入。装至1/3处，将柱身在坚硬的表面上礅结实，再装入1/3，
再礅结实，直至装到需要的高度。装成的薄膜柱应紧密结实，可以像玻璃柱那样用夹子夹住，再在其底部扎一些小孔即可使用。(2)加样
加样亦有干法、湿法两种。湿法加样是将待分离物溶于尽可能少的溶剂中，如有不溶性杂质应当滤去。打开柱下活塞小心放出柱中液体至液面下降到滤纸片处，关闭活塞，将配好的溶液沿着柱内壁缓缓加入，切记勿冲动吸附剂，否则将造成吸附剂表面不平而影响分离效果。溶液加完后，小心开启柱下活塞，放出液体至溶液液面降至滤纸片时，关闭活塞，用少许溶剂冲洗柱内壁(同样不可冲动吸附剂)，再放出液体至液面降到滤纸处，再次冲洗柱内壁，直至柱壁和柱顶溶剂没有颜色。加样操作的关键是要避免样品溶液被冲稀。在技术熟练的情况下，也可以不关下部活塞，在每秒钟1滴的恒定流速下连贯地完成上述操作。
干法加样是将待分离样品加少量低沸点溶剂溶解，再加入约5倍量吸附剂，拌和均匀后在通风橱中蒸发至干。揭去柱顶滤纸片，将吸附了样品的吸附剂平摊在柱内吸附剂的顶端，在上面加盖滤纸片或加盖一层白沙。干法加样易于掌握，不会造成样品溶液的冲稀，但不适合对热敏感的化合物。
(3)淋洗和接收
样品加入后即可用大量淋洗剂淋洗。随着流动相向下移动，混合物逐渐分成若干个不同的色带，继续淋洗，各色带间距离拉开，最终被一个个淋洗下来。当第一色带开始流出时，更换接收瓶，接收完毕再更换接受瓶，接受两色带间的空白带，并依此法分别接收各个色带。若后面的色带下行太慢，可依次使用几种极性逐渐增大的淋洗剂来淋洗。为了减少添加淋洗剂的次数，可用分液漏斗在柱顶“自动”添加。分液漏斗的活塞打开，顶塞密封，尾部插进柱上部的淋洗剂液面以下，当液面下降后，漏斗尾部露出，即有空气泡自尾部进入分液漏斗，这就加大了漏斗内液面上的压力，漏斗内的淋洗剂就自动流入柱内，使柱内液面上升，当液面淹没漏斗尾部时，就不再有空气进入漏斗，漏斗内的淋洗剂就不再流出。在使用薄膜塑料柱进行层析时，一旦色带形成并拉开距离，可将柱吸干，用刀沿“空白带”处切开，将各色带分别萃取，各自蒸去溶剂，即得到相应组分的化合物。
(4)显色
分离无色物质时需要显色。如果使用带萤光的吸附剂，可在黑暗的环境中用紫外光照射以显出各色带的位置，以便按色带分别接收。但柱上显色远不如在薄层板上显色方便。所以常用的办法是等分接收，即事先准备十几个甚至几十个接收瓶，依次编出号码，各接收相同体积的流出液，并各自在薄层板上点样展开，然后在薄层板上显色(相关的显色操作见薄层层析部分)。具有相同Rｆ值的为同一组分，可以合并处理。也可能出现交叉带，若交叉带很少，可以弃之，若交叉带较多，或样品很贵重，可以将交叉部分再次作柱层析分离，直至完全分开。
3.柱层析操作中应注意的问题
(1)要控制淋洗剂流出的速度。一般控制流速为1滴/秒。若流速太快，样品在柱中的吸附和溶解过程来不及达到平衡，影响分离效果。若流速太慢，分离时间会拖得太长。有时，
样品在柱中停留时间过长，可能促成某些成分发生变化。或流动相在柱中下行速度小于样品的扩散速度，会造成色带加宽、交合甚至根本不能分离。
(2)以下现象会严重影响分离效果，必须尽力避免。
a.色带过宽，界限不清。造成的原因可能是柱的直径与高度比选择不当，或吸附剂、淋洗剂选择不当，或样品在柱中停留时间过长。但更常见的却是在加样时造成的。若在样品溶液加进柱中后，没有打开下部活塞放出淋洗剂使样品溶液降至滤纸片处，即急于加溶剂冲洗柱壁，造成样品溶液大幅度稀释，或过早加大量溶剂淋洗，必然会造成色带过宽。所以溶样时一定要使用尽可能少的溶剂，加样时一定要避免样品溶液的稀释。
b.色带倾斜。正常情况下柱中的色带应是水平的，而倾斜的色带，在前一个色带尚未完全流出时，后面色带的前沿已开始流出，所以不能接收到纯粹的单一组分。造成色带倾斜的原因是吸附剂的顶面装得倾斜，或柱身安装得不垂直。
c.气泡。造成气泡的原因可能是玻璃毛或脱脂棉中的空气未挤净，其后升入吸附剂中形成气泡，也可能是吸附剂未充分浸润溶胀，在柱中与淋洗剂作用发热而形成，但更大量的是在装柱或淋洗过程中淋洗剂放出过快，液面下降到吸附剂沉积面之下，使空气进入吸附剂内部滞留而成。当柱内有气泡时，大量淋洗剂顺气泡外壁流下，在气泡下方形成沟流，使后一色带前沿的一部分突出伸入前一色带，从而使两色带难于分离。所以在装柱及淋洗过程中应始终保持吸附剂上面有一段液柱。
d.柱顶面填装不平。这时色带前沿将沿低凹处向下延伸进入前面的色带，这也是一种沟流。
e.断层和裂缝。当柱内某一区域内积有较多气泡时，这些气泡会合并起来在柱内形成断层或裂缝。裂缝造成的沟流，而断层相当于一个不平整的装载面。
1语源学2类别3基本原理4几种常用的层析
语源学
chrome意为“色彩”，graphy源自希腊文，意为“写”。色谱为层析的同义语，都是从英语chromatography译来的。
层析（色谱） chromatograpby
在把微细分散的固体或是附着于固体表面的液体作为固定相，把液体（与上述液体不相混合的）或气体作为移动相的系统中，使试料混合物中的各成分边保持向两相分布的平衡状态边移动，利用各成分对固定相亲和力不同所引起的移动速度差，将它们彼此分离开的定性与定量分析方法，称为层析，亦称色谱法。根据移动相种类的不同，分为液体层析、气体层析二种。用作固定相的有矽胶、活性炭、氧化铝、离子交换树脂、离子交换纤维等，或是在硅藻土和纤维素那样的无活性的载体上附着适当的液体，也可使用其他物质。将作为固定相的微细粉末状物质装入细长形圆筒中进行的层析称为柱层析（column chromatogra-phy），在玻璃板上涂上一层薄而均的物质作为固定相的称为薄层层析（thin-layer chromatography），
后者可与用滤纸作为固定相的纸上层析进行同样的分析，即在固定相的一端，点上微量试料，在密闭容器中，使移动相（液体）从此端渗入，移动接近另一端。通过这种展开操作，各成分呈斑点状移动到各自的位置上，再根据Rf值的测定进行鉴定。当斑点不易为肉眼观察时，可利用适当的显色剂，或通过紫外灯下产生荧光的方法进行观察。也可采用在第一种移动相展开后再用另一移动相进行展开（这时的展开方向应与原方向垂直），使各成分分离完全的双相层析（two-dimensional chromatography）。分离后，将斑点位置的固定相切取下来，把其中含有来自试料的物质提取进行定量分析。但为制备与定量，柱层析则更为适宜。在柱层析中，移动相从加入试料的一端展开到达另一端后，继续展开使各成分和移动相一起向柱外分别溶出，这就是广泛使用的所谓洗提层析（elution chromatography）。层析根据固定相与溶质（试料）间亲和力的差异分为吸附型、分配型、离子交换型（离子交换层析）等三种类型。但这并不是很严格的，有时常见到其中间类型。此外，近来也应用亲和层析，即将与基质类似的化合物（通常为共价键）结合到固定相上，再利用其特异的亲和性沉淀与其对应的特定的酶或蛋白质。
类别
◆按层析的机理划分：
吸附层析、分配层析、离子交换层析、凝胶过滤层析、亲和层析等。
吸附层析：利用吸附剂表面对不同组分吸附性能的差异，达到分离鉴定的目的。 分配层析：利用不同组分在流动相和固定相之间的分配系数不同，使之分离。 离子交换层析：利用不同组分对离子交换剂亲和力的不同。
凝胶层析：利用某些凝胶对于不同分子大小的组分阻滞作用的不同。
◆按流动相与固定相的不同划分：
气相层析、液相层析。这两大类层析是以流动相不同来划分的。如同时区分流动相和固定相，划分为：气固层析、气液层析、液固层析和液液层析等。
◆按操作形式划分：
柱层析、纸层析、薄层层析、高效液相层析等。
柱层析：将固定相装于柱内，使样品沿一个方向移动而达到分离。
纸层析：用滤纸做液体的载体，点样后，用流动相展开，以达到分离鉴定的目的。 薄层层析：将适当粒度的吸附剂铺成薄层，以纸层析类似的方法进行物质的分离和鉴定。 以上划分无严格界限，有些名称相互交叉，如亲和层析应属于一种特殊的吸附层析，纸层析是一种分配层析，柱层析可做各种层析。
基本原理
层析须在两相系统间进行。一相是固定相，需支持物，是固体或液体。另一相为流动相，是液体或气体。当流动相流经固定相时，被分离物质在两相间的分配，由平衡状态到失去平衡到又恢复平衡，即不断经历吸附和解吸的过程。随着流动相不断向前流动，被分离物质间出现向前移动的速率差异，由开始的单一区带逐渐分离出许多区带，这个过程叫展层。 系数K是物质在两相中的浓度比。K值大，则在固定相中吸附牢，K值小吸附差。各物质间的K值差别大，则易被分离。不同类型层析的K值含义不同，可视为吸附平衡常数，分配常数或离子交换常数等。
研究层析现象而发展的塔板理论，与有机化学实验中的分馏法原理有些相似。被分馏的有机溶剂在分馏柱内的填充物上形成许多热交换层，从而把低沸点溶剂先分馏出来，达到纯化的目的。在层析时用理论塔板数n来衡量层析效能。
tR为物质在层析柱上的保留时间，W为洗脱下来的物质峰形的宽度。n值愈大表示层析柱的效能愈高。如用理论塔板高度H表示，则包含了层析柱长度的因子。
式中L为层析柱的柱长。H值越大，则柱效越低。
此外影响层析分离效果的还有涡流扩散、纵向扩散和传质阻抗等因素。因此选择层析固定相支持物的粒度、均匀度等物理性能，流动相的层析系统和温度等都是做好层析的关键。 几种常用的层析
◆吸附层析
吸附剂的吸附力强弱，是由能否有效地接受或供给电子，或提供和接受活泼氢来决定。被吸附物的化学结构如与吸附剂有相似的电子特性，吸附就更牢固。常用吸附剂的吸附力的强弱顺序为：活性炭、氧化铝、硅胶、氧化镁、碳酸钙、磷酸钙、石膏、纤维素、淀粉和糖等。以活性炭的吸附力最强。吸附剂在使用前须先用加热脱水等方法活化。大多数吸附剂遇水即钝化，因此吸附层析大多用于能溶于有机溶剂的有机化合物的分离，较少用于无机化合物。洗脱溶剂的解析能力的强弱顺序是：醋酸、水、甲醇、乙醇、丙酮、乙酸乙酯、醚、氯仿、苯、四氯化碳和己烷等。为了能得到较好的分离效果，常用两种或数种不同强度的溶剂按一定比例混合，得到合适洗脱能力的溶剂系统，以获得最佳分离效果。
◆分配层析
在支持物上形成部分互溶的两相系统。一般是水相和有机溶剂相。常用支持物是硅胶、纤维素和淀粉等，这些亲水物质能储留相当量的水。被分离物质在两相中都能溶解，但分配比率不同，展层时就会形成以不同速度向前移动的区带。
◆离子交换层析
支持物是人工交联的带有能解离基团的有机高分子，如离子交换树脂、离子交换纤维素、离子交换凝胶等。带阳离子基团的，如磺酸基（—SO3H）、羧甲基（—CH2COOH）和磷酸基等为阳离子交换剂。带阴离子基团的，如DEAE—（二乙基胺乙基）和QAE—（四级胺乙基）等为阴离子交换剂。离子交换层析只适用于能在水中解离的化合物，包括有机物和无机物。对于蛋白质、核酸、氨基酸及核苷酸的分离分析有极好的分辨力。离子交换基团在水溶液中解离后，能吸引水中被分离物的离子，各种物质在离子交换剂上的离子浓度与周围溶液的离子浓度保持平衡状态，各种离子有不同的交换常数，K值愈高，被吸附愈牢。洗脱时，增加溶液的离子强度，如改变pH，增加盐浓度，离子被取代而解吸下来。洗脱过程中，按K值不同，分成不同的区带。
◆凝胶过滤层析
支持物是人工合成的交联高聚物，在水中膨胀后成为凝胶。凝胶内为内水层，凝胶周围的水为外水层。控制交联度以形成不同孔径的网状结构。交联度小的孔径大，交联度大的孔径小。凝胶只允许被分离物质中小于孔径的分子进入，大于孔径的分子被排斥在外水层，最先被洗脱下来。而进入孔径的分子也按分子量大小大致分离成不同的区带。选择不同规格的凝胶，可把一个混合物按分子量的差异分成不同的组分。这种方法曾被称为分子筛。目前常用的凝胶商品有：葡聚糖凝胶（sephadex）、聚丙烯酰胺凝胶（bio-gel）、琼脂糖凝胶（sepharose）和聚苯乙烯凝胶（styragel）等。
◆亲和层析
在一对有专一的相互作用的物质中，把其中之一联结在支持物上，用于纯化相对的另一物质。常见的亲和对如：酶和抑制剂，抗原和抗体，激素和受体等。支持物为琼脂糖或纤维素等。
◆气相层析
属于分配层析或吸附层析，仅适用于分析分离挥发性和低挥发性物质。固定相是在惰性支持物（如磨细的耐火砖）上覆盖一层高沸点液体，如硅油、高沸点石蜡和油脂、环氧类聚合物。外涂层约为支持物重量的20％。分析时操作温度范围，一般从室温到200℃。特殊的层析柱能达到500℃。流动相常用氦、氩或氮为展层气体。气相层析分离的区带十分清晰，是由于挥发性物质在两相间能很快达到平衡，所需分析时间大为缩短，一般为数分钟至10
余分钟。检测记录系统绘出的各峰是测定流出气体电阻变化的结果，因而测定样品量可到微克和毫微克水平。具有快速、灵敏和微量的优点。气相层析也能用于分离制备样品，但需增加将流出气体通过冷冻将分离物回收的装置。
◆纸层析
以滤纸为支持物的分配层析。组成滤纸的纤维素是亲水物质，能形成水相和展层溶剂的两相系统，被分离物质在两相中的分配保持平衡关系。纸层析用于分析简单的混合物时可做单向层析。对于复杂的混合物，可做双向层析。19xx年A．J．P．马丁第一次用纸层析分析氨基酸，得到很好的分离效果，开创了近代层析的发展和应用的新局面。70年代以后，纸层析已逐渐为其他分辨力更高、速度更快和更微量化的新方法，如离子交换层析、薄层层析、高效液相层析等所代替。
◆薄层层析
在玻璃片、金属箔或塑料片上铺上一层约1～2毫米的支持物，如纤维素、硅胶、离子交换剂、氧化铝或聚酰胺等，根据需要做不同类型的层析。聚酰胺薄膜是一种特异的薄层，将尼龙溶解于浓甲酸中，涂在涤纶片基上，当甲酸挥发后，在涤纶片基上形成一层多孔的薄膜，其分辨力超过了用尼龙粉铺成的薄层。薄层层析较纸层析优越在于分辨高，展层时间短。例如用纸层析做氨基酸分析，往往需要两天时间，而且对层析条件要求严格，不易得到满意的分离效果。如用薄层层析做，一般约需半小时，分离效果更好。薄层层析一般用于定性分析。也能用于定量分析和制备样品。
◆高效液相层析（又名高压液相色谱）
70年代新发展的层析法。其特点是：用高压输液泵，压强最高可达5000psi（相当于34个标准大气压）。用直径约3～10微米的超细支持物装填均匀的不锈钢柱。常用的支持物是在玻璃小珠上涂一层1～2微米的二氧化硅，经硫酰氯反应生成Si—Cl，进一步连接疏水的烷基，如Si—C18H37，或阳离子交换基团—Si（CH2）n—C6H4SO3H，或阴离子交换基团—Si（CH2）nNH2。这种支持物能承受很高的压力，化学性能稳定。用不同类型支持物的HPLC，可做吸附层析、离子交换层析和凝胶过滤层析。其分析微量化可达10-10克水平。但用于制备，可以纯化上克的样品。展层时间短，一般需几分钟到10余分钟。其分析速度、精确度可与气相层析媲美。HPLC适于分析分离不挥发和极性物质。而气相层析只适用于挥发性物质，两者互为补充，都是目前最为理想的层析法。HPLC配有程序控制洗脱溶剂的梯度混合仪，数据处理的积分仪和记录仪等电子系统，成为一种先进的分析仪器，在生物化学、化学、医药学和环境科学的研究中发挥了重要作用。
◆反相层析
在吸附层析中，高极性物质在层析柱上吸附较牢，洗脱时发生拖尾现象和保留时间长的问题。如果在支持物上涂上一层高碳原子的疏水性强的烷烃类，洗脱液用极性强的溶剂，如甲醇和水的混合物。则被分离样品中的极性强的物质不被吸附，最先洗下来，得到较好的分离效果。这种层析法与普通的吸附层析法相反，故称为反相层析。目前用HPLC做反相层析常用的ODS柱，即在支持物的表面上连接了C18H37Si—基团。
◆同系层析
在核酸分析中，将样品经核酸酶部分裂解成不同长度的核苷酸片段，用同位素标记后，在DEAE纤维素薄层上分离，用含有未标记的相同的核苷酸片段作展层溶剂，这样，未标记的核苷酸把标记过的核苷酸推进，使按分子量大小不同把标记核苷酸片段，按由小到大的次序排列，达到分离的目的。于是把这种层析法称为同系层析。同系层析和电泳相结合曾用于寡核苷酸的顺序分析。
纸层析是层析法的一种,要了解纸层法还得从层析法开始.层析法又称色层分析法或色谱法（Chromatography），是一种基于被分离物质的物理、化学及生物学特性的不同，使它们
在某种基质中移动速度不同而进行分离和分析的方法。例如：我们利用物质在溶解度、吸附能力、立体化学特性及分子的大小、带电情况及离子交换、亲和力的大小及特异的生物学反应等方面的差异，使其在流动相与固定相之间的分配系数（或称分配常数）不同，达到彼此分离的目的。
层析法的最大特点是分离效率高，它能分离各种性质极相类似的物质。而且它既可以用于少量物质的分析鉴定，又可用于大量物质的分离纯化制备。因此，作为一种重要的分析分离手段与方法，它广泛地应用于科学研究与工业生产上。现在，它在石油、化工、医药卫生、生物科学、环境科学、农业科学等领域都发挥着十分重要的作用。
层析根据固定相基质的形式分类，层析可以分为纸层析、薄层层析和柱层析。其中纸层析是指以滤纸作为基质的层析。
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