1  目的

     指导工作人员进行ABO血型实验。

2  适用范围

     血型检验岗位工作人员

3  职责

     负责送检标本ABO血型的检测工作。

4  【原理】

ABO血型鉴定,是根据IgM类特异性血型抗体与红细胞膜上特异性抗原结合能出现凝集反应的原理，用已知IgM类特异性标准抗A和抗B血清来测定红细胞上有无相应的A抗原或/和B抗原。同时用已知标准A型红细胞和B型红细胞来测定血清中有无相应的天然IgM类抗A或/和抗B。

【标本】

1． 静脉抗凝或不抗凝血1.5～2.0ml。

【器材】

载玻片、滴管、小试管、台式离心机或微柱凝胶离心机、玻璃棒、蜡笔或记号笔、显微镜等。

【试剂】

1.1 抗-A、抗-B试剂

1.2 5%和10%A、B及O型试剂红细胞盐水悬液

1.3 受检者血清

1.4 受检者5%和10%红细胞盐水悬液

1.5 10mm×60mm透明的玻璃试管或塑料试管

【操作步骤】

   2.1 试管法

2.1.1查抗原：取洁净小试管2支，分别标明抗-A、抗-B，用滴管加入抗-A和抗-B分型血清各 2滴于试管底部,再以滴管分别加入受检者5%红细胞盐水悬液1滴，混匀。

2.1.2查抗体：取洁净小试管3支，分别标明A型、B型和O型细胞。用滴管分别加入受检者血清2滴于试管底部，再分别以滴管加入A、B、O型5%试剂红细胞悬液1滴，混匀。

2.1.3立即1000rpm离心(离心时间为离心机校准时间)。

   2.1.4轻轻摇动试管,使沉于管底的红细胞浮起,先以肉眼观察有无凝集(或溶血)现象,如肉眼观察不见凝集,应将反应物倒于玻片上,再以低倍镜下观察有无凝集。

2.1.5 凝集强度判断标准

        4+=红细胞凝集成一大块,血清清晰透明；

3+=红细胞凝集成几大块,血清尚清晰；

2+=红细胞成中等大凝块,游离红细胞<1/2；

1+=红细胞成小凝集块，游离红细胞>1/2；

±=红细胞成微小凝集块，周围有很多游离红细胞。

MF=混合凝集外观（mixed fieLd）是指镜下可见少数红细胞凝集，而极大多数红细胞仍呈分散分布。

- 表示阴性，镜下未见凝集，红细胞均匀分布。

 2.1.6 报告受检者红细胞ABO血型如下表所示：

ABO血型鉴定结果判断

分型血清＋受检者红细胞  受检者血清＋试剂红细胞

抗-A       抗-B           受检者血型     A细胞     B细胞    O细胞   

＋           －            A            －          ＋       －  

－           ＋            B            ＋          －       －    

－           －            O            ＋          ＋       －   

＋           ＋           AB            －          －       －  

注+为凝集；-为不凝集

2.2 玻片法

2.2.1查抗原：取清洁玻片1张，用记号笔分别标明抗-A、抗-B，用滴管加入抗-A和抗-B分型血清各 1滴于玻片标记相对应处,再以滴管分别加入受检者10%红细胞盐水悬液1滴，混匀。

2.2.2查抗体：取清洁玻片1张，用记号笔分别标明A型、B型和O型细胞。用滴管分别加入受检者血清1滴于玻片标记相对应处，再分别以滴管加入A、B、O型10%试剂红细胞悬液1滴，混匀。

2.2.3将玻片不断轻轻转动，使血清与细胞充分混匀，连续约15min，以肉眼观察有无凝集反应。如肉眼观察不见凝集,应再以低倍镜下观察有无凝集或溶血。

2.2.4 报告受检者红细胞ABO血型如下表所示：

3．微柱凝胶法

（1）标本：同试管法

（2）原理：①人红细胞抗原与相应抗体发生特异性免疫反应（其本质为血凝反应）；②检测系统是在微柱中（载体）将反应介质凝胶（sephdexG-100或50葡聚糖胶）或小玻璃装入微柱中；③凝胶或小玻璃珠的间隙具有分子筛作用。凝集的红细胞（结合的）被留在微柱上面成带状或凝集颗粒散布凝胶中间。未凝集的红细胞（即未结合、游离的）通过离心后沉入微柱的底部；④微柱凝胶中所含的特异性单克隆抗A、抗B试剂检测红细胞上相应的血型抗原，从而鉴定红细胞的血型。

（3）操作：在微柱凝胶检测卡各管中各加入0.5％的红细胞生理盐水悬液1滴（或50µl）；即刻使用微柱凝胶离心机，以1000r/min离心10min，取出观察结果。亦可用全自动血型检测系统直接检测。

（4）结果判断：阳性反应，红细胞抗原与抗体结合使红细胞发生凝集，在离心后浮在凝胶表面或胶中；阴性反应，被检红细胞无相应抗原结合，在离心后红细胞沉于微柱的底部。A孔阳性B孔阴性为A型，A孔阴性B孔阳性为B型，A孔阴性B孔阴性为O型，A孔阳性B孔阳性为AB型。见图6－1。

【注意事项】

1．严格按操作规程操作，认真核对标本并作好标记。

2．所用试管、滴管和玻片必须清洁干净，防止溶血。

3．一般应先加血清，然后再加红细胞悬液，以便容易核实是否漏加血清。

4．抗血清每次使用完后，应放回冰箱保存，以免细菌污染。

5．为了防止冷凝集现象的干扰，一般应在室温下进行试验。

6．严格控制离心速度和时间，防止假阳性或假阴性结果。

7．观察时应注意红细胞呈特异性凝集、继发性凝固以及缗钱状排列的区别。

    8．未用的微柱凝胶免疫检测卡应入室温保存，用完后放4℃冰箱保存1周。

9．判断结果后应仔细核对，记录，避免笔误。

10.分型血清＋受检者红细胞与受检者血清＋试剂红细胞结果不符时，要看受检者基本情况，如果是婴幼儿、肿瘤患者，理论上应该检测到的抗体没有查到，可以忽略不计，以查到的抗原定型。

11．分型血清＋受检者红细胞与受检者血清＋试剂红细胞结果不符时，受检者基本情况，又不是婴幼儿、肿瘤患者。理论上应该检测到的抗体没有查到，多见老年人，可以试用以下方法加以检测抗体：

① 用试管法重做，在做完2.1.1和2.1.2后,把试管放4℃环境15分钟,后取出离心。观察结果。

② 用试管法重做，在做完2.1.1和2.1.2后,把试管放37℃环境15分钟,后取出离心。观察结果。

③用试管法重做，用聚凝胺方法查抗体:

2.1.2取洁净小试管3支，分别标明A型、B型和O型细胞。用滴管分别加入受检者血清2滴于试管底部，再分别以滴管加入A、B、O型5%试剂红细胞悬液1滴，混匀。

 2.1.3于三个试管中分别加入LIM0.7ml、Polybrene溶液2滴，混匀。

2.1.4以1000rpm离心（离心时间应按离心机校准时间）。

2.1.5倒掉上清液，管底残液体留约0.1ml。

2.1.6轻轻摇动试管，目测红细胞有无凝集，如无凝集，则必须重做。

2.1.7加入Resuspending2滴，轻轻转动试管混合并同时观察结果。如果在30秒—1分内凝集散开，代表是由Polybrene引起的非特异性聚集，配血结果相合；如凝集不散开，则为红细胞抗原抗体结合的特异性反应，配血结果不相合。如反应可疑，可进一步倒在玻片上用显微镜观察。

12. 受检者血清＋试剂红细胞试验中,O细胞凝聚要查自身抗体和不规则抗体.

【方法评价】

1．玻片法定型简单，不需要离心设备，适用于大规模血型普查。亚型红细胞抗原与抗体的凝集反应慢、凝集强度弱，有时容易被忽略而导致定型有误。该法仅靠抗体的力量凝集红细胞而无离心力加速反应，故反应时间较长，且不适用于交叉配血。

2．试管法定型反应快、时间短，特别是紧急输血时可在抗原抗体反应1分钟后离心观察结果；通过离心增强凝集，可发现亚型和较弱的抗原抗体反应，结果准确可靠。

3．卡式法定型使用安全，操作简单，结果稳定可靠，灵敏度高，重复性好，但费用昂贵，需要特殊的仪器设备。

【质量控制】

1．每更换一批号抗血清试剂，均要滴定抗体效价。

2．分型血清应保存在2～6℃，对长期数月不用的试剂，可保存于-20℃。

    3．IgM抗A或抗B血凝效价≥128，亲和力≤15秒，冷凝集素效价＜1：4，必须具有检出A2、A2B的能力。

4．抗血清如出现浑浊和变色则不能使用，防止抗血清污染、变质失效，而造成血型鉴定错误。

5．红细胞悬液配制要准确，抗原抗体比例要适当。

6．玻片法反应时间不能少于10分钟，否则较弱凝集不能发现。

【临床意义】

1．血型鉴定是实施输血治疗的首要步骤。进行交叉配血前必须准确检测受血者和供血者的血型。

2．进行组织器官移植时，供、受器官者的ABO系统血型必须相同。

3．母、子ABO系统血型不合可以造成ABO系统新生儿溶血病

第二篇：ABO血型鉴定操作规程

1.     目的：

为准确鉴定ABO血型

2.     要求：

 要求全科人员熟练掌握原理及操作，对有疑问的结果能够做出解释及妥善解决。

3.     原理：

根据红细胞上有无A抗原和/或B抗原，将血型分为A型、B型、O型和AB型四种。可利用红细胞凝集试验，通过正、反定型准确鉴定ABO血型。正定型是用已知抗A和抗B分型血清来测定红细胞上有无相应的A抗原和/或B抗原；反定型是用已知的A型红细胞和B型红细胞来测定血清中有无相应的抗A和/或抗B。反定型中使用O细胞是为了检测抗A、抗B以外的不规则抗体。

4.试剂和材料

4.1  A、抗B分型血清，效价1：128以上

4.2  2%~5%A、B、O标准红细胞。

4.3  受检者血样

5.方法．（试管法）

5.1 取洁净小试管2支，分别标明抗A、抗B，分别滴加抗A、抗B分型血清1滴于试管底部，再分别加入受检者2%~5%红细胞1滴，混合。

5.2 另取洁净小试管3支，标明A_C、B_C、O_C，各加入受检者血清2滴于试管底部，再分别加入A、B和O型2%~5%标准红细胞1滴，混匀。

5.3 以1000g离心15秒，将试管轻轻摇动，使沉于管底的红细胞浮起，以肉眼观察有无凝集或溶血现象。观察结果时既要看有无凝集，更要注意凝集强度，这将有助于A、B亚型、类B、或CisAB的发现。★

6.结果判断：

7.正反定型不一致的原因：

有技术问题或红细胞和血清本身问题，常见者有以下数种：

7 1 分型血清效价太低，亲和力不强。

7.2 红细胞悬液浓度过高或过低，抗原抗体比例不适当（出现前带或后带现象），使反应不明显误判为阴性反应

7.3  受检者红细胞上抗原位点过少（如亚型）或抗原性减弱（见于白血病或恶性肿瘤）以及类B或CisAB等。

7.4 受检者血清蛋白紊乱（高球蛋白血病）或实验时温度过高，常引起红细胞呈缗钱状排列。

7.5  受检者血清中缺乏应有的抗A或抗B抗体，如丙种球蛋白缺乏症。

7.6  各种原因引起的红细胞溶解，误判为不凝集。

7.7  由细菌污染或遗传因素引起，多凝集和全凝集，往往是正反定型不符的原因。

7.8  血清中有以外抗体，如自身抗I，常干扰定型。

7.9  老年人血清中抗体水平大幅度下降。

如发现ABO正反定型不一致，首先要重复做试验一次（必须用试管法），严格执行操作规程，使用质量合格的试剂以及细心观察和解释试验结果，就可以解决问题，对一些疑难问题必须进一步研究。

8.相关文件

8.1《中国输血技术操作规程》

9.记录

9.1 CB—001青海省血液中心血型参比实验室免疫血液学研究

9.2 CB—002免疫血液学检查报告

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