实验报告
细胞色素C的提取
一、 实验目的
1、 熟悉细胞色素C提取与检测方法；
2、 掌握吸附、盐析、透析等实验技术。
二、 实验原理
细胞色素C是以一种铁卟啉为辅基的呼吸酶，广泛存在于所有的需氧组织中。在心肌与其他做剧烈运动的肌肉中含量最为丰富。细胞色素C位于线粒体的蛋白质—脂质络合物中，分子量约为13000，肽链中含有19个赖氨酸残基，为一碱性蛋白, 等电点（10.5~10.8）高、易溶于酸性溶液, 故采用酸化水提取。人造沸石为铝酸钠，它是一种阳离子交换剂，细胞色素C分子刚好进入它的表面空隙。在pH7.5时细胞色素C 呈正电荷，它可与沸石分子上的钠离子发生交换，从而被沸石吸附。装入层析柱后，用25%硫酸铵洗脱，又可将细胞色素C 交换下来。硫酸铵主要是降低沸石对细胞色素C 的亲和力。硫酸铵盐析可明显提高细胞色素C 纯度，主要为去除杂蛋白。另外三氯乙酸可引起细胞色素C 变性和聚合，必须严格控制三氯乙酸用量。
三、 实验仪器设备与材料试剂
1、 设备：组织捣碎机、酸度计、离心机、分光光度计、层析柱、透析袋、磁力搅拌器、冰箱
2、 仪器：剪刀、烧杯、漏斗、滤纸、天平、玻璃棒、纱布、试管、胶头滴管
3、 试剂：联二亚硫酸钠、硫酸、硫酸铵、三氯乙酸、人造沸石、氯化钡、氯化钠、氢氧化铵
4、 材料：新鲜猪心（2个）
四、 实验技术路线
预处理 水、硫酸、PH3.4
新鲜猪心 匀浆 提取液
氨水、pH6.0、过滤 氨水、pH7.5、过滤
滤液 人造沸石
水、氯化钠、硫酸铵 硫酸铵盐析
洗脱液 滤液
20%的三氯乙酸沉淀、离心、透析
细胞色素C粗品溶液
五、实验步骤
1、预处理：健康猪心去脂肪等结缔组织—→剪碎放入碎冰中（保护酶的活性，避免捣碎机破碎时使酶失活）—→放入生理盐水中清洗去污—→称重：烧杯80g，烧杯＋猪心=240g，（240-80）×1.5=240ml酸化水—→组织捣碎机匀浆10min（匀浆3min，停5min，为了保证捣碎机安全）
2、提取：搅拌后静置2h—→四层纱布过滤后加入1.5倍酸化水于沉淀物中，在过滤后静置2h—→放入冰箱保存过夜—→从冰箱中取出—→加2mol/L氨水调PH至6.0，静置30min，过滤—→滤液加2mol/L氨水调PH至7.5，静置30min,过滤
3、吸附：加10%人造沸石（滤液为220ml）—→磁力搅拌器搅拌吸附1h—→蒸馏水洗3次—→0.2%NaCI 溶液洗3次—→滤出人造沸石待用
4、洗脱：在柱中装人造沸石体积的三分之二蒸馏水—→将沸石放入柱中—→装满25%硫酸铵溶液进行洗脱，流速控制在2ml/min 以下, 收集红色的洗脱液（没分辨出红色液体阶段，收集了所有洗脱液）
5、盐析：在洗脱液（300ml）中慢慢加入固体硫酸铵75g, 边加边搅拌，使硫酸铵溶液的浓度为50%—→置4℃冰箱过夜—→过滤，收集滤液—→向过滤液中按22ml/L的量滴加浓度为20%的三氯乙酸溶液（过滤液和20%三氯乙酸溶液最好在4℃遇冷, 边加边搅拌, 加时要快, 防止局部蛋白质变性）—→加完后分成8管，立即离心—→无明显沉淀，再5000转离心15min—→无明显沉淀，向每只离心管加入2滴浓度为20%的三氯乙酸溶液—→再5000转离心15min—→无明显沉淀，实验结束
6、透析 将上述溶解后的细胞色素C 装入透析袋中, 放进500ml烧杯中（用磁力搅拌器搅拌），用去离子水透析, 除去硫酸根离子，15min换水一次，换手3~4次后，检查硫酸根离子是否已被除尽。检查方法：取2ml氯化钡溶液加入试管中，滴加2~3滴透析外液至试管中，若出现白色沉淀，表示硫酸根离子未除尽，如果不出现沉淀，表示透析完全。将透析液过滤， 收集滤液即为细胞色素C粗品。 记录此粗品的体积。
7、检测
浓度检测：
细胞色素C粗品是还原型和氧化型两种产品的混合物, 在测定含量时, 要加入联二亚硫酸钠, 使混合物中的氧化型转变为还原型，还原型细胞色素C水溶液在波长520nm 处有最大吸收值，根据这一特性，用分光光度计选一标准品，作细胞色素C 的浓度和对应的吸光值的标准曲线，然后根据所测溶液的吸光值，由标准曲线求出所测样品的含量。
具体操作：
标准曲线的制定：取适量细胞色素C标准品，用蒸馏水稀释至10ml，从中取0.1、0.2、0.4、0.6、0.8和1.0ml，分别放入5支试管中，每管补加蒸馏水至2ml，并加入少许联二亚硫酸钠作为还原剂，然后在520nm波长处测得各管的吸光值。以上述标准样品的毫升数为横坐标，吸光值A为纵坐标绘制出标准曲线。
样品中细胞色素C含量的测定：取样品1ml，再加少许联二亚硫酸钠，然后在波长520nm处测得A值（做两个平行样品，取平均值），根据此A值查标准曲线，换算得到细胞色素C的浓度。
纯度检测：
因为细胞色素C属蛋白质，所以利用聚丙烯酰胺凝胶电泳来检测所的样品分子量大小以及纯度，从而评价所的样品的质量。
具体操作：
预先配置聚丙烯酰胺凝胶，样品和标准品分别混合缓冲液点样，再点上标准屏，在恒定电压作用下，达到分离的目的。后用考马斯亮蓝染液对蛋白质进行染色，后同脱色液脱去多余染液，得到电泳图。
六、实验结果与讨论
1、检测结果：
原液配置：精密称取细胞色素C 8.1微克，溶解于10毫升水，浓度0.81微克/毫升
A组：吸光度：0.0136 浓度：0.0145微克/毫升
B组：吸光度：0.0099 浓度：0.0131微克/毫升
电泳检测结果：
2、讨论
从标准曲线图中可以看出，细胞色素C的浓度与一定条件下的吸光度成正比。
在结果的电泳图中，清楚地可以看出标准品的浓度。而A组合B组显示结果中并无细胞色素C。说明本次实验提取浓度过低或提取失败。失败的原因可能是：
实验方案不可行、浓度过低和实验操作步骤错误等。
第二篇：细胞色素C的提取
细胞色素C的提取
一、实验目的
1、掌握提取细胞色素C的原理。
2、学习提取细胞色素C的操作技术。
3、了解吸附法的原理和方法。
二、实验原理
细胞色素C是一种含有铁卟啉基团的蛋白质，是细胞色素的一种，在线粒体呼吸链上位于细胞色素b和细胞色素aa3之间，是呼吸链的一个重要组成成分。细胞色素C的作用是在生物氧化过程中传递电子。
细胞色素C溶于水，在酸性溶液中溶解度更大，制品可分为氧化型和还原型两种，氧化型水溶液呈深红色，还原型水溶液呈桃红色。细胞色素C对热、酸和碱都比较稳定，但三氯乙酸和乙酸可使之变性，引起部分失活。
吸附法指利用吸附作用，将样品中的生物活性物质或杂质吸附于适当的吸附剂上，利用吸附剂对活性物质和杂质间吸附能力的差异，使目的物和其他物质分离，达到浓缩和提纯目的的方法。
由于细胞色素C在心肌组织和酵母中含量丰富，常以此为材料进行分离制备。本实验以新鲜猪心为材料，经过酸溶液提取，人造沸石吸附，硫酸铵溶液洗脱和三氯乙酸沉淀等步骤制备细胞色素C。
三、实验试剂和器材
试剂
1、2mol/L硫酸溶液
2、1mol/L氨水溶液
3、0.2%氯化钠溶液
4、25%硫酸铵溶液
5、20%三氯乙酸溶液
6、人造沸石
7、猪心
器材
磁力搅拌器、组织匀浆机、层析柱、恒流泵
四、实验步骤
1、材料处理 取新鲜或冷冻猪心，除去脂肪和韧带，用水洗去积血，将猪心搅成小块。
2、提取
称取碎猪心肌肉100g，放入500ml烧杯中，加蒸馏水200ml，搅匀，用硫酸调pH至4.0（此时溶液呈暗紫色），在室温下搅拌提取0.5h。提取完毕，用氨水调pH至6.0，搅拌均匀，停止搅拌。用八层普通纱布挤压过滤；滤渣加入750ml蒸馏水，再按上述条件提取0.5h，两次提取液合并。
3、中和
用氨水调上述提取液至pH7.2（此时，等电点接近pH7.2的一些杂蛋白溶解度小，从溶液中沉淀下来），静置30—40min后过滤，所得滤
液准备通过人造沸石柱进行吸附。
4、吸附与洗脱
人造沸石容易吸附细胞色素C，吸附后能被25%的硫酸铵洗脱下来，利用此特性将细胞色素C与其它杂质蛋白分开。具体操作如下：
（1）人造沸石的预处理：称取人造沸石15g，放入500ml烧杯中，加水搅拌，用倾泻法除去12s内不下沉的过细颗粒。
（2）吸附：采用静态吸附法，搅拌吸附细胞色素C，使人造沸石逐渐由白色变为红色。
（3）装柱：连接洗净的层析玻璃柱，柱下端连接一乳胶管，用夹子夹住，柱中加入2cm左右蒸馏水，保持柱垂直，然后将已吸附细胞色素C的人造沸石带水装入柱中（吸附有细胞色素C的人造沸石先用自来水清洗，再用蒸馏水清洗至清，再用氯化钠溶液清洗3次，再用蒸馏水清洗至水清），避免柱内出现气泡。
（4）洗脱：柱装好后，打开夹子放水（柱内沸石面上应保留一薄层水）将准备好的洗脱液（硫酸铵溶液）利用恒流泵将其泵入层析柱上口，使其通过人造沸石柱进行吸附。保持柱下端流速约2ml/min，收集含有细胞色素C的红色洗脱液，当洗脱液红色消失时，即洗脱完毕。
5、盐析
为了进一步提纯细胞色素C，在上面收集的洗脱液中，加入固体硫酸铵（按每100ml洗脱液加入20g固体硫酸铵的比例，使溶液硫酸铵的饱和度为45%）边加边搅拌，放置15～30min后，杂蛋白便从溶
液中沉淀析出，而细胞色素C仍留在溶液中，用滤纸（或离心）除去杂蛋白，即得红色透亮细胞色素C溶液。
6、三氯乙酸沉淀
在搅拌情况下向所得透亮溶液加入20%三氯乙酸，细胞色素C立即沉淀出来（沉淀出来的细胞色素C属可逆变性），立即收集沉淀。加入少许蒸馏水，用玻棒搅拌，使沉淀溶解，观察现象。
五、思考题
总结该实验过程中的关键步骤。