二苯胺试剂:鉴定DNA。
二苯胺试剂的配制
A液:1.5 g二苯胺溶于100 mL 冰醋酸中,再加15 mL浓硫酸,用棕色瓶保存。如冰醋酸呈结晶状态,则需加温后待其熔化,再使用。
B液:乙醛的体积分数为0.2%的溶液。
配制:将0.1 mL B液加入到10 mL A液中,现配现用。
DNA的粗提取与鉴定
实验原理
1. DNA在NaCl溶液中的溶解度，是随着NaCl的浓度的变化而改变的。
当NaCl的物质的量浓度为0.14 mol／L时,DNA的溶解度最低。利用这一原理，可以使溶解在NaCl溶液中的DNA析出。
2.DNA不溶于酒精溶液，但是细胞中的某些物质则可以溶于酒精溶液。利用这一原理，可以进一步提取出含杂质较少的DNA。
3.DNA遇二苯胺（沸水浴）会染成蓝色，因此，二苯胺可以作为鉴定DNA的试剂。
注意事项
1.步骤3析出含DNA的黏稠物中，蒸馏水要沿烧杯内壁缓缓加入，不能一次快速倒入。
2.实验中有多个步骤都要用玻璃棒进行搅拌，但是在不同的步骤中玻璃棒的用法不同。
实验用具
鸡血细胞液（5～10 mL）；体积分数为95％的冷酒精，蒸馏水，质量浓度为0.1 g／mL的柠檬酸钠溶液，物质的量浓度分别为2 mol／L和0．015 mol／L的NaCl溶液，二苯胺试剂；烧杯（100 mL，1个， 50 mL， 500 mL，各2个），漏斗，试管（20 mL，2个），玻璃棒，滴管，量筒（100 mL，1个），纱布，镊子，滤纸，铁架台，铁环，三角架，酒精灯，石棉网，载玻片，试管夹。
实验原理：
1.析出溶解在NaC1溶液中的DNA。
2.用冷酒精提取出含杂质较少的DNA。
3.DNA在沸水浴时被二苯胺染成蓝色。
方法步骤：
1．提取细胞核物质：顺时针方向搅拌，稍快，稍重。 5 min
2．溶解DNA：
3．析出含DNA的黏稠物：蒸馏水300mL，逆时针方向搅拌，缓慢
4．过滤：取黏稠物
5．再溶解：顺时针方向搅拌，较慢。3 min
6．过滤：取滤液。
7．提取出含杂质较少的DNA，逆时针方向搅拌，稍慢。5 min
8．DNA的鉴定：沸水浴5min
【实验十二】DNA的粗提取与鉴定
实验原理
DNA在氯化钠溶液中的溶解度，是随着氧化钠的浓度的变化而改变的。当氯化钠的物质的量浓度为 2 mol／L时，DNA的溶解度最大，浓度为 0．14 mol／L时，DNA的溶解度最低。利用这一原理，可以使溶解在氯化钠溶液中的DNA析出。
DNA不溶于95%的酒精溶液，但是细胞中的某些物质则可以溶于酒精溶液。利用这一原理，可以进一步提取出含杂质较少的DNA。
DNA中含有脱氧核糖，能与二苯胺（沸水浴）反应生成蓝色物质，因此，二苯胺可以作为鉴定DNA的试剂。
目的要求
1. 学会DNA的粗提取和鉴定的方法。
2. 观察提取出来的DNA物质的颜色和形状。
材料用具
材料：活鸡或鲜血鸡血。
仪器：离心机、恒温水裕锅、载玻片，玻璃棒，滤纸，滴管，量简（100 mL，l个），烧杯（100 mL，l个，50 mL、500 mL各 2个），试管（20 mL，2个），漏斗，试管夹，纱布。
试剂：酒精的体积分数为95％的溶液（实验前置于冰箱内冷却24 h），蒸馏水，柠檬酸钠的质量浓度为 0．1g／mL的溶液，氯化钠的物质的量浓度分别为 2 mol／L和0．015 mol/L的溶液，二苯胺试剂。
方法步骤
实验前需要制备鸡血细胞液（由教师完成），制备的方法是：取柠檬酸钠的质量浓度为 0．1 g／mL的溶液（抗凝剂）100 mL，置于500 mL烧杯中。将宰杀活鸡流出的鸡血（约180 mL）注入烧杯中，同时用玻璃棒搅拌，使血液与柠檬酸钠溶液充分混合，以免凝血。然后，将血液倒入离心管内，用 1000 r／min的离心机离。2min，此时血细胞沉淀于离心管底部。实验时，用吸管除去离。心管上部的澄清液，就可以得到鸡血细胞液。
1．提取鸡血细胞的细胞核物质
将制备好的鸡血细胞液5 mL～10mL，注入到50 mL烧杯中。向烧杯中加入蒸馏水20 mL，同时用玻璃棒充分搅拌5 min，使血细胞加速破裂。然后，用放有纱布的漏斗将血细胞液过滤至500mL。取其滤液。
2．溶解细胞核内的DNA
将氯化钠的物质的量浓度为 2 mol的溶液40mL加入到滤液中，并摇动烧杯，使其混合均匀，这时DNA在溶液中呈溶解状态。
3．析出含DNA的粘稠物
沿烧杯内壁缓缓加入蒸馏水，同时用玻璃棒不停地轻轻搅拌，这时烧杯中有丝状物出现，注意观察丝状物呈什么颜色。继续加入蒸馏水，溶液中出现的粘稠物会越来越多。当粘稠物不再增加时停止加入蒸馏水（这时溶液中氯化钠的物质的量浓度相当于0.14 mol／L）。
4．滤取含DNA的粘稠物
用放有多层纱布的漏斗，过滤步骤3中的溶液至 500mL的烧杯中，含 DNA的粘稠物被留在纱布上。
5．将DNA的粘稠物再溶解
取 1个 50 mL烧杯，向烧杯内注入氯化钠的物质的量浓度为 2 mol／L的溶液 20mL。用钝头镊子将纱布上的粘稠物夹至氯化钠溶液中，用玻璃择不停地搅拌，使粘稠物尽可能多地溶解于溶液中。
6．过滤含有DNA的氯化钠溶液
取1个100 mL烧杯，用放有两层纱布的漏斗过滤步骤5中的溶液。取其滤液，DNA溶于滤液中。
7．提取含杂质较少的DNA
在上述滤过的溶液中，加入冷却的、酒精的体积分数为 95％的溶液 50mL（使用冷却的酒精，对DNA的凝集效果较佳），并用玻璃棒搅拌，溶液中会出现含杂质较少的丝状物。用玻璃棒将丝状物卷起，并用滤纸吸取上面的水分。这种丝状物的主要成分就是DNA 。注意观察丝状物是什么颜色的。
8．DNA的鉴定
取两支20 mL的试管，各加入氯化钠的物质的量浓度为0．015 mol／L的溶液5 mL，将丝状物放入其中一支试管中，用玻璃棒搅拌，使丝状物溶解。然后，向两支试管中各加入4mlL的二苯胺试剂。混合均匀后，将试管置于沸水中加热 5 min，待试管冷却后，观察并且比较两支试管中溶液颜色的变化。将观察的结果填写在《实验报告册》上。
结论
步骤8的2支试管中溶液颜色的变化说明了什么？将得出的结论填写在《实验报告册》上。
讨论
1．提取鸡血中的DNA时，为什么要除去血液中的上清液？
2．步骤回和步骤3中都需要加入蒸馏水，两次加入的作用相同吗？为什么？
3．DNA的直径约为20×10-10 m，实验中出现的丝状物的粗细是否表示1个DNA分子直径的大小？
第二篇：二苯胺法测定DNA含量
实验12 二苯胺法测定DNA含量
一、目的
学习和掌握测定DNA的定糖法（二苯胺法）的原理和操作技术。
二、原理
脱氧核糖核酸中的α—脱氧核糖在酸性环境中变成ω—羟基—γ酮基戊醛与二苯胺试剂一起加热产生蓝色化合物，在595nm处有最大的吸收，在每毫升含DNA20~400微克范围内，光密度与DNA的浓度成正比，在反应液中加入少量乙醛，可以提高反应的灵敏度。除DNA外，脱氧木糖，阿拉伯糖也有同样的反应。
DNA HO CH2C — CH2 CHO 蓝色化合物
酸性条件 二苯胺
O
ω—羟基—γ酮基戊醛
三、材料、试剂和器具
（一）试剂
1、DNA标准溶液：取小牛胸腺DNA用0.1N氢氧化钠溶液配制成200微克/毫升的溶液。
2、DNA样品液：（自己提取）控制其DNA含量在50~100微克/毫升左右。
3、二苯胺试剂：称取1克结果的二苯胺试剂溶于100毫升分析纯的冰醋酸中，再加入10毫升过氯酸（A.R60%以上）或浓硫酸2.75毫升，混匀备用。临用前加入1毫升1.6%乙醛溶液（乙醛溶液应保存于冰箱，一周内可使用）所配得的溶液应为无色。
（二）器具
1、试管及试管架
2、移液管（1，2，5毫升）
3、恒温水浴
4、可见光分光光度计
四、操作步骤
（一）DNA标准曲线的制作
取8支试管，编号，按下表加入试剂
加毕，摇匀，于60℃恒温水浴中保温1小时，（或于沸水中煮沸15分钟，冷却测0.D595nm值。）以光密度为纵坐标，DNA含量（ug/ml）为横坐标，绘制标准曲线。
（二）样品的测定
取2支试管，各加0.2~0.5毫升的待测液（内含DNA应在标准曲线可测范围之内）加蒸馏水稀释至2毫升，再加4毫升二苯胺试剂，摇匀，其操作步骤与标准曲线的制作相同。根据测得的光密度值，从标准曲线上查出相当该光密度DNA的含量，按下式计算出样品中DNA的百分含量。
DNA含量/毫升待测液=标准曲线查得值×稀释倍数
五、注意事项
1、二茉胺法测定DNA含量灵敏度不高，待测样品中DNA含量低于50mg/L即难以测定。乙醛可增加二苯胺法测定DNA的发色量，又可减少脱氧木糖和阿拉伯糖的干扰，能显著提高测定的灵敏度。
2、样品中含有少量RNA并不影响测定，但因蛋白质、多种糖类及其衍生物、芳香醛、羟基醛等能与二苯胺反应形成有色化合物，故能干扰DNA定理。
六、实验报告
1、绘制标准曲线图
2、计算DNA含量及产率
七、思考题
1、本实验的关键步骤是什么？如何控制？
2、DNA制品可用哪几种方法测定其含量，试从原理、准确性等方面加以比较。