氨在兔肝性脑病发病机理中的作用

The Role of Ammonia in the Mechanism of Hepatic Encephalopathy

【教学对象与学时】

一、教学对象：五年制本科

二、学时：4学时

【预习要求】

预习肝性脑病的概念，发病机制及其决定和影响因素。

【目的要求】

一、采用肝大部分结扎，复制急性肝功能不全的动物模型。

二、观察肝性脑病的表现，探讨血氨升高在肝性脑病发病机理中的作用。

【重点和难点】

一、重点

1、掌握复制急性肝功能不全动物模型的实验方法；

2、掌握复制肝性脑病动物模型的实验方法；

3、观察肝性脑病的临床表现；

4、掌握血氨升高在肝性脑病发病机理中的作用。

二、难点

1、复制急性肝功能不全的动物模型；

2、血氨升高在肝性脑病发病机理中的作用。

【教学过程设计】

1、课前提问和预习检查

2、讲解本次实验的目的、所用动物和器材、实验分组、观察指标、实验步骤。

3、学生分组进行实验、记录结果。

4、实验结束前汇总全班实验结果，并对实验结果进行讨论。

【课前预习检查或提问】
1、Definition ofHepatic Encephalopathy

肝性脑病(hepatic encephalopathy)是由于急性或慢性肝功能不全，使大量毒性代谢产物在血循环中堆积，临床上出现一系列神经精神症状，最终出现肝性昏迷。这种继发于严重肝病的神经精神综合征，称为肝性脑病。对于这个概念，我要强调两点：第一、肝性脑病的病理生理条件是有严重肝脏疾病，第二，是在此条件上，并有诱因时出现了神经精神综合症。这两个方面缺一不可，共同构成肝性脑病这个概念。

2、Stages

 ofHepatic Encephalopathy

临床上根据肝性脑病症状的轻重进行分期，即意识障碍程度、神经系统症状和脑电图的变化，将肝性脑病分为四期，分别为：前驱期；昏迷前期；昏睡期；昏迷期。

3、MechanismsofHepatic Encephalopathy

目前有数个学说试图解释肝性脑病的发病机制。分别有氨中毒学说 ( Ammonia Intoxication )，假性神经递质学说 ( False Neurotransmitter )、血浆氨基酸失衡学说 ( Imbalance of Amino Acid ) ，GABA学说 ( r-Amino Butyric Acid )。其中最早、最重要的学说是氨中毒学说。临床发现，60-80%的肝性昏迷患者有血氨升高。而且在临床上应用降血氨治疗可明显缓解肝性脑病症状。

4、How to Reproduce a Animal ModelofHepatic Encephalopathy

先采用大部分肝结扎的方法（相当于肝大部分切除术），造成肝功能（主要是解毒功能）的严重损害，复制一个严重肝疾病的动物模型，然后经消化道（十二指肠）输入复方NH4cl溶液，使动物体内血氨迅速升高，以致出现震颤、抽搐、昏迷等类似肝性脑病的症状。

【课前讲解】

1、Objective：

(1)采用肝大部分结扎，复制急性肝功能不全的动物模型。

(2)观察肝性脑病的表现，探讨血氨升高在肝性脑病发病机理中的作用。

2、Animal：

家兔（性别、体重）

3、Group：

Ⅰ组：肝大部分（结扎）+N·S溶液（3ml/kg/5`）

Ⅱ组：肝大部分（结扎）+复方NH₄cl溶液（3ml/kg/5`）

Ⅲ组：假手术（不结扎肝）+复方NH₄cl溶液（3ml/kg/5`）

4、Observation Index ：见表格

5、Procedure：

(1) 称重、固定、剪毛、局麻（皮下浸润局麻）（1%普鲁卡因7-8ml）

(2) 上腹正中切口（8cm）游离肝叶、肝大部分结扎（示图）（扎肝反应：迅速变色）

(3) 十二指肠插管，关闭腹腔（血管钳对合夹闭）

(4) 注药（3ml/kg  每5`注药一次）

(5) 观察

6、Notice：

1、游离肝脏的动作要轻柔，结扎应在肝脏根部（肝组织脆性大，要防止出血）

2、剪镰状韧带时不要刺破膈肌（以防引起气胸，肺不张），剥离肝胃韧带时，勿弄破周围的大血管。

3、十二指肠插管时注意方向（向十二指肠方向）。插管应轻柔通畅，固定牢靠，插管后注入N.S液以检查管道是否通畅。

4、术后须关闭腹腔，防止腹压↑→内脏外溢

5、区别挣扎与抽搐（主动与否；抽搐具有节律性）

【典型结果】

怎样检查肌张力、反应性、兴奋发应、抽搐、角弓反张等。

查肌张力：肌张力是静息状态下的肌肉紧张度，增加时见于维体来受损。

查反应性：轻敲头部（兔台）

查兴奋反应：轻拍桌子

抽    搐：有节律地抽动（注意与挣扎区别）

角弓反张：即去大脑僵直（decerebrate rigidity）是指去大脑动物在肌紧张活动方面出现亢进现象，表现为动物四肢伸直，头尾昂起，脊柱挺硬，去大脑僵直主要是伸肌（抗重力肌）紧张性亢进，四肢坚硬如柱。(备注：在中脑上丘与下丘之间及红核的下方水平面上将麻醉动物脑干切断，称为去大脑动物。手术后动物立即出现全身肌紧张加强、四肢强直、脊柱反张后挺现象，称为去大脑僵直（强直）。去大脑僵直主要是一种反射性的伸肌紧张性亢进，是一种过强的牵张反射。引起过强的牵张反射，主要是由于中脑水平切断脑干以后，来自红核以上部位的下行抑制性影响被阻断，网状抑制系统的活动降低，易化系统的作用因失去对抗而占优势，导致伸肌反射的亢进。)

【分析讨论】

1、针对本实验，我们分组是否正确，为什么？

   科研设计原则为：对照、随机、重复、在本实验中，根据此原则还应设置一个空白对照组，即假手术+NS，以观察动物“正常”时表现（“正常”亦为相对正常，因麻醉及腹部切口，十二指肠插管对动物都有刺激作用），但考虑分组动手问题，我们省略了这一组。

2、以上三组分别复制了什么模型，为什么？

   Ⅱ组是“肝性脑病”动物模型，Ⅲ组是“氨中毒”，Ⅰ组是“肝功能不全”。

3、比较三组所得的结果，可得出什么结论？

    “肝性脑病”动物先出现兴奋性↑，而后抽搐、角弓反张、最后死亡。Ⅱ组最先出现以上表现（注药总量最小），其次为Ⅲ组（注药总量>Ⅱ组）、Ⅰ组至实验结束仍未发生上述症状。

若Ⅱ、Ⅲ组相比较、结果与理论相悖，则考虑①个体差异（对药物敏感性）②实验仅1个动物，未重复。

4、氨的来源？

      （1）机体代谢产氨：氨基酸脱氨基作用-为机体氨的主要来源

     （2）消化道吸收：为血氨的主要来源：

去路：

 （1）主要在肝脏经乌氨酸循环合成尿素（80-90%）

 （2）小部分以铵盐形式随尿排出（10-20%）

5、血氨升高为什么会出现一系列精神神经症状？

   机制：（氨中毒学说中毒引起肝性脑病的机制）

（1）干扰脑组织的能量代谢：

主要干扰葡萄糖的生物氮化过程，而脑组织随时都依赖血液输送的葡萄糖来提供能量。氨与脑内的α-酮戊二酸结合，生成谷氨酸。

①使三羧酸循环中间产物α-酮戊二酸↓→影响糖的有氧化谢

②消耗了大量的还原型辅酶I（NADH）→妨碍了呼吸链中毒氢过程→ATP产生不足

③消耗了大量的ATP→脑Cell活动能量不足→不能维持CNS兴奋活动→肝昏迷

④产生的谷氨酰胺为抑制性神经递质。

  （2）使脑内神经递质发生改变：

干扰Ncell膜上的Na⁺-K⁺-ATP酶活性，使膜电位改变→兴奋性异常

NH₃与K⁺竞争、影响Na⁺、K⁺在神经细胞膜内外的正常分布→干扰神经传导活动。

6、根据氨中毒学说，对肝性脑病有哪些防治原则？

  （1）↓肠道NH₃的产生与吸收、措施有两点

①控制蛋白质饮食的摄取

②口服新霉素抑制肠菌产氨

（2）促进血氨排出、降低血氨浓度

         ①降低肠道PH值：乳果糖-酸透析

②降低血氨：临床常见谷氨酸、精氨酸

　

7、  本实验中为什么氯化氨要用碳酸氢钠溶液配制？

       用复方NH₄cl作用是造成碱性环境   
                      

   根据相似相溶原理，NH₃分子容易通过细胞膜

【参考结论】

    血氨增高是肝性脑病的重要的诱因
　

【实验报告要点】

1、实验名称、实验时间、实验人、指导老师及实验环境温度。

2、实验目的

3、实验动物:性别、体重。

4、简单的实验步骤。

5、列表记录所有组的实验指标。

6、实验讨论。

7、实验结论。

【思考题及参考答案】
     1.  血氨升高与肝大部分切除术在实验性肝性脑病中的作用有何相互关系？他们分别起什么作用？
      2. 为什么氯化氨要用碳酸氢钠溶液配制？

第二篇：氨中毒在家兔肝性脑病发病机制中的作用观察(自己)

氨中毒在家兔肝性脑病发病机制中的作用观察

【摘要】目的：①复制家兔急性肝功能不全模型，用十二指肠灌注复方氯化铵法，观察氨中毒对家兔脑功能影响；②用耳缘静脉注射谷氨酸钠法治疗肝性脑病，探讨其治疗机制。方法：全班分为五大组，其中第一组为模型组1，第二组为模型组2，第三组为治疗组，第四组为假手术组，第五组为预防组。结果：复方氯化铵可使家兔大脑功能受影响，而肝可解氨中毒，复方谷氨酸钠也可缓解其作用。结论：肝具有解毒作用，氨中毒在肝性脑病的发生中起重要作用。

1实验材料

1.1对象：家兔(2.0kg)；

1.2实验试剂：氨基甲酸乙酯，复方氯化铵溶液，复方谷氨酸钠溶液；

1.3实验仪器：10ml注射器、50ml注射器及针头，手术剪，镊子、止血钳、兔手术台、棉线若干、婴儿秤、缝针、导管；

2实验方法

2.1实验分组：本组实验为假手术组

2.2麻醉：家兔称重2.0kg，按5ml/kg剂量由耳缘静脉注射10ml20%氨基甲酸乙酯。待家兔麻醉后背位固定于兔手术台上。

2.3急性肝功能不全动物模型复制

2.3.1肝脏大部结扎术（本组不需结扎）

2.3.1.1从胸骨剑突下沿腹正中线行长8cm的切口，打开腹腔。

2.3.1.2暴露肝脏，向下压肝脏，剪断肝与横膈之间的镰状韧带，使肝叶游离，辨明肝脏各叶，用粗棉线绕肝左外叶、左中叶、右中叶根部一周，不结扎肝脏。

2.3.2十二指肠插管术：沿胃幽门向下找出十二指肠，用眼科剪在肠壁作一小切口，将胶管顺十二指肠向远端插入肠腔内约5cm，作荷包缝合固定。然后用止血钳夹住腹壁切口边缘，关闭腹腔。

2.4试剂注射：向十二指肠插管中注入复方氯化铵溶液，每次10 ml，间隔5min（2次，20 ml）。然后每次5ml，间隔10min。观察家兔呼吸、肌紧张变化、出现抽搐及痉挛时停止灌注。 2.5实验观察

2.5.1记录家兔的呼吸频率：实验前、实验中、治疗中、死亡前。 2.5.2记录家兔抽搐及痉挛发生所需时间。 2.5.3记录所用复方氯化铵溶液的总量。

3实验结果

3.1实验结果数据记录

实验类型 模型组 治疗组 假手术组 预防组

实验前呼

组数

吸频率（次/min）

第一组 第二组 第三组

50 55 60

实验中呼吸频率（次/min） 42 90 112

治疗中呼吸频率（次/min） / / 56

死亡前呼吸频率（次/min） 8 10 /

抽搐痉挛发生时间（min） 22 27 25

使用复方氨溶液总量（ml） 40 40 35

死亡时

复发谷氨酸

间（min） 钠用量（ml） 34 48 /

/ / 60ml

第四组 46 50 55 / 34 40 / 40

第五组 76 80 60 / 45 55 / 66

3.2分组说明：

模型组：仔细观察家兔，出现抽动，不给复方谷氨酸钠溶液，给生理盐水，观察出现明显肝性脑病症状。

治疗组：仔细观察家兔，出现抽动，立即给复方谷氨酸钠溶液，实施抢救。

假手术组：手术全过程都做，只是不结扎肝脏，注入复方氯化铵溶液，观察是否出现肝性脑病症状。

预防组：耳缘静脉灌注复方谷氨酸钠溶液（30mg/kg），造模给复方谷氨酸钠溶液同时进行，直至症状缓解，并继续观察。

4.讨论

4.1假手术的目的：假手术组与模型组的不同点是其肝叶健全，即肝功能健全。主要用于对比证明肝对氨有解毒作用，由实验结果的第一、二组可见，肝功能不全的家兔对氨的解毒作用明显低于肝功能健全的家兔，说明肝有解氨中毒的作用。但是肝脏对氨的解毒功能是是有限的，当大剂量注入氨，超出肝脏代谢能力时，家兔也会出现氨中毒症状。

4.2复方氯化铵溶液对肝性脑病的作用机理，肝大部分结扎在实验中的作用：

4.2.1据氨中毒学说，正常情况下，血氨的来源于清除保持动态平衡，而氨在肝中合成尿素是维持此平衡的关键。在结扎大部分肝的基础上灌注氯化铵导致血氨增高，增高的血氨可通过血脑屏障进入脑组织，通过干扰脑组织的能量代谢，使脑内神经递质发生改变，引起脑的功能障碍，出现震颤、抽搐、昏迷等类似肝性脑病症状。

4.2.1.1氨使脑内神经递质发生改变：进入脑内的氨增多，与谷氨酸结合生成谷氨酰胺，使中枢兴奋性递质谷氨酸减少，而谷氨酰胺（近似于中枢抑制性递质）增多。此外，中枢兴奋性递质乙酰胆碱减少，中枢抑制性递质GABA及其受体信号变化。因此氨的增多使脑内的神经递质平衡失调，兴奋性递质减少，而抑制性递质增多，导致中枢神经系统功能紊乱。

4.2.1.2干扰脑细胞代谢：进入脑内的氨增多，可引起一下后果：①抑制丙酮酸脱氢酶的活性，妨碍丙酮酸的氧化脱羧过程，使NADH和乙酰辅酶A生成减少，进而三羧酸循环过程停滞，可使ATP产生减少；②肝性脑病后期由于丙酮酸脱氢酶和α-酮戊二酸脱氢酶活动受抑，变现为α-酮戊二酸水平降低，三羧酸循环反应过程不能正常进行，ATP产生减少；③α-酮戊二酸经转氨基过程生成谷氨酸或与自由氨合成谷氨酸过程，消耗了大量NADH，NADH是呼吸链中完成递氢过程的重要物质，其大量消耗可使ATP产生减少；④大量的氨与谷氨酸结合生成谷氨酰胺时，消耗了大量ATP。

4.2.1.3氨对神经细胞质膜的作用：氨增高可干扰神经细胞膜Na+-K+-ATP酶活性，影响细胞内外Na+、K+分布。

4.2.2肝大部分结扎术在实验性肝性脑病中的作用：采用家兔大部分肝结扎，是为了复制急性肝功能不全的动物模型，造成肝解毒功能急剧降低，在此基础上经十二指肠灌入复方氯化铵溶液，导致肠道中氨生成增多并吸收入血。

4.3家兔呼吸频率和肌紧张改变机制：

4.3.1家兔呼吸频率的改变：由实验数据可以看出，给药后家兔的呼吸频率是加快的，（由于个体差异的存在，第五组的呼吸频率一直保持在高水平）其中治疗组的呼吸频率的变化和模型组2及预防组的数据相比，可以猜测家兔呼吸频率的增加是由于氨中毒引起的。

4.3.2随着实验的进行家兔的肌紧张加剧，以至于出现抽搐甚至角弓反张等表现。血氨浓度升高，干扰脑组织的能量代谢，主要是干扰葡萄糖的生物氮化过程，而脑组织随时都要依赖血液中的葡萄糖提供能量。氨与脑内的α-酮戊二酸结合，生成谷氨酸，影响糖代谢，使ATP产生不足，产生谷氨酰胺为抑制神经的递质，并使脑内兴奋性神经递质减少，并且氨对神经细胞膜也有抑制作用是神经细胞兴奋性异常，并干扰神经传导活动。其中乙酰胆碱有扩张血管减慢心率的作用，从而可见家兔呼吸频率加快的原因。而其中肌紧张加剧可能由于脑组织中氨大量增加使大量谷氨酸转化成谷氨酰胺使氨中毒早期生成γ-氨基丁酸的底物-谷氨酸减少，引起脑内抑制性递质γ-氨基丁酸减少有关。

4.4复方谷氨酸钠溶液的作用机理：谷氨酸是中枢神经系统的一种递质 ,含量丰富 ,它在神经元间快速兴奋性突触传递和脑发育调节等方面发挥重要作用。由结果可知，谷氨酸钠对肝性脑病有一定的治疗作用。复方谷氨酸钠溶液为氨基酸类药。谷氨酸与血中过多氨结合而成为无毒的谷氨酰胺，由尿排出，进而降低血氨。谷氨酸还可参与脑细胞的代谢，改善中枢神经系统的功能。

5.班组结论

5.1肝功能健全可使氨中毒的作用时间延长，即肝有对氨的解毒作用。

5.2复方谷氨酸钠溶液有缓解氨中毒的作用。

6.参考文献

[1].金惠铭 王建枝.缺氧.病理生理学 .第7版.人民卫生出版社。2010

[2].朱大年.呼吸.生理学 .北京：人民卫生出版社，2008

[3].陆源、林国华、杨午鸣.机能学实验教程.第2版.北京:科学出版社.2010