分子生物学实验报告
姓名：马发辉
学院：生命科学学院
班级：生工114班
学号：2011013843
实验安排
Day1.
实验一、质粒DNA提取
实验二、P38质粒DNA酶切
实验三、琼脂糖凝胶电泳法测DNA
Day2.
实验四、聚合酶链反应（PCR）技术体外扩增DNA
实验五、植物基因组DNA提取及电泳分析
实验六、T-A克隆连接反应
Day3.
实验七、感受态细胞的制备及转化
Day4.
实验八、RNA提取及电泳分析
实验九、RT-PCR扩增目的基因cDNA及电泳检测
Day5.
实验十、地高辛标记的Southern杂交——Southern转移，探针标记
Day6.
实验十、地高辛标记的Southern杂交——Southern杂交
Day7.
实验十、地高辛标记的Southern杂交——BCIP/NBT显色检测
Day1. 2014.1.2
实验一质粒DNA的提取
一、目的
学习碱裂解法提取质粒的原理
二、原理
质粒DNA的提取是依据质粒DNA分子较染色体DNA分子小，且具有超螺旋共价闭合环状的特点，从而将质粒DNA与大肠杆菌染色体DNA分离。碱裂解法的主要原理：利用染色体DNA与质粒DNA的变性与复性的差异而达到分离的目的。在碱变性条件下，染色体DNA的氢键断裂，双螺旋解开而变性，质粒DNA氢键也大部分断裂，双螺旋也有部分解开，但共价闭合环状结构的两条互补链不会完全分离，当pH=4.8的乙酸钠将其pH调到中性时，变性的质粒DNA又恢复到原来的构型，而染色体DNA不能复性，形成缠绕的致密网状结构，离心后，由于浮力密度不同，染色体DNA与大分子RNA、蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。
三、实验材料、试剂与主要仪器
（一）实验材料
含绿色荧光蛋白GFP、P38质粒的菌液
（二）试剂
1、溶液Ⅰ：50mmol/L 葡萄糖,10mmol/L EDTA,25mmol/L Tris-HCl(pH 8.0)。
2、溶液Ⅱ：0.2mol/L NaOH,1% SDS。（必须新鲜配制）
3、溶液Ⅲ：pH4.8的醋酸钾溶液（5mo1／L乙酸钾 60 ml，冰乙酸11.5 ml，水 28.5ml）。
4、TE缓冲液（pH 8.0）：10 mmol/L Tris-HCl,1mmol/ L EDTA。
5、无水乙醇和70%乙醇。
（三）仪器
1、Eppendorf管、离心管架
2、10，100，1000μl微量加样器
3、台式高速离心机
4、摇床
四、操作步骤
1、将含有P38质粒1ml的菌液移入1.5ml 离心管，离心30秒（13000rpm），倒去上清液，如收集3ml 菌液，重复一次，倒转于滤纸除净残液。
2、将含有GFP质粒1ml的菌液移入1.5ml 离心管，离心30秒（13000rpm），倒去上清液。
3、加入100μl预冷的溶液Ⅰ(含5ug/μl RNAase)，用涡旋震荡器充分悬浮。
4、加入150μl溶液Ⅱ，快速颠倒温和混匀，室温放置5分钟。此时溶液应非常粘稠。
5、加入150μl 预冷的溶液Ⅲ，温和混匀（此时应有可见沉淀），在冰浴中5分钟。
6、12000rpm离心3分钟。转移上清液至另一1.5ml离心管中。
7、加800μl乙醇到上清液中，混匀， 12000rpm离心5分钟，除去上清（尽可能除去残）。
8、用0.5ml 70% 乙醇洗DNA沉淀一次，离心2分钟，除去乙醇（尽可能除去残液）。
9、超净台鼓风干燥DNA。
10、加30μl TE溶解DNA，待用（或-20℃保存）。
五、注意事项
1、在实验过程中加入的溶液Ⅰ主要作用是是细胞破裂，溶液Ⅱ的主要作用是是质粒和染色体变性，溶液Ⅲ的主要作用是是质粒复性而不能使蛋白质复性。
2、实验过程中除去上清液时应尽量除去，可在吸水纸上轻磕几下。同时要避免把沉淀吸出。
3、实验过程中要注意做好标记以备在以后的实验中辨认。
实验二 P38质粒DNA酶切
一、目的
学习质粒的酶切。
二、原理
限制性内切酶可以识别双链DNA特定位点，并产生特异的切割，形成粘性末端或平末端，这样有利于DNA片段再连接。
限制性内切酶对环状质粒DNA有多少切点，酶切后就能产生多少个片段。因此，鉴定酶切后的片段在电泳凝胶的区带数，就可以推断切点的数目；从片段迁移率的大小可以判断酶切片段大小的差别。用已知相对分子量DNA为对照，通过电泳迁移率的比较，可以粗略地测出分子形状相同的未知DNA的相对分子质量。
三、试剂与主要仪器
（一）试剂
1、EcoRⅠ酶
2、酶切Buffer（10×）
3、ddH2O
4、P38质粒提取液
5、RNA酶
（二）仪器
1、恒温水浴箱
2、微量加样器
四、操作步骤
1、取1.5ml灭菌离心管，依次加入20μl酶切体系：
质粒DNA 10μl
EcoRⅠ 2μl
酶切Buffer（10×） 2μl
ddH2O 5 μl
RNA酶 1μl
2、加样后混匀，置于37℃水浴中，保温2小时。然后每个管中加入4 μl Loading buffer。
五、注意事项
1、实验过程中使用微量加样器时注意更换枪头，以免造成污染。
2、实验过程中注意标记以及留样以免在后面的实验中继续使用。
实验三琼脂糖凝胶电泳法检测DNA
一、目的
学习琼脂糖凝胶电泳，检测DNA的纯度，DNA的构型，含量以及分子量的大小。
二、原理
琼脂糖凝胶电泳的原理是溴化乙啶在紫外光照射下能发射荧光，当DNA样品在琼脂糖凝胶中电泳时，琼脂糖凝胶中的EB就插入DNA分子中形成荧光络合物；使得DNA发射的荧光，增强几十倍。而荧光的强度正比于DNA的含量，如将已知浓度的标准样品做琼脂糖凝胶电泳的对照，就可比较出待测样品的浓度。电泳后的琼脂糖凝胶块直接在紫外光下照射拍照，只需5~10ng DNA，就可以从照片上比较鉴别。如肉眼观察，可检测到0.01~0.1ng的DNA。
在凝胶电泳中，DNA分子的迁移速度与分子量的对数值成反比。DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时，有电荷效应与分子筛效应，前者由分子所带净电荷的多少而定，后者则主要与分子大小及构型有关。DNA分子在高于其等电点的溶液中带负电荷。在电场中向着正极移动，在用电泳法检测DNA分子时，应当尽量减少电荷效应。增加凝胶的浓度可以在一定程度上降低电荷效应，使得分子的迁移速度主要由分子受凝胶阻滞程度差异所决定，提高分辨率。同时适当降低电泳时的电压，也可以使分子筛效应相应增强而提高分辨率。
三、试剂与主要仪器
（一）试剂
1、质粒和酶切产物
2、TBE缓冲液（5×）：用时需稀释10倍（配制见附录）
3、点样缓冲液Loading buffer（10×）：0.25%溴酚蓝，40%甘油
4、溴乙啶(EB)：10mg/ml溴乙啶
5、琼脂糖
（二）仪器
1、电泳仪系统
2、凝胶成像系统
3、恒温水浴箱
四、操作步骤
1、选择合适的水平式电泳仪，调节电泳槽平面至水平，检测稳压电源与正负极的线路。
2、选择孔径大小适宜的点样梳，垂直架在电泳槽负极的一端，使得点样梳的底部与电泳槽水平面的距离为0.5~1.0mm。
3、制备琼脂糖凝胶：按照被分离的DAN分子的大小，决定凝胶中琼脂糖的百分含量。一般情况下可参考下表：
称取琼脂糖溶解在电泳缓冲液中，一般配制约40ml 凝胶液，置微波炉中或水浴加热，至琼脂糖融化均匀。
4、待凝胶溶液冷却至60℃左右时，摇匀，轻轻倒入电泳槽水平板上，除掉气泡，并在一端插好梳子。待凝胶完全凝固后，将凝胶槽移至电泳槽（槽中已加入TBE缓冲液），然后小心地拔掉梳子保持点样孔完整。注意：缓冲液要高出凝胶面2㎜。
5、点样：分别将5μl质粒+Loading buffer（10×）1μl；10μl酶切产物+Loading buffer（10×）1μl加入胶孔中，并记录样品点样顺序。
6、跑胶：开启电源开关，80mA,120V左右，最高电压不超过5V/cm。
7、观察：带一次性手套将胶小心取出，放到EB染液中染色10min，之后小心放到紫外灯下观察。
五、注意事项
1、EB具致癌作用，实验时带一次性手套，使用完及时处理，及时洗手。
2、用微波炉加热至沸即可停止，再加热至沸，反复几次，使其充分溶解直到溶液澄清。
3、电泳仪使用前检查其电源及正负极接线柱，不要将胶的方向放反，核酸带负电，应从负极到正极。
4、实验结果根据marker的大小对比，只看到一条带较为明显，可能是因为Loading buffer浓度太大使颜色过深以至于看不到第二条带。
六、实验结果及分析讨论：
P38质粒和酶切产物电泳图谱
第7孔：2000Marker
第8孔：P38质粒
第9孔：酶切产物
结果分析：
（1）P38质粒电泳结果有两条带，说明含有质粒，切根据与DNA Marker比较可知大小均大于2000bp,可能为同一质粒的两种构型。与其他组相比，在靠近孔道位置有模糊亮条带，可能是由于震荡剧烈造成条带断裂，以后的操作中要注意规范操作。有拖带现象，原因是RNA在质粒提取过程中有降解。
（2）酶切产物电泳结果有一条亮带。质粒为环形，理论上酶切产物电泳后应该有两条，一大一小两条亮带，该结果只显示出一条带。可能原因有：loading buffer过于浓，暗条带过深把亮带遮住了。以后实验中可适当减少loading buffer用量。
DNA marker可以指示不同的DNA片段大小，DL2000是较常用的一种marker, 片段介于100-2000之间，由DNA片段2,000 bp、1,000 bp、750 bp、500 bp、250 bp以及100 bp 组成，共6条带。
（3）电泳前期没控制好电压，电压过高。电泳一般控制在100V左右，电压在80mA即可。
七、补充知识
DNA marker可以指示不同的DNA片段大小，DL2000是较常用的一种marker, 片段介于100-2000之间，由DNA片段2,000 bp、1,000 bp、750 bp、500 bp、250 bp以及100 bp 组成，共6条带。
根据亮度比较还可以确定样品中DNA含量。
Day2. 2014.1.3
实验四聚合酶链反应（PCR）技术体外扩增DNA
一、目的
学习PCR反应的基本原理和实验技术。
二、原理
聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）是体外酶促合成DNA片段的一种技术。利用PCR技术可在数小时之内大量扩增目的基因或DNA片段，以用于基因工程操作。
PCR进行的基本条件：
⑴DNA模板（在RT-PCR中模板是RNA）
⑵引物
⑶dNTP（dATP、dTTP、dGTP、dCTP）
⑷Taq DNA聚合酶
⑸反应缓冲体系
PCR循环由三个步骤组成：
⑴变性 使模板DNA解离成单链；
⑵退火 使引物与模板DNA所需扩增序列结合；
⑶延伸 DNA聚合酶利用dNTP合成与模板碱基序列互补的DNA链。
每一个循环的产物可作为下一个循环的模板，通过30个左右循环后，目的片段的扩增可达106倍。
本实验以实验一中提取的P38质粒DNA为模板，进行PCR扩增，大量得到目的DNA片段。
三、试剂与仪器
（一）试剂
1、Taq DNA聚合酶
2、10×反应缓冲液（含25mmol MgCl2）
3、dNTP
4、引物（P1、P2）
5、溴乙啶 (EB)： 10mg/ml溴乙啶。 注意：该试剂具致癌作用，用时要小心。
6、点样缓冲液Loading buffer（10×）：0.25%溴酚蓝，40%甘油。
7、P38质粒提取液
（二）仪器
1、PCR扩增仪
2、电泳仪
3、台式离心机
4、凝胶成像系统
四、操作步骤
（一）PCR扩增
1、按下表加入试剂，并小心混匀。模板为实验一中提取的P38质粒DNA。
2、设置PCR程序：
94 ℃ 180s
94 ℃ 45s
35 cycles: 55℃ 45s
72 ℃ 60s
72 ℃ 600s
3、运行PCR程序
（二）PCR产物鉴定
反应结束后，取30μl PCR产物进行琼脂糖电泳分析。
五、注意事项
1、mix含有酶，操作中注意放在冰上，否则酶会失活。
2、在进行PCR扩增加试剂的过程中注意顺序以及更换合适的微量移液器。
实验五植物基因组DNA提取及电泳分析
一、目的
掌握植物基因组DNA提取的一般方法及注意事项。
二、原理
本实验方案用CTAB法，首先通过含有CTAB高盐抽提液使DNA充分溶出，然后加入氯仿使蛋白和细胞碎片沉淀，离心后，溶液分为三层，上层为CTAB与核酸的复合物的高盐溶液，中层为蛋白质和细胞碎片，下层为氯仿。取出上清加入异丙醇使核酸沉淀。
由于CTAB能溶解于乙醇，在洗涤过程中CTAB即可被除去。
三、实验材料、试剂与主要仪器
（一）实验材料
小麦幼苗
（二）试剂
1、DNA extraction ：500ml
31.885g sorbitol (山梨醇)
6.05g tris PH8.2 (一般不调)
2、Nuclei lysis buffer: 500ml
100ml 1M Tris PH7.5
100ml 0.25M EDTA
200ml 5M NaCl
10g CTAB
100ml ddH2O
3、5% sarkosyl (N-月桂酰肌氨基钠盐) 500ml
用时，将上述三种溶液按1：1：0.4 比例混匀，加入亚硫酸氢钠（3.8g/l），即为抽提液。
4、氯仿：异戊醇（24：1）
5、70% 乙醇
6、异丙醇
7、TE
（三）器材
1、台式离心机
2、恒温水浴
4、微量加样器
四、操作步骤
（一）基因组DNA提取
1、取0.3g左右小麦叶片，在液氮中研磨后放入1.5ml离心管中，加入700μl抽提液（65℃预热）混匀，放入65℃水浴中，裂解30分钟，期间温和混匀几次。
2、取出裂解好的DNA ，加入700μl 氯仿：异戊醇（24：1），猛烈混匀，离心（10000rpm,10分钟）。
3、取上清于新管中，加入0.8-1倍预冷异丙醇，缓慢混匀后，再猛烈混匀，使DNA成团，室温放置15min。
4、将析出的DNA 离心，14000rpm,10分钟。
5、去掉上清，将沉淀用1ml 70% 乙醇清洗一次，离心干燥，溶于50μl TE或水中。
（二）电泳分析
取10μl 基因组DNA混入1μl loading buffer进行琼脂糖电泳分析。
五、注意事项
1、实验过程中加入氯仿：异戊醇的作用是去除蛋白质，加入异丙醇
的作用是沉淀核酸。
2、实验过程中吸取上清液时注意不要混入氯仿，以免造成污染。
六、实验结果及分析讨论
PCR产物及植物基因组DNA电泳图谱
第8孔：2000Marker
第4、5孔：PCR产物
第12孔：植物基因组DNA
实验结果分析：
（1）PCR产物条带不明显，只有一条亮带显著，可能原因是loading buffer 稀释浓度太低，导致产物四周扩散，结果不理想。
（2）植物基因组DNA，靠近孔道位置有一条亮带没说明植物基因组DNA 很大，约为600bp。泳道有弥散现象，说明混有RNA，提取时应注意操作规范。
实验六T-A克隆连接反应
一、目的
掌握DNA体外连接的基本技能，了解连接反应的注意事项。
二、原理
DNA片段之间的连接是通过DNA连接酶的催化实现的。DNA连接酶催化具有平末端或互补粘性末端的DNA片段间相邻碱基通过3’,5’磷酸二酯键连接起来，该反为需能反应，通常需要加入ATP或NADH，DNA连接酶对粘性末端的连接效率要远高于对平末端的连接效率。在基因基因工程实验中，最常用的来源于T4噬菌体的T4DNA连接酶。对于平末端或互补的粘性末端可直接进行连接反应。一个片段是平末端，另一片段为粘性末端或两个片段都是粘性末端但不配对，则需要通过各种方式使其可一匹配或通过平末端进行连接。通常采用末端补平、加同聚物尾、加接头等方式是目的片段之间能够匹配。
进行连接反应时，为了减少片段的自连，通常要进行去磷酸化，去磷酸化可通过碱性磷酸酶完成。比如将目的片段和载体进行时通常要将载体去磷酸化，以减少载体的自连。同要进行连接反应也经常对目的片段进行磷酸化以增强目的片段的连接，在相邻碱基间如果没有磷酸在连接效率大幅下将，如果载体进行了去磷酸化，目的片段可进行磷酸化，以增强目的片段和载体的连接。
在连接反应中，目的DNA片段和载体的比例是一个关键问题，对于长度为1kb的片段和3kb的载体而言，通常目的片段和载体的比例设为2：1或3：1，如果目的片段越长该比例应再升高，因为主要考虑的是载体和目的片段之间的分子数的比例。反应体系中核酸的浓度也是一个重要问题，通常反应体系中反应物浓度应保持在25 --100 ng / μl。
连接反应和其它酶不同，需要在较低的温度下进行，通常在12～16℃过夜，也可在4℃过夜连接，如果是平末端连接，可适当提高连接温度。除上述因素外，DNA样品的纯度、盐浓度等会影响连接效率。
三、试剂与器材
（一）试剂
1、目标DNA片段
2、载体（pGEMT-easy）
3、2 × ligation 缓冲液
4、T4 DNA连接酶
5、ddH2O
（二）器材
1、台式离心机
2、恒温水浴
3、微量移液器
四、操作步骤
1、连接体系10μl，取一个1.5ml离心管依次加入下列试剂:
2 × buffer： 5μl
pGEMT-easy： 1μl
目的片段： 3μl
T4连接酶： 1μl
2、离心机离心30S，使反应体系充分混合。
3、16℃过夜连接。温度越低，反应时间越长。
五、讨论及注意事项
1、 实验过程中在往离心管中加入试剂时注意顺序，依次加入。
2、选用Taq酶，而不选用保真性好的Pfu酶，是因为Pfu酶无加A的功能。
Day3. 2014.1.6
实验七感受态细胞的制备及转化
一、目的
掌握感受态细胞制备和转化的基本方法。
二、原理
受体细胞经过一些特殊方法如电击法, 化学试剂法（CaCl2 ,RbCl，KCl)等的处理后,细胞膜的通透性发生了暂时性的改变,成为能允许外源DNA分子进入的感受态细胞。
三、试剂与器材
（一）试剂
1、0.1mol/L CaCl2取20ul PCR产物进行1.2%琼脂糖电泳分析。
2、T-A连接产物
3、GFP质粒
4、氨苄青霉素（100mg/mL）
（二）器材
1、冷冻离心机
2、平衡天平
3、无菌操作台
4、微量移液器
四、操作步骤
（一）感受态细胞的制备(0.1M CaCl2方法)
1、取培养好的菌液1.5 ml于一离心管中，4℃ 离心8 000rpm×1 min。
2、弃上清，加500 ul0.1M CaCl2 (灭菌预冷)洗菌体，4℃冷冻离心8000rpm×1 min。
3、彻底除去残液, 加200 ul0.1M CaCl2 (灭菌预冷)，悬浮菌体。
4、冰浴静置 30 min ，4℃冷冻离心8000rpm×1 min。
5、弃上清，加100 ul0.1M CaCl2 (灭菌预冷)，悬浮菌体，即为制备好的感受态细胞。
（二）质粒对大肠杆菌的转化
1、将连接产物加入100 ul制备好的感受态细胞，冰上放置10 min。
2、42℃热激90S。
3、迅速冰浴3min。
4、加入300 ul LB液体培养基，37℃轻摇培养45min。
5、取培养基50ul，Amp 50ul倒平板，在表面涂匀IPTG 7ul+X-gal 40ul+100 ul LB，转化时将T-A连接产物全部加入。
6、取培养基50ul，Amp 50ul，Para 0.1g倒平板，在表面涂匀100 ul LB，转化时加入1ul GFP质粒。
7、37℃倒置，避光培养16-20 h。
五、注意事项
1、整个过程注意无菌操作和保持低温。
2、培养物处于对数生长期是制备感受态细胞的关键。
3、如果要求高转化效率，不建议使用简单深冻保存的感受态细胞。
4、LB液体培养基建议用不加抗生素和加抗生素的两种培养基，检查菌体是否污染。
六、实验结果及分析
（1）T-A连接产物的蓝白斑筛选结果
T-A连接产物的蓝白斑筛选
过夜培养，可观察到大多数菌落为白色，少数菌落为蓝色，说明T-A连接成功的菌株较多，本次试验成功。
（2）阿拉伯糖诱导绿色荧光蛋白的表达
阿拉伯糖诱导绿色荧光蛋白的表达
过夜培养，经紫外线照射，可观察到菌落有荧光，说明荧光蛋白表达。对照组不加阿拉伯糖的则观察不到荧光现象，试验成功。
七、补充知识
蓝白斑筛选是重组子筛选的一种方法： 是根据载体的遗传特征筛选重组子，如α-互补、抗生素基因等。现在使用的许多载体都带有一个大肠杆菌的DNA的短区段，其中有β-半乳糖苷酶基因（lacZ）的调控序列和前146个氨基酸的编码信息。在这个编码区中插入了一个多克隆位点（MCS），它并不破坏读框，但可使少数几个氨基酸插入到β-半乳糖苷酶的氨基端而不影响功能，这种载体适用于可编码β-半乳糖苷酶C端部分序列的宿主细胞。因此，宿主和质粒编码的片段虽都没有酶活性，但它们同时存在时，可形成具有酶学活性的蛋白质。这样，lacZ基因在缺少近操纵基因区段的宿主细胞与带有完整近操纵基因区段的质粒之间实现了互补，称为α-互补。由α-互补而产生的LacZ+细菌在诱导剂IPTG的作用下，在生色底物X-Gal存在时产生蓝色菌落，因而易于识别。然而，当外源DNA插入到质粒的多克隆位点后，几乎不可避免地导致无α-互补能力的氨基端片段，使得带有重组质粒的细菌形成白色菌落。这种重组子的筛选，又称为蓝白斑筛选。如用蓝白斑筛选则经连接产物转化的钙化菌平板37℃温箱倒置培养12-16hr后，有重组质粒的细菌形成白色菌落。
设计适用于蓝白斑筛选的基因工程菌为β-半乳糖苷酶缺陷型菌株。这种宿主菌的染色体基因组中编码β-半乳糖苷酶的基因突变，造成其编码的β-半乳糖苷酶失去正常N段一个146个氨基酸的短肽（即α肽链），从而不具有生物活性，即无法作用于X-gal产生蓝色物质。用于蓝白斑筛选的载体具有一段称为lacz'的基因，lacz'中包括：一段β-半乳糖苷酶的启动子；编码α肽链的区段；一个多克隆位点(MCS)。MCS位于编码α肽链的区段中，是外源DNA的选择性插入位点。虽然上述缺陷株基因组无法单独编码有活性的β-半乳糖苷酶，但当菌体中含有带lacz'的质粒后，质粒lacz'基因编码的α肽链和菌株基因组表达的N端缺陷的β-半乳糖苷酶突变体互补，具有与完整β-半乳糖苷酶相同的作用X-gal生成蓝色物质的能力，这种现象即α-互补。
操作中，添加IPTG(异丙基硫代-β-D-半乳糖苷)以激活lacz'中的β-半乳糖苷酶的启动子，在含有X-gal的固体平板培养基中菌落呈现蓝色。以上是携带空载体的菌株产生的表型。当外源DNA（即目的片段）与含lacz'的载体连接时，会插入进MCS（即靶基因），使α肽链读码框破坏，这种重组质粒不再表达α肽链，将它导入宿主缺陷菌株则无α互补作用，不产生活性β-半乳糖苷酶，即不可分解培养基中的X-gal产生蓝色，培养表型即呈现白色菌落。
实验中，通常蓝白筛选是与抗性筛选一同使用的。含X-gal的平板培养基中同时含有一种或多种载体所携带抗性相对应的抗生素，这样，一次筛选可以判断出：未转化的菌不具有抗性，不生长；转化了空载体，即未重组质粒的菌，长成蓝色菌落；转化了重组质粒的菌，即目的重组菌，长成白色菌落。
Day4. 2014.1.7
实验八 RNA提取及电泳
一、目的
掌握RNA提取的基本技术，了解RNA提取过程中的各种注意事项。
二、原理
RNA提取是分子生物学实验中难度较大的实验技术。
RNA提取和DNA提取有类似的地方，因为它们都是核酸，都具有较好的水溶性。提取RNA首先破碎细胞，然后用提取液将RNA溶出，反复抽提去除蛋白质，加入乙醇沉淀RNA，将RNA沉淀溶解备用。那么如何区分DNA和RNA分开？DNA和RNA的溶解性不同，DNA在1M的盐溶液中具有最好的溶解度，而RNA在0.14M的盐溶液中具有最好的溶解度，所以可以利用它们的溶解性将它们进行区分。另外，RNA的分子量一般比较小，而DNA分子很大且和蛋白结合成复合体，所以DNA更容易随蛋白沉淀，而RNA具有较好的溶解性。
RNA提取的另一个关键问题就是如何抑制或去除环境中RNA酶。所有的玻璃、陶瓷和铁器具在180℃×6 h以上。所有的塑料器皿用0.1％的DEPC水37℃过夜浸泡，然后湿热灭菌80℃烘干备用。配制溶液所需的水也要用DEPC处理过的水，而配置Tris相关的缓冲液时Tris会与DEPC发生反应，应避免用DEPC处理。另外操作过程中应戴手套。
三、试剂与器材
（一）试剂：
1.Ttizol Reagent
2.氯仿
3.异丙醇
4.70%无水乙醇
5.DEPC
6.暗培养7天的小麦苗，用前光照诱导3 h
（二）器材：
1、研钵
2、离心机
（三）实验步骤
1、称取小麦叶片50-100mg,于研钵中加液氮研磨成粉末，迅速转移到1.5ml离心管中。
2、加入1 ml Trizol Reagent，15～30℃×5min。
3、加入0.2ml氯仿，剧烈振荡15 sec，15～30℃×3min。
4、冷冻离心12 000 rpm×15min。
5、将上清液转移到另一个离心管中，加0.5ml预冷异丙醇,混匀 ，室温放置20min。
6、冷冻离心12 000 rpm×10min。
7、加入0.5ml 70% 乙醇洗RNA沉淀，悬浮，7500 rpm×2min，除去乙醇。
8、加入30 ul DEPC 处理过的ddH2O溶解RNA。
9、电泳检测RNA
五、注意事项
1、实验过程中要注意带手套，避免污染。
2、实验过程中要注意抑制或去除环境中的RNA酶，实验中的各种器皿都要经过DEPC处理。
六、实验结果
未做出结果，因为电泳凝胶做错了，浓度过大，导致无法正常进行电泳。预期结果应该有大分子的条带，可能有拖带现象。
本次实验失败告诉我们，在实验中要注意每一步操作，否则都会得不到预期的结果。
实验九 RT-PCR扩增目的基因cDNA
一、目的
学习从细胞或组织的RNA中用逆转录PCR扩增目的基因的技术及操作。
二、原理
普通PCR方法可以以DNA为模板扩增基因，但真核生物的基因组中通常分为可转为mRNA的外显子和不转录的成mRNA的内含子，所以从染色体DNA用PCR方法扩增出的基因是内含子和外显子相间排列的DNA分子，不能用于基因工程的直接表达。如果用人工的方法把内含子去除，是极其烦琐费力的事。逆转录PCR利用逆转录病毒依赖于RNA的DNA逆转录合成酶，在反义引物或oligo（d T）的引导下合成mRNA互补的DNA（complemental DNA），再按普通的PCR的方法用两条引物以cDNA为模板，扩增出不含内含子的可编码完整蛋白的基因。这一DNA的5，和3，端经改造可直接用于基因工程的表达，因此逆转录PCR成为了目前获取目的基因的一条重要途径。
三、试剂与器材
（一）试剂
1、RNA模板
2、cDNA引物
3、反转录缓冲液
4、dNTP
5、AMV反转录酶
6、RNA抑制剂（RNasin）
7、Taq酶及10×PCR缓冲溶液
8、引物（P1、P2）
（二）器材
1、PCR扩增仪
2、电泳仪
3、台式离心机
4、恒温水浴
四、操作步骤
（一）RNA的反转录
① 在小EP管中依次加入
RNA模板 5 μl
Olig（dT）18引物 1μL
DEPC H2O 6 μL
混合后，70℃水浴5 min（破坏二级结构），迅速冰浴5min。
② 在管中依次加入 (反应体系为20 μL)：
RT 5×buffer 4μL
RNasin 1μL
10mM dNTP 2μL
混匀，37℃ 5min。
M-MULV反转录酶 1 μL
置于 42℃水浴，1h。
③ 70℃保温5min（使酶失活）。
④ 于-20℃保存备用。
（二）RNA（RT-PCR）和DNA（PCR）
配置30 μL反应体系，在灭菌的0.5ml PCR管中，依次加入
PCR程序：
94 ℃ 3 min
95 ℃ 30 s
35 cycles: 55 ℃ 60 s
72 ℃ 90 s
72 ℃ 10 min
（三）PCR产物的鉴定
取10ul PCR产物进行琼脂糖电泳分析。
五、注意事项
1、操作时要保持在低温，保证酶活力。
2、加入体系后要混匀再进行PCR处理。
六、实验结果
未做出结果，因为电泳凝胶做错了，浓度过大，导致无法正常进行电泳。
预期结果应该是PCR电泳结果比RT-PCR条带多。因为PCR以DNA为模板进行扩增，而RT-PCR以RNA为模板进行扩增，DNA含有内含子和外显子，而RNA不含内含子。
Day5-7. 2014.1.8-2014.1.10
实验十、地高辛标记的Southern杂交
一、目的
学习Southern杂交的原理及操作方法。
二、原理
1975年Southern发明了Southern blot分子杂交方法。这项技术包括在琼脂糖凝胶上按片段大小电泳分离待检的DNA；用NaOH对凝胶中的DNA进行变性处理；通过毛细管作用将单链DNA吸附到硝酸纤维素膜上；然后用标记好的探针进行杂交，洗掉没有杂交的游离探针；经放射性自显影（放射性标记探针）或生化检测（非放射性标记）就可以证明基因片段与已知探针是否具有同源性，达到检测样品基因的目的。因此，Southern印迹杂交包括两个步骤①把电泳分级的DNA转移到固定支持膜上。②与标记的DNA探针杂交。
地高辛随机引物法标记的原理：在随机引物法标记的反应液中，有随机合成的六聚核苷酸作为引物，dATP、dCTP、dGTP、dTTP和D1G-11-dUTP作为合成底物，以单链DNA作为模板，在Klenow酶的作用下，合成插入地高辛的DNA链。以地高辛标记的探针与靶基因DNA链杂交后，再通过免疫反应进行检测。一般通过酶标记地高辛抗体检测，就可以肯定杂交反应的存在。免疫检验一般用碱性磷酸酶系统，BClP/NBT显色，敏感性很高。
所用的杂交膜可以选择硝酸纤维素和尼龙膜。硝酸纤维素膜的优点在于本底较低，但只能用于显色性检测，且不能用于重复杂交。尼龙膜分为带正电的膜和不带电的膜两种。带正电的膜对核酸结合力强，敏感性也高。不带电的结合力低。敏感性差。尼龙膜的优点在于杂交用过的膜，用洗脱液（0.1×SSC,0.1%SDS）煮沸5-10分钟后去探针，可用于新的探针杂交。如果对杂交结果不满意，如背景太高或显色不强，也可洗去探针之后重新杂交。
三、试剂与器材
（一）试剂
1、DIG Random Labeling Mix（高效）
2、Anti-DIG-AP Conjugate
3、BCIP/NBT Stock Solution
4、Blocking Reagent
5、20×SSC 0.3M 柠檬酸钠，3M NaCl
6、2×SSC 0.03M 柠檬酸钠，0.3M NaCl
7、0.2M EDTA
8、变性液：0.5N NaoH,1.5M NaCL
9、中和度： 0.5M Tris-HCl,Ph7.4,3M NaCl
10、Standard buffer 5Xssc,0.1%(w/v) N-Lauroylsarcosine, 0.02% (w/v) SDS, 1% Blocking Reagent。
11、Standard buffer+50%formamide
12、Anti-DIG-AP碱性磷酸酶标记抗地高辛单抗体。
13、BC/NBT储备液：
14、冲洗液：0. 1M Tris-HCl,0.15 M NaCl. PH=7.5.
15、封闭液：1%Blocking Reagent/ 0.1M Tris-HCl ,0.15M NaCl.
16、显色缓冲液：0.1mM Tris-HCl,0.1M NaCl, pH=9.5.
17、TE缓冲液：10mM Tris，1mM EDTA，PH 8.0
（二）仪器
1、台式离心机
2、恒温水浴
3、白磁盘
4、杂交炉
5、电泳系统
6、硝酸纤维素膜或尼龙膜
7、封口机
四、操作步骤
（一）Soutern转移
1、将目的基因经琼脂糖凝胶电泳的胶板从电泳槽中取出。
2、进入变性液之前，用蒸馏水漂洗20分钟。
3、把凝胶浸入变性液中，室温浸泡15分钟×2次。
4、蒸馏水漂洗凝胶2次。
5、把凝胶浸入中和液中，室温泡15分钟×2次。
6、处理凝胶的同时，切一张同样大小的硝酸纤维素膜。硝酸纤维素膜用2 × SSC 浸泡。剪两张Whatman3#滤纸和吸水用的粗滤纸。注意不要用手直接触及膜面。
7、准备转移用平器和支架，平器中放20 × SSC 。支架上搭滤纸桥使得溶液能够虹吸上来。
8、依次放：玻璃板，滤纸，处理好的凝胶，硝酸纤维素膜，泡沫，吸水纸，适量重物（500-1000g）。
9、于室温转移12-20小时。
注意事项
1、检查pH值，用硝酸膜时pH<9。
2、搭桥时要确保各层间没有气泡，否则会发生局部绝缘，气泡处的DNA 难以吸附到膜上。
3、泡沫以上的物品不能直接接触胶及以下溶液和滤纸，以防止吸收。
（二）探针的标记
1、用灭菌去离子蒸馏水稀释1μgDNA至总体积16μl.。
2、DNA热变性：把DNA置于沸水中，水浴10分钟。然后，迅速地插入碎冰中3分钟以上。
3、加4μl DIG Random Labeling Mix(高效)，混匀后再离心2000/rmp 5分钟。
4、置于37℃反应至少120分钟。时间越长，产量越高。延长反应时间至20小时可明显增加地高辛标记DNA的产量。应根据需要控制反应时间。
5、加入2μl EDTA以终止反应，对于原位杂交和膜反应杂交来说，标记反应可告结束，上述反应液置于-20℃保存至少一年以上。且可反复使用。
可根据下表估计标记产量：单位（ng）
（三）Southern杂交
1、取出转移膜，用2 x SSC 漂洗数次，以去处困难吸附在膜上的凝胶。
2、固定：硝酸纤维素膜置于普通烘箱中120℃烘烤40分钟。
3、将转移好的硝酸纤维素膜装入杂交管中，贴壁放置（吸附有核酸的一面不要贴壁），赶走杂交膜和管壁间的气泡。
4、加入20ml Standard buffer，65℃预杂交4-20小时。
5、将制备的DNA探针沸水浴加热10min。然后迅速插入冰中。全部加入杂交管。
6、使用和预杂交相同的杂交温度，一般杂交16—20小时。
（四）BCIP/NBT显色检测
1、取出杂交膜，用Wash Solution I 洗5分钟X 3次。
2、保温冲洗：用 Wash Solution II 于68℃冲洗15分钟X 2次。
3、经过杂交及杂交后的冲洗之后，膜置于冲洗液中平衡1分钟。
4、用干净的平皿，封闭液室温封闭至少60分钟。
5、加Anti-DIG-AP，37℃反应60分钟。
6、用冲洗液洗5分钟X 4次，每次100ml。
7、显色缓冲液20ml平衡2分钟后倾掉。
8、加100ml底物显色液（100 cm2）。将膜及显色剂封在塑料袋中，开始避光显色。显色过程中可以观察。一般数分钟即开始出现颜色，显色过程可以持续至12小时。应绝对避免震动，以免出现颜色带的移位。
9、当所需要的显色点或带出现之后，蒸馏水洗以终止反应。结果可以进行照相记录；也可以直接保存于TE缓冲液，在此情况下，颜色长期不退。还有一种选择时让膜干燥，颜色消褪。但若将膜放置于TE缓冲液中，显色重新出现。
五、实验结果
Southern杂交的硝酸纤维素膜结果
第三条：酶切产物
第四条：P38质粒
结果分析：
P38质粒有一条显色带，酶切产物有两条显色带，证明外源基因是成功导入受体材料的基因组
心得体会
至此，分子生物学实验课程已经结束，回首一周多时间来实验室的忙碌与充实，在欣喜自己学到实验技能的同时，也再一次重温了分子生物学的知识要点。为了更好的完成每次实验，除了悉心听取老师的讲授，我和队友积极讨论以及翻阅电子文献，在实际操作中牢固掌握理论知识，夯实自己的实验技能。
在每次的实验当中，我和队友分工协作，确保每一步实验都操作正确。即使在集体完成的大实验当中，我也是积极参与其中，在为大家服务的同时，抓住每一次学习实验技能的机会，尽可能全面掌握所涉及到的整套实验操作方法，锻炼自己的动手能力和独立完成实验的能力。应该说，我所收获的远远大于我所付出的，累但是快乐着。
回顾一周所学，从最先的草草了解技术到最后的实际应用，这一周的充实是值得的。从基因组DNA的提取到聚合酶链式反应，再到酶连载体及感受态细胞的制备与转化，到最终的Southern杂交；从制备凝胶跑电泳到凝胶成像系统操作，再到离心机、水浴锅、摇床培养等一系列操作，我无不一一尝试并牢记在心。
作为一位想要在科研道路上有所建树有所发展的人，个人认为必须首先要有严谨的科学精神和探索求知的理性精神。每一项实验都应该基于实事求是的严谨设计，每一位同学都应该怀有志在求真的科学探索态度，唯此，在科学实验的道路上我们才能越走越远。其次，在集体大实验中，互助共进的协作精神是必不可少的。在实验探讨时，虚心听取队友的意见和想法，拓宽自己的视野，在不断地思维碰撞之中，更全面、更准确、更接近客观实际的开展实验，为得出理想的实验结论奠定基础。
当然实验的圆满完成离不开老师的悉心指导和解疑答惑，合作之中，收获分享知识的快乐。虽然这只是短短一周的实验训练，但是收获颇多，在每一步的实验过程中，我们亲自动手，熟练掌握了相关的实验技能，培养了严谨认真的实验态度，为以后的实验训练起了很好的预练目的。
西安市莲湖区白鹭湾西区408号楼404#