《植物组织培养技术》课程
实验实训教学大纲
(20##级食用菌与蔬菜专业适用)
生物工程与农业经济系
濮阳职业技术学院
20##年9月
说 明
本大纲是根据20##级三年制食用菌与蔬菜专业教学计划而制订的。
一、课程性质和任务
植物组织培养技术实验实训课程是食用菌与蔬菜专业专业的主要专业基础课程之一。
植物组织培养是在无菌条件下，利用人工培养基对植物的器官、组织、细胞和原生质体进行培养的技术，是现代生物技术的核心技术之一。在植物的优良品种快速繁殖，脱毒苗木生产、缩短育种进程、种质资源保存等方面具有其它技术无法比拟的优势。
植物组培实验实训课程的教学任务在于使学生掌握组织培养的基本操作技能和技巧，为进一步开展组培实训及从事组织培养工作奠定基础。
为适应高职高专教育改革的要求、突出高职高专教育的特点，适应本地农村产业结构调整的需要，本大纲以20##年的教学大纲为蓝本，在教学内容上进行了调整。
2、本课程教学的基本内容：
本课程是一门理论性、技术性和实践性强的的课程，通过本课程的学习，要求学生掌握植物组织培养基础知识、基本理论和基本技术。重点是植物的快速繁殖技术和组培苗工厂化生产技术。并紧紧围绕培养高等应用型技术人才，以强化技术应用能力培养为主线，着眼于培养学生应职岗位综合能力和创新精神，提高学生实践动手能力、科学实验能力、技术推广与市场开拓能力和组培苗工厂化生产经营与组织管理能力。
3、内容安排与学时分配
本大纲将教学内容分为实验教学、实训教学两个模块。实验教学结合理论讲授，在第三学期开设，共22学时。实训教学在第三、四学期开设，每学期为期一周。具体教学内容和学时分配见下表：
（一）、实验教学时数分配表
（二）、实训教学安排
4、考核办法
根据学生的实验实训操作、实验报告记载情况及结果来衡量学生的成绩，占总成绩的30%。
5、执行本大纲时应注意的事项
1)、 注意对实验原理的讲解，真正使学生掌握实验的原理。
2)、 实验过程要认真设计，精讲多练，注意关鍵技术环节的把握。
3)、 做好演示实验，防止学生实验的盲目性。
4)、 将实验作为实训的一种形式，加强学生动手能力的培养，分组协作完成实验内容。
5)、 加强过程考核，注重思维能力、分析解决问题能力的培养。
《植物组织培养技术》实验实训内容
一、实验内容
实训一、参观植物组织培养实验室及实习基地
目的要求：
使学生掌握如何组建植物组织培养实验室和育苗温室，掌握组织培养实验室的规划与布局、常用仪器设备的使用方法；基本掌握组织培养常用的实验仪器设备的构造。
教学内容：
组织培养实验室的规划与布局；分析天平的使用；蒸馏水器的使用；高压灭菌锅的使用方法；操净工作台的正确使用；磁力搅拌器、PH计的使用。
实训二、植物组织培养实验室、器皿的洗涤与灭菌
目的要求
通过实验，培养学生良好的卫生习惯、树立组织培养的无菌意识；掌握组织培养实验室器皿的洗涤与灭菌方法。
教学内容
1）地涤面、墙壁和工作台的灭菌
2）无菌室和培养室的灭菌
3）培养器皿的洗与灭菌
实训三、MS培养基母液的配制与保存
目的要求
通过MS培养基母液的配制与保存，掌握配制与保存培养基母液的基本技能。
教学内容
1、母液的配制
（1）大量元素母液的配制(母液ABCD)
（2）微量元素母液的配制(母液B)液。
（3）铁盐母液的配制(母液C)
（4）有机物母液的配制(母液D)
（5）植物生长调节物质母液的配制
2、母液的保存
（1）装瓶；（2）储藏
实验四、MS培养技的配制
目的要求
1.掌握分析天平、搅拌器、高压灭菌锅等各种常规仪器正确使用使用方法。
2.熟练掌握母液移取的操作技术，培养学生实际动手操作的能力
3.熟练掌握扎瓶口的操作技术。
教学内容
1. 各种母液的移取、混合。
2. 定容
3. 培养基的熬制
4. 培养基的分装
5. 培养瓶口的捆扎
6. 培养基的灭菌
实验五、 接种训练
目的要求：
掌握接种操作方法；基本掌握外植体的采集，处理方法。
教学内容：
外植体的采集；外植体的处理与灭菌；接种操作方法。
实验六、移栽驯化
目的要求：
掌握组培苗移栽驯化的方法与技术；基本掌握基质的配制方法。
教学内容：
基质的配制；消毒；出瓶、冲洗培养基；移栽；驯化。
实验七、茎段的培养
目的要求：
掌握茎段培养的方法；基本掌握茎段取材和处理方法。
教学内容：
培养基制作；茎段外植体的采集与处理；消毒；接种。
实验八、微茎尖剥离训练
目的要求：
掌握微茎尖剥离的方法与技巧；基本掌握外植体采集与预处理方法。
教学内容：
外植体的采集；预处理；解剖镜下剥离微茎尖。
实验九、花药的培养
目的要求：
掌握花药的分离与接种操作技术；基本掌握植物花药培养外置体的选择与处理方法。
教学内容：
培养基的制作；外植体的采集与预处理；花药分离与接种。
实验十、非洲菊的组织培养
目的要求：
掌握非洲菊的组织培养方法；基本掌握外植体的采集与预处理方法。
教学内容：
培养基的制作；外植体的采集与预处理；外植体的消毒与接种。
实验十一、蝴蝶兰的组织培养
目的要求：
掌握蝴蝶兰的组织培养方法；基本掌握外植体的采集与预处理方法。
教学内容：
外植体的采集；培养基的制作；外植体的消毒与接种。
实验十二、草莓微茎尖培养
目的要求：
掌握草莓无毒培养的操作方法；基本掌握外植体的采集与预处理方法。
教学内容：
外植体的采集与预处理；培养基的制作；微茎尖的剥制与接种方法。
实验十三、马铃薯微茎尖培养
目的要求：
掌握马铃薯无毒培养的方法；基本掌握外植体的采集与预处理方法。
教学内容：
培养基的制作；外植体的采集与预处理；微茎尖的剥制与接种方法。
二、实训教学内容
实训项目一、马铃薯的脱毒苗培养
教学目的
1、 学习掌握马铃薯脱毒的原理及快速繁育的生产规程
2、 掌握分离茎段的无菌操作转接技术
3、 掌握无根苗的生根培养技术。
4、 掌握组培苗的驯化移栽技术
5、 了解种薯的播种于生产管理方法。
教学内容：
1、无菌条件的建立
2、培养基的配制、分装、灭菌
3、无毒苗的扩繁接种、培养及其观察
4、试管苗的驯化与移栽
5、种薯的播种、生产管理、采收与贮藏
实训项目二、转基因杨树的组织培养
教学目的
1、 了解杨树快速繁育的生产规程
2、 掌握分离茎段的无菌操作转接技术
3、 掌握无根苗的生根培养技术。
4、 掌握组培苗的驯化移栽技术
5、 了解杨树生产管理规程。
教学内容：
1、无菌条件的建立
2、培养基的配制、分装、灭菌
3、转基因苗的扩繁接种、培养及其观察
4、试管苗的驯化与移栽
5、转基因种苗的生产管理。
实训项目三、非洲菊的组织培养
教学目的
1、 掌握非洲菊茎段的无菌操作转接技术
2、 重点掌握非洲菊无根苗的生根培养技术。
3、 重点掌握非洲菊组培苗的驯化移栽技术
4、 掌握非洲菊大棚栽培的生产管理技术。
教学内容
1、无菌条件的建立
2、培养基的配制、分装、灭菌
3、组培苗的扩繁接种、培养及其观察
4、试管苗的驯化与移栽
5、组培苗的工厂化管理与大棚栽培
实训项目四、蝴蝶兰的组织培养
教学目的
1、 掌握蝴蝶兰茎段的无菌操作转接技术
2、 重点掌握蝴蝶兰无根苗的生根培养技术。
3、 重点掌握蝴蝶兰组培苗的驯化移栽技术
4、掌握蝴蝶兰温室栽培的生产管理技术
教学内容
1、无菌条件的建立
2、蝴蝶兰培养基的配制、分装、灭菌
3、蝴蝶兰试管苗的扩繁接种、培养及其观察
4、蝴蝶兰试管苗的驯化与移栽
5、蝴蝶兰组培苗的温室栽培与管理。
三、实践实训教学考核方案
（一） 培养基的配制技术
1、母液的配制：
分析天平操作熟练；称量准确；溶剂选择得当；定容顺序合理、准确；无沉淀。以上满分100分，每项有误减20分。
2、移液、定容：
定性：一次性吸取，液体不能进到吸气球里；数量准确；移出时不滴不漏，桌面不湿；移进时吹净为度；仪器完好；以上满分20分，每项有误减4分。
定量：以完成八种母液需3min定为80分，每超过10秒减5分，每少用10秒加5分。将以上定性和定量分数相加，为本项总分数。
要求：8种母液依次移取，并要记住各母液名称及移取量。
3、培养基的熬制与分装：
蔗糖和琼脂称量准确，熬煮火适中，搅拌及时，琼脂充分熔化；定容准确；PH值调节正确；分装迅速，均匀且不沾瓶口，台面洁净；具协调组织能力；以上满分100分，每项有误减20分
4、扎瓶口：
定性：薄膜盖口居中，不偏不斜；扎线松紧合适；每项10分。
定量：以完成10瓶需60秒定为80 分，每多（少）用5秒减（加）5分或每少完成一个减5分。
5、灭菌：
熟练灭菌锅使用规程(60分)，装锅松紧适当(20分)，灭菌彻底(20分)。
总评：母液的配制×20%+移液、定容×20%+培养基的熬制与分装×20%+扎瓶口×20%+灭菌×20%
（二）植物器官培养的操作
1、外植体的选择：
选择健壮、无病外植体；包括适宜的选材时期、部位。(5分)
2、 外植体的预处理：
包括材料整理、冲洗要到位。(5分)
3、 外植体消毒：
包括消毒剂选择，消毒顺序、时间。达到消毒彻底((2.5分)，操作熟练(2.5分)，顺序合理(2.5分)，时间准确(2.5分)。
4、接种：
包括接种速度(10分)、操作方法、接种质量。达到无菌操作规范(以污染率为准) (5分)，动作熟练(2.5分)，切割准确(2.5分)，分布合理(2.5分)，台面洁净(2.5分)。器官培养接种速度具体评分标准见附表1。
附表1 接种速度考核标准（以接5瓶所用时间计算）
5、培养：
环境调控（包括温度、光照、湿度等）适宜，现象观察细(5分)，分析准确(5分)，处理及时(5分)；组培记录完整、及时、准确(5分)。
6、驯化移栽：
包括驯化基质选配，炼苗，出瓶清洗，移栽，环境调控。要求炼苗适度，培养基清洗干净，无损伤(5分)，基质选配合理(5分)，移栽要求整齐，深浅、松紧适宜，根系伸展(5分)，环境调控及时、有效(5分)，操作熟练(5分)。
7、具有较强的组织协调能力(10分)
总评：上述各项分值总和相加为总考核成绩。
第二篇：植物组织培养技术实验指导
T
植物细胞组织培养技术
实验指导书
中国计量学院生命科学学院
二零零六年七月
《植物细胞组织培养》实验指导
目 录
实验一、植物组织培养培养基母液的配制
实验二、植物组织培养的培养基配制
实验三、康乃馨的离体快繁
实验四、胡萝卜愈伤组织的建立
实验五、组织培养物的继代培养
实验一 组织培养基母液的配制
一、仪器及药品
冰箱、天平（0.0001g）
容量瓶: 1000 ml, 500 ml、250 ml、100 ml、25 ml
广口储液瓶：500 ml、250 ml、50 ml、25 ml
烧杯：1000 ml 、500 ml 、250 ml、100 ml 、50 ml
数十根玻璃搅棒、大药勺、小药勺或挖耳勺
标签纸、胶水、50%酒精、95%酒精、1 mol/L盐酸、1 mol/L NaOH
几种常用的培养基所需的大量元素、微量元素、有机物、激素、铁盐等药品
蒸馏水
二、方法和步骤：
按照培养基配方,把大量元素、微量元素、铁盐、有机物、植物激素分类,每一类中各种药品分别称量,如N6培养基各种母液的配制步骤如下：
大量元素母液：包括用量较大的几种化合物〈见N6培养基配方〉，按表中排列顺序,将每种药品的用量扩大10倍，分别称取，分别溶解，然后按照顺序混合在一起。如钙盐等易发生沉淀的药品不能混合，应单位定容，最后加上蒸馏水，定容至1升或500毫升。在定容时注意用蒸馏水洗净烧杯和玻璃搅棒以减少误差。定容后的溶液为大量元素母液，配制培养基时，每配1 L培养基需吸取该母液l00 ml或50 ml。
微量元素母液：因用量少，为了称量精确和方便,常配成 100倍或1000倍的母液，即每种药品扩大l00倍或者l000倍。逐个溶解，混合在一起成为微量元素母液，每配1 L N6培养基需吸取该母液10 ml或者1 ml。
铁盐：在N6培养基中需要单独配制，它是由硫酸亚铁（FeSO4?7H2O）2.78 g和乙二氨四乙酸二钠（Na2-EDTA）3.73 g，分别溶解，混合后，用酒精灯加热半小时以上，冷却后定容至1 L。冰箱过夜贮藏无结晶析出，否则重新配制。每配l升N6培养基需加该铁盐母液5 ml。
有机物质：主要指氨基酸，维生素类物质。它们大都是扩大1000倍，分别称量，分别定容和储存，配制培养基时按需要的量加入。
植物激素：常用的有生长素类如：2,4-D、 萘乙酸（NAA）、吲哚乙酸（IAA）、吲哚丁酸（IBA）；细胞分裂素类：激动素（KT）、6-苄基氨基嘌呤（6-BA）、玉米素（ZT）。配制时需要单个称量，根据需要可分别用酸、碱或酒精等不同的溶剂溶解后 ,再用蒸馏水配制成所需的浓度，一般为每ml含 0.1-2 mg，配制培养基时按所需要的量分别加入，本实验中的2,4-D和6-BA均配成1 mg/ml的母液。
在配制吲哚乙酸（IAA）母液时，先用几滴95%酒精溶解完全后，加蒸馏水定容，否则会发生沉淀。而配制6-BA母液时，要用少量的1 mol/L NaOH溶解；而配制2,4-D时，可先用少量的95%酒精溶解。
表1 N6 朱至清(1975)培养基配方
各种母液配制好后，要贴好标签，注明母液的名称，配制1 L培养基需要的吸取量、母液配制的日期，然后放入冰箱中储存。一般无机物质的母液在冰箱中可保存半年以上，有机物质的母液保存时间在半年以内，但若发现有沉淀或霉变,应立即需重新配制。
三、注意事项
1. 如药品所带结晶水不同，应进行换算。
2. 因常用的MS培养基中硝酸铵(NH4NO3)属于公安部门严格限制管理的药品，所以本实验采用N6培养基替代MS培养基。
实验二 培养基的配制
一、仪器设备及试剂
电炉
天平（0.0001 g）
高压灭菌锅
量筒：l0 ml、20 ml、100 ml、500 ml
烧杯：1000 ml、500 ml、250 ml
移液管：1 ml、2 ml、 5 ml
吸管若干、记号笔
三角瓶或试管、试管架
锡铂纸、玻璃棒
配制好的各种母液，如大量元素母液、微量元素母液、铁盐、有机物、生长调节剂等，个别生长调节剂要随配随用。
蒸馏水、pH试纸
蔗糖、琼脂 等
1 mol/L NaOH 溶液、1 mol/L HCl溶液 。
二、方法和步骤
1 量取所配培养基总体积的2/3体积的蒸馏水，如要配l升培养基, 先量取约700 ml体积的水。
2 根据培养基配方， 用量筒量取所需要的各种元素的母液。
吸取母液时，注意应先将几种母液按顺序排好，不要弄错以免使培养基中药品成分发生改变。在培养不同的外植体时，应加入不同的激素，如本实验中培养康乃馨侧芽或茎段时就加入1ml的1 mg/ml的6-BA；而另一个实验胡萝卜愈伤组织培养中应加入2ml的1 mg/ml的2,4-D。加入一种母液后应先搅拌均匀，避免因不均而使局部浓度过高而引起沉淀，琼脂可于加入蔗糖调节完pH值后再加入，此时应注意搅拌，以免琼脂或蔗糖沉淀于烧杯底而炭化。加热至沸腾片断，以使琼脂充分溶解，检查时可注意烧杯内溶液是否透明。
3 调节培养基的pH值，用pH计或pH试纸测定
培养基的pH按照培养材料的要求分别用 1 mol/L NaOH溶液、1 mol/L HCl溶液来调节所配制培养基的pH值，一般培养基的pH值约为5.8，培养的材料不同，对培养基的pH值要求也不同。
4 分装 将配制好的培养基分别装在事先洗净的三角瓶，用锡铂纸封口，注明标签，然后和用牛皮纸或报纸包好的培养皿及用三角瓶装好的蒸馏水一道进行高压灭菌。
5 培养基的灭菌 一般用手提式医用高压锅来灭菌（方法略），本实验采用全自动高压灭菌锅。
6 培养基的保存 消毒过的培养基通常放在接种室或培养室中保存，一般 应在消毒后的两周内用完，最好不要超过一个月。
三、注意事项
激素应在调节pH之前加入，因为有些激素是用酸或碱溶解的，在调节pH好之后加入会改变pH值。pH过酸或过碱对培养基均是不利的，会导致过软或过硬的结果，从而影响培养质量。
在本次实验中将下次实验所需的其它材料一同灭菌处理。
实验三 康乃馨的离体快繁
一、仪器设备和试剂
超净工作台、带有吸水纸的成套的培养皿，无菌水
培养基 N6+1 mg/L 6-BA
剪刀、枪型镊子
量筒、酒精灯、滤纸、蒸馏水、小刷子
95%乙醇、70%酒精、70%酒精棉球、0.2%升汞、甲醛、高锰酸钾、来苏尔
纱布、棉塞、牛皮纸、才培纯、肥皂、酒精喷壶
植物的嫩茎、侧芽、茎尖、叶片、花、愈伤组织上的不定芽、胚状体、试管苗等
二、实验材料 康乃馨枝条
三、方法和步骤
1 外植体灭菌 取从市场上购买的康乃馨枝条，去掉大的叶片，剪取带腋芽的节结，用肥皂（洗洁精）清洗表面，再用自来水冲洗 30-60分钟，然后在无菌室（超净工作台）内用70%酒精浸没20-40秒钟（根据材料的木质化程度掌握具体的浸没时间。用0.2% 的升汞溶液浸泡10-15分钟，再用无菌水冲洗3-4次，放入已灭菌的培养皿中的滤纸上待用。
2 接种 先进行无菌室内消毒，用紫外灯照射30-45分钟，地面用低浓度的来苏尔溶液消毒，紫外灯关闭约20分钟后方可进去工作。
超净工作台消毒 开启无菌风开关，让无菌风吹上30-45分钟后方可工作。并用70% 的酒精棉球擦净工作台。
接种时先点燃酒精灯，镊子和剪刀都要先浸泡在70%的酒精溶液中。用酒精灯上灼烧好冷却后的镊子、剪刀取出一个侧芽或小段茎，迅速打开三角瓶口，将材料才插入瓶内，注意材料上下端的极性，不能倒插。在酒精灯边塞回锡箔纸，用记号笔在瓶体上写明日期和材料。
3 培养条件： 25℃光照13小时/天 光强1000 Lux
4 继代培养（见下一个实验）
5 诱导生根：用低浓度的吲哚乙酸或者萘乙酸或无激素的N6培养基诱导生根
6 试管苗移栽〈参见有关其它实验〉
实验四 胡萝卜愈伤组织的建立
一、 材料和设备
超净工作台或者无菌接种室
培养基 N6+2 mg/L 2,4-D
带有吸水纸的成套的培养皿，无菌水
解剖刀、枪型镊子、刀片
无病虫的胡萝卜直根数十个
消毒剂 0.2%的升汞溶液
70%酒精、95%酒精及70%的酒精棉球
l000毫升的玻璃烧杯数个、酒精灯、火柴、记号笔、小刷子（可用一次性牙刷）
二、实验材料 新鲜胡萝卜、胡萝卜愈伤组织
三、实验步骤'
1 选择无伤、无病、形状较规则的胡萝卜，用小刷子在流动的自来水下洗刷胡萝卜，除净表面所有的泥屑。可以根据实验的时期，选用其它的实验材料。
2 将胡萝卜切成大约 40 mm厚的片段,放入100或500 ml的烧杯中，倒入消毒液，将植物材料覆盖、浸泡10-30 min。在灭菌过程中，在每个材料上做好标记，并对应地放在预接种的培养基边上。接种后在培养瓶上标明培养物名称和培养日期。
3 在超净工作台上，倒掉消毒液，用无菌水冲洗3-5次，以便去除残留的消毒液。
4 取消毒过的胡萝卜放入已灭菌的带有滤纸的培养皿中，用无菌解剖刀从两端各切去10毫米，再将留下的胡萝卜直根切成一系列一毫米厚的横切片。取其中的一片转到另一个已灭菌的带有吸水纸的培养皿中，再将每一片切成小块，使其每个小块上均包含木质部、形成层和韧皮部，外植体的大小要尽量一致。
5 接种 取下培养瓶的塞子（或锡铂纸），用火灼烧瓶口2 cm处，手持培养瓶呈45º角，用消毒镊子把4-8块外植体转到琼脂培养基的表面，注意把靠近根尖的一面接触培养基。然后立即将烧过的封口棉塞或锡铂纸封住瓶口。每两次转移之间都要用酒精灯灼烧镊子，防止带菌。
6 培养 接种好的外植体在25℃的培养箱中，黑暗条件下培养四周左右就会形成一块较大的愈伤组织。
实验五 组织培养物的继代培养
一、材料和设备
材料 从培养4-6周的外植体上长出的愈伤组织、丛生芽或胚状体
超净工作台
培养基 N6+0.5 mg/L 2,4-D N6+2 mg/L 6-BA（也可以自已设计）
三角瓶、带有吸水纸的成套的培养皿、镊子、解剖刀
70%酒精、95%酒精及70%的酒精棉球
酒精灯、火柴、记号笔、酒精喷壶
二、方法步骤
1 取材 在无菌室的超净工作台内，每次取一瓶培养物，灼烧培养瓶口约20 毫米处，用灼烧冷却后的镊子和解剖刀，取出外植体或者愈伤组织放在无菌的培养皿中。每个培养皿中约放4-6个外植体或者愈伤组织。把每块愈伤组织分成两、三个不小于5 mm见方的小块。外植体下面向着中心的细胞常呈坏死状,不适宜作继代培养。这些坏死的部分应当与正常的部分分离并弃去。每次操作后要去掉用过的吸水纸并重新盖上培养皿的盖子。
2 继代转接 将正在发育的外植体或愈伤组织转移到新鲜培养基上，接种方法同前。转接后在培养瓶上写明培养物、培养基、日期。长期培养的胡萝卜组织会产生大块愈伤组织。正在发育的愈伤组织作第一次继代培养所用的实验程序与以后每隔四周转移一次建成愈伤组织系的继代培养程序相同。
3 实验记录 将实验记录抄录于笔记本上，注明实验开始的日期、持续期、培养物的数目、污染数目和所作的不同处理。在四星期内，每隔一星期用肉眼观察培养物，记录培养物形态的变化,培养物的生长状态、鲜重变化等，必要时作拍照记录。
思考题及作业：
1 愈伤组织是从刚分离的外植体的哪些区域起源的？
2 所有的外植体的生长速率都相同吗？
3 根据每组的实验结果撰写一份完整的实验论文形式的实验报告，实验报告将作为平时成绩记入总成绩。