免疫学试验计划
实验二 沉淀试验——双向免疫扩散试验
一、目的要求:
1、掌握双向免疫扩散试验的原理和用途;
2、熟悉双向免疫扩散试验的操作方法。
二、实验原理:
1、沉淀反应:可溶性抗原(如血清、细菌的外毒素、内毒素、菌体裂解液、病毒、组织浸出液等)与相应的抗体相遇,当二者比例适当,在一定温度、pH并有电解质存在下,就可能形成肉眼可见的白色沉淀,称为沉淀反应。根据抗原与抗体的不同反应与其它因素,沉淀反应分为:凝胶内沉淀反应(单向琼脂扩散、双向琼脂扩散等)、免疫电泳技术(对流免疫电泳、火箭免疫电泳、免疫琼脂扩散电泳等)、液相内沉淀反应(环状沉淀反应、免疫浊度试验、絮状沉淀反应等)。单向沉淀、双向沉淀。
2、抗原抗体反应是指抗原与相应抗体之间所发生的特异性结合反应. 它既可发生在体内,也可发生在体外。 体外的抗原抗体反应表现为沉淀、凝集、细胞溶解、补体结合、中和反应等反应现象。沉淀反应(precipitation)是可溶性抗原与相应抗体在电解质存在的条件下发生特异性结合所出现的沉淀现象。如图所示:
3、影响沉淀反应的主要因素:(1).抗原(Ag)、抗体(Ab)反应的浓度、比例(2).电解质(3).温度(4).酸碱度
4、双向免疫扩散试验:将可溶性抗原和抗体分别加到含适量电解质的琼脂板上相应的小孔中,使两者各自向四周自由扩散,若抗原与抗体相对应,两者相遇即发生特异性结合,并在比例合适处发生沉淀,此沉淀物因颗粒较大而不扩散,故形成沉淀带。沉淀物形成的主要原因是因为抗原与抗体分子表面的疏水基团相互接近而有效的排出它们之间的水分。
利用琼脂凝胶作为扩散介质是因为一定浓度的琼脂凝胶,其内部为多孔网状。而且孔径很大,可以允许大分子物质(分子量自十几万到几百万以上)自由通过。因为大多数抗原和抗体的分子量都在20万以上,所以它们在琼脂凝胶中几乎可以自由扩散。而且琼脂凝胶又具有良好的化学稳定性、含水量大、透明度好、来源方便、处理容易等优点,因此是免疫沉淀检测技术中最理想的扩散介质。
5、抗原抗体反应的特点:1.特异性 2.比例性 3.可逆性
6、带现象:Ag 与 Ab 比例不适而不出现可见反应。前带(prozone):抗体过量时;后带:(postzone)抗原过量时。
7、沉淀反应的抗原可以是多糖、类脂、蛋白质或它们的结合物等。与相应的抗体相比,抗原的分子量小,单位体积内所含抗原量多,具有较大的反应面积。因此,在作定量沉淀试验时,为了不使抗原过剩而生成不可见的可溶性复合物,通常应稀释抗原。沉淀反应的血清稀释倍数在1::6内即可得效价。
8、每一对应抗原和抗体可出现一条沉淀线, 出现沉淀带的抗体最大稀释倍数即为抗体效价。 若同时含有若干对抗原抗体系统,因其扩散速度的不同,可在琼脂中出现多条沉淀线。且根据沉淀线融合情况,还可鉴定两种抗原是完全相同还是部分相同。所以,可用此法来分析和鉴定标本中多种抗原或抗体成份,并用以测定抗原或抗体的效价。
9、参与沉淀试验的抗原称沉淀原,抗体称为沉淀素。
三、应用:
沉淀试验广泛应用于病原微生物的诊断(鸡马立克氏病、法氏囊病、炭疽杆菌抗原),各种免疫血清效价和毒素、抗毒素的测定;检测未知抗原或抗体、抗原性质分析、抗体效价滴定、抗原或抗体纯度鉴定等方面。
四、材料:
1、耗材:平皿1个、100ml量筒1个、吸管、1ml移液管1个、枪头若干、300ml锥形瓶1个、记号笔1支、标签纸若干、洗耳球1个、试管7个;
2、试剂:琼脂粉、8.5% 高渗盐水、待测血清、标准血清、猪口蹄疫抗原(本校实验室制作)、25ug/ml溴酚蓝;
3、仪器:微波炉、3mm打孔器、20ul移液枪、湿盒、电子天平、恒温恒湿培养箱(型号:HWS-27,厂家:宁波市科技园区新江南仪器有限公司)。
五、实验方法:
1、琼脂板的制备:1 克琼脂粉溶于 100ml 8.5% 高渗盐水装入锥形瓶中,加热煮沸至充分溶解,加25ug/ml溴酚蓝0.4ml。待温度降至 55℃左右时, 用吸管吸取6ml左右趁热浇于平皿上,制成琼脂板(滴加时要小心,勿溢出并避免产生气泡)。
2、打孔:在琼脂板上打孔(中间一个、周围七个),孔径为 3mm,中间空和周围孔间的距离大约为5mm,并用枪头挑去孔内琼脂。注意周围的孔距离平皿边缘距离要大于3mm.
3、加样:将待检血清作倍比稀释,即 1:1、1:2、1:4、1:8、1:16,分别加至1—5孔中,6孔加标清,7孔加生理盐水作对照,中间加猪口蹄疫抗原。每孔各加15ul左右,注意不要溢出。
4、作用:将琼脂板水平放置湿盒中,在 37℃ 恒温箱中作用 24h。观察结果。
5、预期结果:抗原抗体在凝胶内扩散,在两孔之间比例最适合的位置出现沉淀带,出现沉淀带的抗体最大稀释倍数即抗体效价。
六、实验结果判定:
1、观察孔间沉淀线的数目及特征。本试验1 至5孔(1:1、1:2、1:4、1:8、1:16) 的待测血清与中央孔(猪口蹄疫抗原)之间是否可出现清晰的乳白色沉淀线。6孔是高渗盐水,为阴性对照,与中间空间无白色沉淀线。
2、相应抗原抗体所形成的沉淀线,如二者浓度相当,沉淀线在孔中央,二者浓度不当时,则沉淀线偏向浓度低的一侧 。
七、注意事项:
1、切勿剧烈震荡未凝固的琼脂板,避免气泡出现。
2、打孔加样时,不要将琼脂划破,以免影响沉淀线的形成。孔间距要相等。
3、加样时不同浓度抗体和抗原不要混淆,影响试验结果。
4、反应时间要适宜。若时间过长,沉淀线可解离而导致假阴性、不出现或不清楚。
5、溴酚蓝起对照作用,便于观察。但应注意其加入量。
6、准备材料时多准备一组材料,避免不够用。
生物科学1102班 小组成员:
组长 xxx
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试验具体操作 xxx
第二篇:沉淀反应的应用第2课时
《选修四第三章第四节 沉淀反应的应用》导学案(第2课时)
高二 班 第 组 姓名 组内评价 教师评价
【课标要求】
1、掌握沉淀转化的条件及应用。
2、了解溶度积的简单计算。
【难点重点】
1、沉淀转化的条件及应用 2、溶度积的简单计算
【新课导学】
沉淀转化的条件及应用
1.沉淀的生成
(1)应用:
(2)方法:
① 例:
② 例:
2.沉淀的溶解
分析:如:CaCO3、FeS、Al(OH)3、Cu(OH)2溶于盐酸中。
原理:
【交流、讨论】若使氢氧化镁沉淀溶解,可以采取什么方法?所依据的原理是什么?
探究实验三:
设计使氢氧化镁沉淀溶解可行实验方案。完成实验,记录现象,写出反应的化学方程式。
可供选择试剂:蒸馏水、盐酸、饱和NH4Cl溶液、NaOH溶液、NaCl溶液、Na2CO3溶液、 FeCl3溶液。
【思考与交流】应用平衡移动原理分析、解释实验中发生的反应,并尝试找出使沉淀溶解的规律。
3.沉淀的转化
【总结】沉淀的生成、溶解、转化实质上都是沉淀溶解平衡的移动的过程,其基本依据主要有:
①浓度:加水,平衡向 方向移动。 ②温度:升温,多数平衡向 方向移动。
③加入相同离子,平衡向 方向移动。
④加入可与体系中某些离子反应生成更难溶或更难电离的物质的离子,使平衡向 的方向移动。
【学以致用】
1.钟乳石的形成:
石灰岩里不溶性的碳酸钙与水及二氧化碳反应能转化为微溶性的碳酸氢钙。
溶有碳酸氢钙的水从溶洞顶向溶洞底滴落时,水分蒸发,二氧化碳压强减小以及温度的变化都会使二氧化碳溶解度减小而析出碳酸钙沉淀。这些沉淀经过千百万年的积聚,渐渐形成了钟乳石、石笋等。
2.龋齿的形成原因及防治方法
①牙齿表面由一层硬的组成为Ca5(PO4)3OH的难溶物质保护着,它在唾液中存在下列平衡:
Ca5(PO4)3OH(S) 5Ca2+(aq) +3PO43- (aq) +OH-(aq)
进食后,细菌和酶作用于食物,产生有机酸,这时牙齿就会受到腐蚀,其原因是:
。
②已知Ca5(PO4)3F的溶解度比Ca5(PO4)3OH更小,牙膏里的氟离子会与Ca5(PO4)3OH反应。请用离子方程式表示使用含氟牙膏防止龋齿的原因:
练习1. 在一定温度下,向AgI的饱和溶液中:(填“增大”、“减小”或“不变”)
(1)若加入AgNO3固体,c(I-) 。
(2)若加入更多的AgI固体,则c(Ag+) 。
(3)若加入固体AgBr,c(I-) 。
练习2. 已知常温下FeS的Ksp=6.25×10-18。
(1)常温下FeS的溶解度为多少g?(设饱和溶液的密度为1g?cm-3)
(2)在常温下将过量FeS投入到0.10mol?L-1的Na2S溶液中,则平衡时c(Fe2+)为多少?